專利名稱：早期預測術后認知功能障礙的MicroRNA 572試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發明涉及醫學生物檢測技術領域，是一種早期預測術后認知功能障礙的MicroRNA-572試劑盒及檢測方法。
背景技術：
術后認知功能障礙(Post-operativeCognitive Dysfunction, POCD)是老年患者術后常見的并發癥之一(參見文獻Baranov, D. , et al. Consensusstatement:First International Workshop on Anesthetics and Alzheimer ' sdisease. Anesth Analg, 2009，108(5):1627-1630. Rohan D, Buggy DJ,Crowley S,LingFK, Gallagher H, Regan C, Moriarty DC. Increased incidence of postoperative cognitive dysfunction 24 hr after minor surgery in the elderly. Can JAnaesth. 2005; 52 (2) : 137-142.)。據術后認知功能障礙國際性多中心研究(ISPOCD)報道，60歲以上行非心臟手術的全麻患者，術后I周PO⑶的發生率為25. 8% (參見文獻Rohan D,Buggy DJ, Crowley S，Ling FK, Gallagher H, Regan C, Moriarty DC. Increasedincidence of postoperative cognitive dysfunction 24 hr after minor surgery inthe elderly. Can J Anaesth. 2005; 52 (2) : 137-142)。據最近文獻報道，老年患者行非心臟手術術后6周的PO⑶發生率為54. 3%，術后一年的發生率仍高達46. 1%(參見文獻Monk，T.G.,et al.Predictors of cognitive dysfunction after major noncardiac surgery.Anesthesiology, 2008, 108 (I) : 18-30)。POCD最常表現為精神錯亂、焦慮、人格及記憶受損，少數病人甚至發生永久性認知功能障礙，發展為癡呆。術后認知功能障礙不僅延長患者住院時間、增加治療費用，而且增加患者的死亡率(Steinmetz, J.，et al. Long-termconsequences of postoperative cognitive dysfunction. Anesthesiology, 2009, 110 (3):548-555),為家庭和社會帶來沉重的負擔。由于PO⑶多見老年術后患者，因此推測與老年認知障礙可能有類似的發生機制，然而認知障礙的研究迄今沒有突破。迄今為止，并沒有能夠直接反應POCD的生物學指標。因此目前POCD的研究主要針對POCD的流行病學研究和誘發因素研究，但較少研究探討其發生機制。由于目前POCD的診斷主要依靠臨床表現，而缺乏特異性實驗室指標，因此為臨床工作帶來很多不便，增加了誤診與漏診。特別是對于POCD術前的預測更缺乏相應的指標，因此，從預防和治療角度，急需尋找較明確的POCD生物學標記物。microRNA(miRNA)是一類長度約21 25堿基的非編碼蛋白質單鏈小分子RNA，廣泛存在于多細胞生物和病毒體內，主要通過核酸序列互補匹配結合到特定的靶mRNA上，抑制靶mRNA翻譯過程或降解靶mRNA，是一種起負調控作用的分子。目前越來越多的研究顯示，miRNA廣泛參與了生物體多種生理過程，且相關研究報道也表明其表達及功能失調可能導致腫瘤發生、白血病以及病毒感染等多種病理現象。對于miRNA能否作為一種實驗室無創性檢測手段，目前更多的研究集中在對于癌癥早期診斷方面。這一新興研究領域僅僅在測定血清標志物上開始得到應用。已有實驗證實，miRNA在血漿和血清中非常穩定，它們被有效保護以免接觸RNases，在嚴酷環境條件下仍能保持穩定。因此，它們的穩定性使得其實際值與在病人身上得到的測試值吻合得很好。目前,對于miRNA的早期預測功能主要集中在腫瘤方面，比如Charles H. Lawrie等人證實彌漫性B細胞淋巴瘤病人的血清hsa-mir-21水平很高，后者與不復發存活率密切相關(參見文獻 Lawrie CH, Gal S，Dunlop HM, et al. Detection of elevated levelsof tumourassociated microRNAs in serum of patients with diffuse large B—celllymphoma. Br J Haematol 2008;141:672-675)。Chen X 等人在細胞研究雜志上的報道對肺癌、結腸癌和糖尿病的患者血清miRNAs水平進行了分析，確定這些疾病都有其特異性的血清 miRNA 表型(參見文獻 Chen X, Ba Y. Ma L, et al. Characterization of miRNAs inserum:a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases.Cell Res 2008;18:997-1006)。
至今未見miRNA-572作為PO⑶生物學標記物的報道，也未見一種用于檢測血漿或血清中的hsa-mir-572含量，來早期預測術后認知功能障礙的試劑盒及其檢測方法的報道。
發明內容
本發明的目的在于提供一種早期預測術后認知功能障礙的MiCT0RNA 572試劑盒，以及檢測方法。本發明人為了尋找參與PO⑶相關的血漿miRNA，利用miRNA芯片技術篩選了與PO⑶相關的miRNA。結果發現與患者術前相比miRNA. 572的表達具有顯著差異。另有研究提不 miRNA-134 與記憶相關(參見文獻 Gao J, Wang WY, Mao Yff, Graff J, Guan JS, PanL, Mak G, Kim D,Su SC, Tsai LH. A novel pathway regulates memory and plasticityvia SIRTl and miR-134. Nature. 2010，466 (7310) : 1105-1109.)。這些研究提示我們，miRNA與認知障礙有一定關系，提示血漿miRNA可能成為早期特異性潛在標記物。臨床上PO⑶有相對明確的發病時間，為了尋找參與PO⑶相關的血漿miRNA，我們利用miRNA芯片技術篩選了與PO⑶相關的miRNA。結果發現與患者術前相比，PO⑶患者血漿中miRNA-572的表達明顯降低。本發明人認為通過反轉錄聚合酶鏈式反應(PT-PCR)為基礎技術，通過檢測PO⑶患者中血漿miRNA-572的表達來實現早期診斷PO⑶是完全可行的。本發明的第一方面，提供了 MiCT0RNA 572在制備早期預測術后認知功能障礙的試劑盒中的應用。本發明的第二方面，提供了一種早期預測術后認知功能障礙的hsa-mir-572檢測試劑盒，是通過檢測血漿或血清中的hsa-mir-572分子含量的變化，監測或早期預測術后認知功能障礙的可能或進程，以便盡早采取措施或藥物治療，防止術后認知功能障礙發生或發展，進而防止轉變成癡呆。本發明通過對術前認知功能正常患者血漿中hsa-mir-572的含量比較；術后未發生認知功能障礙者與術后認知功能障礙患者血漿中hsa-mir-572的含量比較；發現術后認知功能障礙患者血衆中hsa-mir-572含量明顯低于術前認知功能正常的患者,約低于術前認知功能正常的患者群的5倍左右，這個結果顯示了 hsa-mir-52的含量變化情況，可以作為術后認知功能的早期預測手段。本發明提供了一種早期預測術后認知功能障礙的hsa-mir-572檢測試劑盒，該試劑盒由反轉錄系統、引物系統和擴增系統組成，其中的引物系統由特異性的hsa-mir-572反轉錄引物及Real-time PCR的上、下游引物組成，hsanir-572反轉錄引物為GTCGTATCCAGTGCGAACTGTGGCGATCGGTACGGGCTACACTCGGCAATTGCACTGGATACGACTGGGCC (SEQ ID N0:1)；Real-time PCR 上游引物為GTCCGCTCGGC GGTGGCCCA (SEQ ID N0:2)；Real-time PCR 下游引物為AGTGCGAACTGTGGCGAT (SEQ ID N0:3)。本發明試劑盒的引物是根據已知的生物信息學查得hsa-mir-572的成熟體序列而設計的(詳見http://microrna. sanger. ac. uk/sequences/),包括其特異性的反轉錄引物、Real-time PCR的上下游引物均通過Primer 5引物設計軟件設計。hsa-mir-572的成熟體序列⑶CCGCUCGGCGGUGGCCCA (SEQ ID NO:4)上述試劑盒的反轉錄系統由反轉錄酶、反轉錄體系緩沖液和R N A酶抑制劑組成，擴增系統由SYBR Premix Ex Taq 試劑組成。本發明的試劑盒，具體組成如下A) hsa-mir-572 反轉錄引物(SEQ ID N0:1)，1 管，濃度10 μ M，100 μ I/管;B) Real-time PCR 上游引物(SEQ ID N0:2)，l 管，濃度10 μ M，100 μ I/管;Real-time PCR 下游引物(SEQ ID N0:3)，l 管，濃度10 μ M，100 μ I/管；C) Trizol reagent (總 RNA 提取試劑)，I 管，2000 μ I/ 管;D)氯仿，I 管，500 μ I/管；Ε)無水乙醇，I管，7ml/管；F) DEPC H20 (經焦炭酸乙二酯處理的純水)，I管，1000 μ I/管G) dd H20 (雙蒸水)，I 管，2000 μ I/ 管。使用本發明試劑盒監測或早期預測術后認知功能障礙，首先，將若干已知的術前認知功能正常病人編組，用本發明試劑盒分別檢測術前認知功能正常病人、術后認知功能正常、術后認知功能障礙血漿中hsa-mir-572含量，以此作為對照的標準數據。再用相同的方法檢測未知患者血清中hsa-mir-572含量,對照上述標準數據，即可初步確定該患者是否為術前認知功能正常病人、術后認知功能正常患者、術后認知功能障礙患者，以便作進一步檢查確診。本發明的第三方面，提供了上述早期預測術后認知功能障礙的hsa-mir-572檢測試劑盒的檢測方法，具體步驟如下按常規抽血取血清或血漿，用總RNA提取試劑處理血清或血漿，加氯仿離心后取上層水相，并富集血清或血衆中的小RNA ;由反轉錄系統反轉錄hsa-mir-572成cDNA ;用擴增系統進行Real-time PCR擴增，測定hsa-mir-572含量。
圖I :認知功能正常患者手術前后血漿中hsa-mir-572的含量檢測；圖2 :術后認知功能障礙患者手術如后血衆中hsa-mir-572的差異表達檢測；
具體實施例方式現結合實施例和附圖，對本發明作進一步描述，但本發明的實施并不僅限于此。實施例I :制備本發明的試劑盒(供一人用)本發明的試劑盒組成如下I.反轉錄引物I管，100 μ I/管濃度10 μ M反轉錄引物為GTCGTATCCAGTGCGAACTGTGGCGATCGGTACGGGCTACACTCGGCAATTGCACTGGATACGACTGGGCC2. Real-time PCR 的上、下游引物各 I 管，100 μ I/管濃度10 μ M ;
上游引物為GTCCGCTCGGCGGTGGCCCA下游引物為AGTGCGAACTGTGGCGAT3.Trizol reagent I 管 2000 μ I/ 管4.氯仿I 管 500 μ I/ 管5.無水乙醇I管 7ml/管6. DEPC H20I 管 1000 μ I/ 管7. dd H2OI 管 2000 μ I/ 管。本發明根據已知的生物信息學查得hsa-mir-572的成熟體序列⑶CCG⑶CGGCGGUGGCCCA，其特異性的反轉錄引物、Real-time PCR的上下游引物均通過Primer 5引物設計軟件設計，由美國invitrogen公司負責引物合成。設計的引物序列如下(I)反轉錄引物
GTCGTATCCAGTGCGAACTGTGGCGATCGGTACGGGCTACACTCGGCAATTGCACTGGATACGACTGGGCC (SEQ ID NO:I)(2) Real-time PCR 的上下游引物上游引物GTCCGCTCGGCGGTGGCCCA(SEQ ID NO:2)下游引物AGTGCGAACTGTGGCGAT(SEQ ID NO:3)制備包括下列組成成分的試劑盒總RNA提取試劑、氯仿、無水乙醇、特異性hsa-mir-572反轉錄引物(100 μ I/管濃度10 μ Μ)、特異性的hsa-mir-572上游引物(100 μ I/管濃度10 μ Μ)、下游引物(100 μ I/管濃度:10 μ M)、DEPCH2O (1000 μ I/管)、ddH2O (2000 μ I/ 管)DEPC H2O的配置用購買的DEPC(焦碳酸二乙酯)，純度>99%，密度為I. 12g/ml，配置DEPC H2O0 IOOmlMiliQ純水中加O. lmlDEPC，放在IOOml干烤過的容量瓶中靜置4小時后高壓滅菌，制成千分之一濃度的DEPC H2O,經檢測不含RNase、DNase和proteinase。用來溶解合成的反轉錄引物，并作為反轉錄時的稀釋用水。dd H2O的配置MiliQ純水經高壓滅菌后，配置成Real-time PCR用的dd H2O0特異性hsa-mir-572反轉錄引物通過Primer 5引物設計軟件設計，由美國invitrogen公司負責引物合成，純度為PAGE級，合成后的引物用DEPC H2O溶解，終濃度為10 μ Μ。特異性的hsa-mir-572上游引物通過Primer 5引物設計軟件設計，由美國invitrogen公司負責引物合成，純度為PAGE級，合成后的引物用dd H2O溶解，終濃度為10 μ Μ。實施例2 :本發明的試劑盒的檢測一、采集血漿樣本及樣本準備由于血漿具有取材方便、無創傷性、連續檢測的優點，因此從血漿中檢測術后認知功能障礙生物標志物可以將預測術后認知功能障礙的轉歸提高到一個新的水平，從而達到早預防、早治療的目的。
血漿樣本在上海長海醫院住院部部采集16例術前認知功能正常患者行骨科膝、髖關節置換，10例術后認知功能正常，6例術后認知功能障礙患者。根據美國精神病學協會診斷與統計指南(Diagnostic and Statistical Manual, DSM-IV)的定義，即無其他方面敘述的認知障礙(ICD :International Classification ofDiseases296. 5)。有神經精神系統疾病史；未經控制的高血壓、糖尿病、腫瘤、血液病史；有長期應用精神活性藥物或酒精史；心、肺、肝、腎功能不全；有認知障礙病史或術前MMSE評分異常的患者被排除。所有患者均無血液、腎臟、腫瘤等可能影響血清水平的疾病。入院后均經B超或CT檢查排除癌癥。樣品收集收集約4ml病人的外周血放入含360 μ I EDTA的抗凝管中，靜置約I小時。二、采集血漿樣本的處理及提取其中的小RNA (I)血漿樣本處理采集的外周血樣品4°C離心兩次，首先1600g離心lOmin，取上清，加入新的離心管中，再12000g離心lOmin，取上清，加入新離心管中。加Trizolreagent (Invitrogen 公司購買)，使 Trizol reagent :血衆=I :0.8 左右。(2)小RNA提取添加過Trizol reagent的樣本搖晃混勻，放置冰上15min, IOOOg,4°C離心lOmin，取上清，分別放入經DEPC處理過的2ml EP管中。每管加入200 μ I氯仿，搖晃混勻，放置冰上IOmin左右，12000g、4°C離心15min，取上層水相。下面的步驟按照Applied Biosystems 公司購買的 mirVana miRNA Isolation Kit 中提取小 RNA 的步驟進行。使用Eppendorf紫外分光光度儀測定RNA的A260值和A260/A280的比值(I. 8-2. 2)，以評估其濃度和質量。符合定量檢測要求的樣本進行下一步反應。三、miRNA的實時定量I.反轉錄成 hsa-mir-572 的 cDNA取富集液50ng為模板，以設計的特異性hsa-mir-572反轉錄引物進行反轉錄。按照 5 XPrime Scrip Buffer (for Real Time) 4 μ I、Prime S cript RT Enzyme Mix0. 5 μ KPrimeScript RT reagent Kit) (TaKaRa 公司)、hsa-mir-122 反轉錄引物 0. 5 μ I、富集的小RNA50ng、DEPC H20 (補充H20使總體積達到20 μ I)進行反轉錄。以上步驟所用的tip頭、EP管均經過DEPC水處理后高壓滅菌。2. Real-time PCR 定量 miRNA米用TaKaRa 公司的 SYBR Premix Ex Taq 試劑和美國 Applied Biosystems 公司的Step Plus One實時定量PCR儀，按照下述體系進行PCR反應Premix Ex Taqui ( 2 χ )10 μ
上游引物(10 μΜ)0.4 μ (終濃度0.2 μΜ)
下游引物(10 μΜ)0.4 μ1(終濃度0.2 μΜ)
ROX Reference Dye (50χ)0.4 μ!
反轉錄產物I μ
雙蒸水7.8 μ
總體系20μ1經過預實驗確立了 hsa-mir-572引物的合適退火溫度,最終確定以下條件
權利要求
1.MicroRNA 572在制備早期預測術后認知功能障礙的試劑盒中的應用。
2.一種早期預測術后認知功能障礙的hsa-mir-572檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒是由反轉錄系統、引物系統和擴增系統組成，其中的引物系統由特異性的hsa-mir-572反轉錄引物及Real-time PCR的上、下游引物組成， hsa-mir-572反轉錄引物序列如SEQ ID NO: I所示， Real-time PCR上游引物序列如SEQ ID N0:2所示， Real-time PCR下游引物序列如SEQ ID N0:3所示; 其中的反轉錄系統由反轉錄酶、反轉錄體系緩沖液和R N A酶抑制劑組成； 其中的擴增系統由SYBR Premix Ex Taq 試劑組成。
3.根據權利要求I所述的一種早期預測術后認知功能障礙的hsa-mir-572檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒具體組成如下 A)hsa-mir-572 反轉錄引物，I 管，濃度10 μ M，100 μ I/ 管； B)Real-time PCR 上游引物，I 管，濃度:10 μ M, 100 μ I/管； Real-time PCR 下游引物，I 管，濃度10 μ M，100 μ I/管；C)Trizol reagent, I 管，2000 μ I/ 管； D)氯仿，I管，500μ1/管； Ε)無水乙醇，I管，7ml/管;F)DEPC H20,1 管，1000 μ I/ 管;G)dd H20,1 管，2000 μ I/ 管。
4.一種根據權利要求2或3所述的早期預測術后認知功能障礙的hsa-mir-572檢測試劑盒的檢測方法，具體步驟如下 按常規抽血取血清或血漿，用總RNA提取試劑處理血清或血漿，加氯仿離心后取上層水相，并富集血清或血衆中的小RNA ;由反轉錄系統反轉錄hsa-mir-572成cDNA ;用擴增系統進行Real-time PCR擴增，測定hsa-mir-572含量。
全文摘要
本發明涉及醫學生物檢測技術領域，是一種早期預測術后認知功能障礙的MicroRNA 572試劑盒及檢測方法。目前還沒有一種有效的方法來預測術后認知功能障礙，給臨床上早期預測及治療帶來不便。本發明通過對術前認知功能正常患者、術后認知功能障礙患者血漿中hsa-mir-572的含量比較發現hsa-mir-572的含量變化情況可以作為術后認知功能障礙的早期預測手段。本發明提供一種早期預測術后認知功能障礙的hsa-mir-572檢測試劑盒，該試劑盒包括反轉錄引物、Real-time PCR的上下游引物和擴增系統等，經臨床試用，檢測的準確率達85%左右，因此本發明試劑盒可用于早期預測術后認知功能障礙。
文檔編號C12Q1/68GK102766696SQ201210289608
公開日2012年11月7日 申請日期2012年8月15日 優先權日2012年8月15日
發明者余喜亞, 劉善榮, 劉淑鵬, 畢曉瑩, 鄧小明 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學