專利名稱：一種大腸桿菌胞外生產外源蛋白的集成化方法
技術領域：
本發明涉及改造大腸桿菌染色體基因使之作為外源蛋白生產的細胞工廠，確切地說是一種大腸桿菌胞外生產外源蛋白的集成化方法。
背景技術：
重組蛋白藥物市場增長迅猛，已成為一個巨大的高新技術產業。其中重要的重組蛋白藥物有細胞因子，蛋白類激素，酶和抗體等。但因這些藥物生產成本高，找到高效低成本的生物系統與生產工藝尤為必要。重組蛋白的生產通常使用微生物系統。微生物系統具有生長快與成本低的優點。 大腸桿菌是使用最廣泛的微生物系統。在大腸桿菌系統中，根據重組蛋白表達后的空間定位，可分為胞內表達與胞外表達。胞外表達正常情況下為可溶性產物。胞內表達又可分為胞質中表達與周質空間表達，且常形成包涵體。胞外表達與周質空間表達的蛋白較少受到蛋白酶的降解，有利于目標產物的積累。大腸桿菌有多種轉運系統將蛋白分泌至周質空間，最常用的是Sec系統。但大腸桿菌缺乏天然的胞外分泌機制，絕大多數外源蛋白無法分泌到胞外。胞內重組蛋白藥物常規生產工藝包括菌株構建、發酵、破壁、蛋白分離與精制。但因胞內雜蛋白成分復雜、易形成無活性的包涵體，因而分離成本高、產率低。特別是胞內表達需要破碎細胞，而導致產品中存在磷脂多醇與蛋白復合物等熱原成份，嚴重影響藥品生產。因此，一種通用、高產、簡便和高效而穩定的生產體系亟待建立。目前，僅少量文獻報道了大腸桿菌胞外生產重組蛋白的方法。且多為理化誘變的方法，可以篩選到胞外高產突變株，但該方法篩選過程復雜，機理不明，重復性差。理論上，遺傳性改造可使大腸桿菌和沙門氏菌等革蘭氏陰性菌的細胞外膜缺陷，導致周質空間蛋白部分釋放到培養基中。使用滲漏菌株進行胞外蛋白的生產鮮有報道。如大腸桿菌的T/7/7基因突變體可以將周質空間蛋白滲漏至培養基中，但目標蛋白的滲漏比率及其產量仍然有提聞的空間。
發明內容
本發明提供一種大腸桿菌重組蛋白的發酵和胞外分泌同時進行的重組蛋白生產方法，通過遺傳改造的方法得到細胞壁或膜的通透性增強的分泌型菌株，并將胞內合成的目標蛋白質通過信號肽或融合蛋白(如硫氧還蛋白等)導入到細胞周質空間，進而選擇性地滲漏至培養基中，提高表達水平和降低分離成本成為本發明的目的。—種大腸桿菌胞外生產外源蛋白的集成化方法，其特征在于包括單基因突變的分泌型大腸桿菌的菌株構建、外源蛋白表達的分泌型重組大腸桿菌的菌株構建及分泌型重組大腸桿菌的目標蛋白表達過程；
所述的單基因突變的分泌型大腸桿菌的菌株構建方法為使用預先設計的細胞膜蛋白或細胞壁合成酶基因pal或mrcB, mrcA, mrdA, murC, rodA, rodZ中的一種單基因敲除引物進行PCR反應，得到兩端為10 250 bp特定目標基因同源序列及中間為氯霉素抗性標記序列的濃度為 I 1000 ng/μ 的或mrcB,mrcA,mrdA,murC,rodA,rodZ 中飽一種基因打靶片段，并整合到宿主大腸桿菌染色體中，得到分泌型大腸桿菌菌株。所述的一種大腸桿菌胞外生產外源蛋白的集成化方法，其特征在于所述的單基因突變的分泌型大腸桿菌的菌株含有的基因/^7編碼區發生了突變，或者基因的啟動子區域發生了突變，從而使/^7基因無法表達出相應的Pal蛋白產物，或表達出降低了功能的Pal蛋白產物，進而正常的細胞膜運輸功能發生變化。所述的一種大腸桿菌胞外生產外源蛋白的集成化方法，其特征在于所述的外源蛋白表達的分泌型重組大腸桿菌菌株構建方法為將外源目標蛋白質基因先重組到分泌型質粒中，隨后克隆到該分泌型大腸桿菌中，進而得到分泌型重組大腸桿菌菌株。所述的一種大腸桿菌胞外生產外源蛋白的集成化方法，其特征在于所述的外源蛋白表達的分泌型重組大腸桿菌菌株含有編碼外源蛋白的重組基因質粒，該重組質粒中外源蛋白基因與定位于周質空間的信號肽編碼序列相連，從而使胞內合成的外源蛋白通過信 號肽導入于周質空間進而滲漏到培養基中。所述的一種用于重組蛋白分泌型表達的大腸桿菌構建方法，其特征在于所述的分泌型重組大腸桿菌的目標蛋白表達過程指的是在發酵培養基中使用外源蛋白表達的分泌型重組大腸桿菌菌株生產外源蛋白。所述的一種用于重組蛋白分泌型表達的大腸桿菌構建方法，其特征在于所述的發酵培養基中含有0. I 2%胰蛋白胨，O. 2 10%酵母提取粉，O. 05 5%甘油，O. 02
O.5% KH2PO4,0. I 2% K2HPO4。本發明的原理為
本發明所說的大腸桿菌胞外生產重組蛋白的方法，主要包括構建特定的細胞膜或細胞壁改變的分泌型重組大腸桿菌生產菌株和在發酵培養基中使用該特定生產菌株胞外生產外源蛋白。其特征在于，使用預先設計的/^7基因敲除引物進行PCR反應，得到兩端為10 250 bp特定目標基因同源序列及中間為氯霉素抗性標記序列的高濃度(10 1000ng/H)pal基因打靶片段。并將其作為突變工具電轉化導入到經過誘導的含PKD46的待突變大腸桿菌出發菌株中，從而實現/^7基因的突變。其中所說的細胞膜或細胞壁改變的分泌型重組大腸桿菌生產菌株指'pal, mrCA,mrcB, mrdA, rodA, murC, rodZ等基因編碼區的核苷酸缺失或替換；或在基因的啟動子區域的核苷酸缺失或替換的突變菌株。優選和基因突變。集成化方法指的是將各技術整合在一起。本發明的有益效果
I、本發明提供了大腸桿菌滲漏發酵重組蛋白的一種新途徑，并提高了目標蛋白的滲漏比率和產量。2、本發明實現了重組蛋白發酵和胞外分泌同時進行。在發酵過程中，重組目標蛋白可以從胞內滲漏且不顯著影響菌體的持續生長，降低了目標蛋白的胞內降解，提高了重組蛋白表達；同時減少了重組蛋白的胞內過度積累，而降低了包涵體形成；消除了細胞破壁工藝，減少了熱原污染；設計培養基組成，便于分離純化，進而達到降低了生產成本，提高產品質量的目的。滲漏不僅簡化了純化重組蛋白的工藝，也提高了目標產物的表達水平。經檢測，超過40%的重組蛋白滲漏到培養基中，表達水平為10 30%。3、本發明采用大腸桿菌的或fflrcS等基因突變株為宿主和定位于周質空間的重組蛋白質粒，使得重組蛋白的發酵和胞外分泌同時進行。從而實現降低目標蛋白的胞內降解，提高重組蛋白表達；同時減少重組蛋白的胞內過度積累，而降低包涵體形成；消除細胞破壁工藝，減少熱原污染，方便分離純化；進而達到降低生產成本，提高產品表達及質量的目的。經檢測,超過40%的重組蛋白滲漏到培養基中，表達水平為10 30%。
圖I為單基因敲除突變株目標蛋白表達SDS-PAGE結果，其目標蛋白重組硫氧還人甲狀旁腺激素融合蛋白；泳道1-7為胞外蛋白，泳道8-14為胞內蛋白，M為標準蛋白)。泳道I為陽性對照；泳道2為pal基因突變株(實施例I);泳道3-5為基因突變株(實施例2);泳道6-7為陰性對照；泳道8為陽性對照；泳道9為pal基因突變株(實施例I)；泳道10-12為《TM基因突變株(實施例2);泳道13-14為陰性對照。
具體實施例方式本發明所說的大腸桿菌胞外生產重組蛋白的方法，包括以下步驟
A、大腸桿菌基因突變的分泌型菌株構建
(1)使用預先設計的特定基因敲除引物，以抗性標記基因質粒pKD3為模板，進行聚合酶鏈式反應合成特定的PCR產物，稱為pa/基因打靶片段。打靶片段兩端為10 250 bp(優選30 100 bp)的/^7基因同源序列，中間為氯霉素抗性標記序列。將其使用PCR產物純化試劑盒得到高濃度10 1000 ng/μ (優選100 500 ng/H)pal基因打靶片段；
(2)利用I 100mmol/L (優選5 20 mmol/L)的L-阿拉伯糖誘導含敲除輔助質粒PKD46的大腸桿菌出發菌株O. 2 10 h (優選I 3 h)，再將誘導后的菌液制備電轉化感受態細胞；
(3)將純化后的高濃度/^7基因打靶片段電轉化導入所得的誘導后的大腸桿菌出發菌株的電轉化感受態細胞之中，在含O. 5 50 mmol/L (優選2 25 mmol/L)的L-阿拉伯糖的SOC培養基恢復O. 2 20 h，使用抗性LB固體培養基篩選發生同源重組的突變菌株，并使用PCR法和測序法確定/7^7基因區域發生正確的替換突變后，即得基因突變菌株。具體步驟請參考文獻(Datsenko and Wanner 2000 )。B、產人甲狀旁腺激素的分泌型重組菌株構建
將合成的人甲狀旁腺激素hPTH的基因片斷，測序正確后將其克隆到分泌型表達質粒pET32a (+)中，得到重組質粒m^-pthH,轉化到基因突變菌株得到分泌型重組菌株，即產人甲狀旁腺激素的分泌型重組菌株。C、重組蛋白發酵
將得到的外源蛋白表達的分泌型重組菌株先使用含5 500 μδ/πι1 (優選25 100Kg/ml)的Amp的LB固體培養基活化該工程菌株，3 72 h (優選12 36 h)后挑單菌落接種到帶有3 300 ml (優選10 50 ml)的含5 500 μδ/πι1 (優選10 200 Pg/ml)的Amp的LB種子培養基的250 ml搖瓶中，在溫度20 45°C (優選30 42°C )，轉速50 500 rpm (優選150 300 rpm)的條件下培養3 72 h (優選12 36 h)，再將O. I 10ml(優選0. 5 5 ml)的該菌液接種到帶有3 300 ml (優選10 50 ml)含5 500 μδ/ml (優選10 200 μδ/πι1)的Amp的TB液體發酵培養基的250 ml搖瓶中，當培養基中菌體濃度達到在OD600為O. 05 I. 8 (優選O. 2 O. 8)時加入終濃度為O. 05 5 mmol (優選O. 2 O. 8 mmol)的IPTG，誘導發酵I 24 h (優選2 12 h)后終止發酵。得到發酵液于常溫下離心分離，收集上清液即得重組蛋白粗提物。其中所說的種子培養基為0. I 5%胰蛋白胨、O. 05 5%酵母提取粉以及O. 05 5%NaCl ；
發酵培養基為0. I 2%胰蛋白胨，O. 2 10%酵母提取粉，O. 05 5%甘油，O. 02
O.5% KH2PO4,0. I 2% K2HPO4 ；
固體培養基為0. 5 5%的瓊脂，O. I 5%胰蛋白胨、O. 05 5%酵母提取粉以及
0.05 5%NaCl。
本發明采用/^7基因突變的大腸桿菌作為外源蛋白質宿主菌株，定位于周質空間的載體作為重組目標蛋白表達質粒。所用原料均為市售品。本發明實現了重組蛋白發酵和胞外分泌同時進行。在發酵過程中，重組目標蛋白可以從胞內滲漏且不顯著影響菌體的持續生長，降低了目標蛋白的胞內降解，提高了重組蛋白表達；同時減少了重組蛋白的胞內過度積累，而降低了包涵體形成；消除了細胞破壁工藝，減少了熱原污染；設計培養基組成，便于分離純化，進而達到降低了生產成本，提高產品質量的目的。滲漏不僅簡化了純化重組蛋白的工藝，也提高了目標產物的表達水平。經檢測，超過40%的重組蛋白滲漏到培養基中，表達水平為10 30%。下面結合實施例對本發明作進一步闡述，其目的是更好理解本發明內容。因此，所舉之例并不限制本發明的保護范圍。此外，在所列實施例中如無特別說明勻采用如下材料
I)菌種
宿主為Escherichia coli JM109 (DE3),敲除輔助質粒pKD46,抗性標記基因質粒pKD3和pKD4，抗性標記基因剔除質粒pCP20。pal基因敲除引物palH+PF和palH+PR，pal基因鑒定引物PalTl和palT2。2)培養基
種子培養基1%胰蛋白胨，O. 5%酵母提取粉以及O. 5%NaCl ；
發酵培養基1. 2%胰蛋白胨，2. 4%酵母提取粉，O. 5%甘油，O. 231%KH2P04，
1.254%K2HP04 ；
固體培養基1. 5%的瓊脂，1%胰蛋白胨，O. 5%酵母提取粉以及O. 5%NaCl ；
SOC 培養基2% 胰蛋白胨，O. 5% 酵母提取粉，O. 05%NaCl，2. 5 mM KCl 10 mM MgCl2, 20
mM葡萄糖。所用試劑均為市售品。
實施例I
一種大腸桿菌滲漏發酵重組蛋白的方法，包括以下步驟
A、單基因突變的分泌型大腸桿菌的菌株構建，即大腸桿菌基因突變的分泌型菌株構建包括以下步驟
(I)使用預先設計的/基因敲除引物palH+PF和palH+PR，以抗性標記基因質粒pKD3為模板，進行聚合酶鏈式反應合成特定的PCR產物，得到/^7基因打靶片段，打靶片段的兩端為50 bp的基因同源序列，中間是氯霉素抗性標記序列，將所得的PCR產物使用PCR產物純化試劑盒得到20 ng/μ 的純化后的高濃度打靶片段；
(2)利用10mmol/L的L-阿拉伯糖誘導含有敲除輔助質粒pKD46的大腸桿菌出發菌種JM109 (DE3) 2 h，再將所得的誘導后的菌液制備電轉化感受態細胞；
(3)將步驟(I)所得純化后的高濃度的基因打靶片段導入步驟(2)所得的誘導后的菌液的電轉化感受態細胞之中后，在含5 mmol/L的L-阿拉伯糖的SOC培養基恢復2 h后，使用抗性平板篩選發生同源重組的突變菌株，并使用鑒定引物PalTl和palT2進行PCR法和測序法確定基因區域發生替換突變后，即得基因突變的分泌型菌株；
B、產人甲狀旁腺激素的分泌型重組菌株構建
將合成的人甲狀旁腺激素hPTH的基因片斷，測序正確后將其克隆到分泌型表達質粒pET32a(+)中，得到重組質粒pET32a-A/7iA，轉化到基因突變菌株中得到分泌型重組菌 株，即產人甲狀旁腺激素的分泌型重組菌株。C、重組蛋白發酵
將得到的外源蛋白表達的分泌型重組菌株使用含50μ8/πι1的氨芐青霉素的LB平板活化該工程菌株，20 h后挑單菌落接種到帶有30ml的含5(^g/ml的Amp的LB液體培養基的250ml搖瓶中，370C的200轉搖床培養18 h，再將該菌液接種到帶有30ml含5(^g/ml的Amp的TB液體發酵培養基的250ml搖瓶中，使培養基菌體濃度保持在0D600為O. I左右，200轉搖床培養8 h后加入終濃度為O. 5mmol的IPTG，誘導發酵4 h后終止發酵，取Iml發酵液作為樣品，用于后續分析。結果將發酵液于4°C條件下以6000 rpm的速度離心lOmin，收集上清液即得重組蛋白粗提物。經檢測，超過40%的重組蛋白滲漏到培養基中，表達水平為10 30%ο實施例2
一種大腸桿菌滲漏發酵重組蛋白的方法，包括以下步驟
A、大腸桿菌基因突變的分泌型菌株構建包括以下步驟
Cl)使用預先設計的基因敲除引物mrcBH+PF和mrcBH+PR，以抗性標記基因質粒PKD3為模板，進行聚合酶鏈式反應合成特定的PCR產物，得到基因打靶片段，打靶片段的兩端為50bp ^nwcB基因同源序列，中間是氯霉素抗性標記序列，將所得的PCR產物使用PCR產物純化試劑盒得到20ng/^l的純化后的高濃度打靶片段；
(2)利用lOmmol/L的L-阿拉伯糖誘導含有敲除輔助質粒pKD46的大腸桿菌出發菌種JM109 (DE3) 2 h，再將所得的誘導后的菌液制備電轉化感受態細胞；
(3)將步驟(I)所得純化后的高濃度的基因打靶片段導入步驟(2)所得的誘導后的菌液的電轉化感受態細胞之中后，在含5 mmol/L的L-阿拉伯糖的SOC培養基恢復2h后，使用抗性平板篩選發生同源重組的突變菌株，并使用鑒定引物mrcBTl和mrcBT2進行PCR法和測序法確定基因區域發生替換突變后，即得基因突變的分泌型菌株；
B、外源蛋白表達的分泌型重組大腸桿菌的菌株構建(產人甲狀旁腺激素的分泌型重組菌株構建)
將合成的人甲狀旁腺激素hPTH的基因片斷，測序正確后將其克隆到分泌型表達質粒pET32a (+)中，得到重組質粒pET32a-A/7iA，轉化到fflrM基因突變菌株中得到分泌型重組菌株，即產人甲狀旁腺激素的分泌型重組菌株。C、重組蛋白發酵
將得到的外源蛋白表達的分泌型重組菌株使用含50μ8/πι1的氨芐青霉素的LB平板活化該工程菌株，20 h后挑單菌落接種到帶有30ml的含5(^g/ml的Amp的LB液體培養基的250ml搖瓶中，370C的200轉搖床培養18 h，再將該菌液接種到帶有30ml含5(^g/ml的Amp的TB液體發酵培養基的250ml搖瓶中，使培養基菌體濃度保持在0D600為O. I左右，200轉搖床培養8 h后加入終濃度為O. 5mmol的IPTG，誘導發酵4 h后終止發酵，取Iml發酵液作為樣品，用于后續分析。結果將發酵液于4°C條件下以6000 rpm的速度離心lOmin，收集上清液即得重組蛋白粗提物。經檢測，超過40%的重組蛋白滲漏到培養基中，表達水平為10 30%ο實施例3
一種大腸桿菌滲漏發酵重組蛋白的方法，包括以下步驟
A、單基因突變菌株的構建包括以下步驟
(1)使用預先設計的/^7基因敲除引物palH+PF和palH+PR，以抗性標記基因質粒pKD3為模板，進行聚合酶鏈式反應合成特定的PCR產物，得到/^7基因打靶片段，打靶片段的兩端為50bp的基因同源序列，中間是氯霉素抗性標記序列，將所得的PCR產物使用PCR產物純化試劑盒得到20ng/^l的純化后的高濃度打靶片段；
(2)利用lOmmol/L的L-阿拉伯糖誘導含有敲除輔助質粒pKD46的大腸桿菌出發菌種JM109 (DE3) 2 h，再將所得的誘導后的菌液制備電轉化感受態細胞；
(3)將步驟(I)所得純化后的高濃度的基因打靶片段導入步驟(2)所得的誘導后的菌液的電轉化感受態細胞之中后，在含5 mmol/L的L-阿拉伯糖的SOC培養基恢復2 h后，使用抗性平板篩選發生同源重組的突變菌株，并使用鑒定引物PalTl和palT2進行PCR法和測序法確定基因區域發生替換突變后，即得基因突變菌株；
B、產B淋巴細胞刺激因子的分泌型重組菌株構建
將合成的B淋巴細胞刺激因子BLyS的基因片斷，測序正確后將其克隆到分泌型表達質粒pET32a (+)中，得到重組質粒pET32a-67_^s，轉化到pal基因突變菌株中得到分泌型重組菌株，即產B淋巴細胞刺激因子的分泌型重組菌株。C、重組蛋白發酵
將得到的外源蛋白表達的分泌型重組菌株使用含50μ8/πι1的氨芐青霉素的LB平板活化該工程菌株，20 h后挑單菌落接種到帶有30ml的含5(^g/ml的Amp的LB液體培養基的250ml搖瓶中，370C的200轉搖床培養18 h，再將該菌液接種到帶有30ml含5(^g/ml的Amp的TB液體發酵培養基的250ml搖瓶中，使培養基菌體濃度保持在0D600為O. I左右，200轉搖床培養8 h后加入終濃度為O. 5mmol的IPTG，誘導發酵4 h后終止發酵，取Iml發酵液作為樣品，用于后續分析。結果將發酵液于4°C條件下以6000 rpm的速度離心lOmin，收集上清液即得重組蛋白粗提物。經檢測，超過40%的重組蛋白滲漏到培養基中，表達水平為10 30%ο實施例4
一種大腸桿菌滲漏發酵重組蛋白的方法，包括以下步驟
A、大腸桿菌基因突變的分泌型菌株構建包括以下步驟(1)使用預先設計的fflrM基因敲除引物mrcBH+PF和mrcBH+PR，以抗性標記基因質粒PKD3為模板，進行聚合酶鏈式反應合成特定的PCR產物，得到基因打靶片段，打靶片段的兩端為50bp ^nwcB基因同源序列，中間是氯霉素抗性標記序列，將所得的PCR產物使用PCR產物純化試劑盒得到20ng/^l的純化后的高濃度打靶片段；
(2)利用lOmmol/L的L-阿拉伯糖誘導含有敲除輔助質粒pKD46的大腸桿菌出發菌種JM109 (DE3) 2 h，再將所得的誘導后的菌液制備電轉化感受態細胞；
(3)將步驟(I)所得純化后的高濃度的基因打靶片段導入步驟(2)所得的誘導后的菌液的電轉化感受態細胞之中后，在含5 mmol/L的L-阿拉伯糖的SOC培養基恢復2h后，使用抗性平板篩選發生同源重組的突變菌株，并 使用鑒定引物mrcBTl和mrcBT2進行PCR法和測序法確定基因區域發生替換突變后，即得基因突變的分泌型菌株；
B、產B淋巴細胞刺激因子的分泌型重組菌株構建
將合成的B淋巴細胞刺激因子BLyS的基因片斷，測序正確后將其克隆到分泌型表達質粒pET32a (+)中，得到重組質粒pET32a-67_^s，轉化到fflrM基因突變菌株中得到分泌型重組菌株，即產B淋巴細胞刺激因子的分泌型重組菌株。C、分泌型重組大腸桿菌的目標蛋白表達過程(重組蛋白發酵)
將得到的外源蛋白表達的分泌型重組菌株使用含50μ8/πι1的氨芐青霉素的LB平板活化該工程菌株，20 h后挑單菌落接種到帶有30ml的含5(^g/ml的Amp的LB液體培養基的250ml搖瓶中，370C的200轉搖床培養18 h，再將該菌液接種到帶有30ml含5(^g/ml的Amp的TB液體發酵培養基的250ml搖瓶中，使培養基菌體濃度保持在0D600為O. I左右，200轉搖床培養8 h后加入終濃度為O. 5mmol的IPTG，誘導發酵4 h后終止發酵，取Iml發酵液作為樣品，用于后續分析。結果將發酵液于4°C條件下以6000 rpm的速度離心lOmin，收集上清液即得重組蛋白粗提物。經檢測，超過40%的重組蛋白滲漏到培養基中，表達水平為10 30%ο實施例5
一種大腸桿菌滲漏發酵重組蛋白的方法，包括以下步驟
A、單基因突變菌株的構建包括以下步驟
(1)使用預先設計的/^7基因敲除引物palH+PF和palH+PR，以抗性標記基因質粒pKD3為模板，進行聚合酶鏈式反應合成特定的PCR產物，得到/^7基因打靶片段，打靶片段的兩端為50bp的基因同源序列，中間是氯霉素抗性標記序列，將所得的PCR產物使用PCR產物純化試劑盒得到20ng/^l的純化后的高濃度打靶片段；
(2)利用lOmmol/L的L-阿拉伯糖誘導含有敲除輔助質粒pKD46的大腸桿菌出發菌種JM109 (DE3) 2 h，再將所得的誘導后的菌液制備電轉化感受態細胞；
(3)將步驟(I)所得純化后的高濃度的基因打靶片段導入步驟(2)所得的誘導后的菌液的電轉化感受態細胞之中后，在含5 mmol/L的L-阿拉伯糖的SOC培養基恢復2 h后，使用抗性平板篩選發生同源重組的突變菌株，并使用鑒定引物PalTl和palT2進行PCR法和測序法確定基因區域發生替換突變后，即得基因突變菌株；
B、產咖啡酰輔酶A-O-甲基轉移酶的分泌型重組菌株構建
將合成的咖啡酰輔酶A-O-甲基轉移酶SvOM的基因片斷，測序正確后將其克隆到分泌型表達質粒pET32a (+)中，得到重組質粒pETSZa-sra ，轉化到pal基因突變菌株中得到分泌型重組菌株，即產咖啡酰輔酶A-O-甲基轉移酶的分泌型重組菌株。C、重組蛋白發酵
將得到的外源蛋白表達的分泌型重組菌株使用含50μ8/πι1的氨芐青霉素的LB平板活化該工程菌株，20 h后挑單菌落接種到帶有30ml的含5(^g/ml的Amp的LB液體培養基的250ml搖瓶中，370C的200轉搖床培養18 h，再將該菌液接種到帶有30ml含5(^g/ml的Amp的TB液體發酵培養基的250ml搖瓶中，使培養基菌體濃度保持在0D600為O. I左右，200轉搖床培養8 h后加入終濃度為O. 5mmol的IPTG，誘導發酵4 h后終止發酵，取Iml發酵液作為樣品，用于后續分析。結果將發酵液于4°C條件下以6000 rpm的速度離心lOmin，收集上清液即得重組蛋白粗提物。經檢測，超過40%的重組蛋白滲漏到培養基中，表達水平為10 30%ο實施例6 一種大腸桿菌滲漏發酵重組蛋白的方法，包括以下步驟
A、大腸桿菌基因突變的分泌型菌株構建包括以下步驟
Cl)使用預先設計的基因敲除引物mrcBH+PF和mrcBH+PR，以抗性標記基因質粒PKD3為模板，進行聚合酶鏈式反應合成特定的PCR產物，得到基因打靶片段，打靶片段的兩端為50bp ^nwcB基因同源序列，中間是氯霉素抗性標記序列，將所得的PCR產物使用PCR產物純化試劑盒得到20ng/^l的純化后的高濃度打靶片段；
(2)利用lOmmol/L的L-阿拉伯糖誘導含有敲除輔助質粒pKD46的大腸桿菌出發菌種JM109 (DE3) 2 h，再將所得的誘導后的菌液制備電轉化感受態細胞；
(3)將步驟(I)所得純化后的高濃度的基因打靶片段導入步驟(2)所得的誘導后的菌液的電轉化感受態細胞之中后，在含5 mmol/L的L-阿拉伯糖的SOC培養基恢復2h后，使用抗性平板篩選發生同源重組的突變菌株，并使用鑒定引物mrcBTl和mrcBT2進行PCR法和測序法確定基因區域發生替換突變后，即得基因突變的分泌型菌株；
B、產咖啡酰輔酶A-O-甲基轉移酶的分泌型重組菌株構建
將合成的咖啡酰輔酶A-O-甲基轉移酶SvOM的基因片斷，測序正確后將其克隆到分泌型表達質粒pET32a(+)中，得到重組質粒ρΕΤ32α-5·ι· ,轉化到基因突變菌株中得到分泌型重組菌株，即產咖啡酰輔酶A-O-甲基轉移酶的分泌型重組菌株。C、重組蛋白發酵
將得到的外源蛋白表達的分泌型重組菌株使用含50μ8/πι1的氨芐青霉素的LB平板活化該工程菌株，20 h后挑單菌落接種到帶有30ml的含5(^g/ml的Amp的LB液體培養基的250ml搖瓶中，370C的200轉搖床培養18 h，再將該菌液接種到帶有30ml含5(^g/ml的Amp的TB液體發酵培養基的250ml搖瓶中，使培養基菌體濃度保持在0D600為O. I左右，200轉搖床培養8 h后加入終濃度為O. 5mmol的IPTG，誘導發酵4 h后終止發酵，取Iml發酵液作為樣品，用于后續分析。結果將發酵液于4°C條件下以6000 rpm的速度離心lOmin，收集上清液即得重組蛋白粗提物。經檢測，超過40%的重組蛋白滲漏到培養基中，表達水平為10 30%ο序列表
mrcB ,pal基因敲除引物
權利要求
1.一種大腸桿菌胞外生產外源蛋白的集成化方法，其特征在于包括單基因突變的分泌型大腸桿菌的菌株構建、外源蛋白表達的分泌型重組大腸桿菌的菌株構建及分泌型重組大腸桿菌的目標蛋白表達過程； 所述的單基因突變的分泌型大腸桿菌的菌株構建方法為使用預先設計的細胞膜蛋白或細胞壁合成酶基因pal或mrcB, mrcA, mrdA, murC, rodA, rodZ中的一種單基因敲除引物進行PCR反應，得到兩端為10 250 bp特定目標基因同源序列及中間為氯霉素抗性標記序列的濃度為 I 1000 ng/μ 的或mrcB,mrcA,mrdA,murC,rodA,rodZ 中飽一種基因打靶片段，并整合到宿主大腸桿菌染色體中，得到分泌型大腸桿菌菌株。
2.根據權利要求I所述的一種大腸桿菌胞外生產外源蛋白的集成化方法，其特征在于所述的單基因突變的分泌型大腸桿菌的菌株含有的基因/^7編碼區發生了突變，或者基因的啟動子區域發生了突變，從而使/^7基因無法表達出相應的Pal蛋白產物，或表達出降低了功能的Pal蛋白產物，進而正常的細胞膜運輸功能發生變化。
3.根據權利要求I所述的一種大腸桿菌胞外生產外源蛋白的集成化方法，其特征在于所述的外源蛋白表達的分泌型重組大腸桿菌菌株構建方法為將外源目標蛋白質基因先重組到分泌型質粒中，隨后克隆到該分泌型大腸桿菌中，進而得到分泌型重組大腸桿菌菌株。
4.根據權利要求I所述的一種大腸桿菌胞外生產外源蛋白的集成化方法，其特征在于所述的外源蛋白表達的分泌型重組大腸桿菌菌株含有編碼外源蛋白的重組基因質粒，該重組質粒中外源蛋白基因與定位于周質空間的信號肽編碼序列相連，從而使胞內合成的外源蛋白通過信號肽導入于周質空間進而滲漏到培養基中。
5.根據權利要求I所述的一種用于重組蛋白分泌型表達的大腸桿菌構建方法，其特征在于所述的分泌型重組大腸桿菌的目標蛋白表達過程指的是在發酵培養基中使用外源蛋白表達的分泌型重組大腸桿菌菌株生產外源蛋白。
6.根據權利要求5所述的一種用于重組蛋白分泌型表達的大腸桿菌構建方法，其特征在于所述的發酵培養基中含有0. I 2%胰蛋白胨，O. 2 10%酵母提取粉，O. 05 5%甘油，O. 02 O. 5% KH2PO4,0. I 2% Κ2ΗΡ04。
全文摘要
本發明公開了一種大腸桿菌胞外生產外源蛋白的集成化方法，包括單基因突變的分泌型大腸桿菌的菌株構建、外源蛋白表達的分泌型重組大腸桿菌的菌株構建及分泌型重組大腸桿菌的目標蛋白表達過程。本發明采用大腸桿菌的pal或mrcB等基因突變株為宿主和定位于周質空間的重組蛋白質粒，使得重組蛋白的發酵和胞外分泌同時進行。從而實現降低目標蛋白的胞內降解，提高重組蛋白表達；同時減少重組蛋白的胞內過度積累，而降低包涵體形成；消除細胞破壁工藝，減少熱原污染，方便分離純化；進而達到降低生產成本，提高產品表達及質量的目的。經檢測，超過40％的重組蛋白滲漏到培養基中，表達水平為10～30%。
文檔編號C12R1/19GK102827904SQ201210287000
公開日2012年12月19日 申請日期2012年8月13日 優先權日2012年8月13日
發明者童望宇, 宋俊蘭, 陳昭元 申請人:安徽大學