專利名稱：一株芽孢桿菌Bacillus SSAL-6及其在降解水華魚腥藻中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物，具體涉及一株芽孢桿菌Bacillus SSAL-6及其在降解水華魚腥藻中的應用，屬于微生物技術領域。
背景技術：
水體富營養化已成為困擾世界各國的普遍性環境問題。浮游藻類的大量繁殖導致水華的頻繁爆發，嚴重影響了人類的生活、生產和身體健康，造成了世界范圍內的生態災害，探索控制水華發生的有效途徑已迫在眉睫。目前治理水體富營養化主要是采用物理和化學方法，但這兩種方法不僅會消耗大量的財力和物力，而且會在一定程度上破壞生態環境。溶藻菌作為水華和赤潮的防治生物，日益受到國內外環境工作者的廣泛關注。國外對溶藻菌的研究已有數十年的歷史，自Geitler報道一種寄生在剛毛藻上的粘細菌以來， 陸續有溶藻菌的相關報道，研究重點也逐漸從單一溶藻菌的篩選及溶藻特性研究過渡到菌一藻種群生態學及分子調控機理等方面。目前，國內對溶藻細菌的研究還處于初始階段，因此，尋找高效溶藻菌對溶藻菌的深入研究及應用具有重要意義。水華魚腥藻(引起水華的常見藻類)是導致水體富營養化的主要藻種之一，其分布廣，能夠產生藻毒素，直接和間接危害人類，然而截止目前，利用微生物方式控制水華魚腥藻的研究甚是罕見。為此，探討溶藻菌株對水華魚腥藻的生長效應和光合色素的影響，對于安全、經濟、高效地控制水體富營養化、治理水華具有重要的科學實踐價值。
發明內容
本發明的目的在于提供一株能夠有效降解水華魚腥藻的芽孢桿菌。本發明所述的芽孢桿菌從農業部都市農業(南方)重點實驗室黃化的水華魚腥藻液中分離篩選獲得，命名為芽孢桿菌Bacillus SSAL-6,已保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號)，保藏日期2012年6月6 日，保藏編號=CGMCC No. 6195。本發明的另一目的是提供一種利用微生物去除水華魚腥藻的方法，即所述芽孢桿菌Bacillus SSAL-6應用在降解水華魚腥藻上，以消除當前水華中水華魚腥藻的大量繁殖帶來的環境污染問題。所述的芽孢桿菌Bacillus SSAL-6的濃度為35%。實驗結果表明，在自然條件下，芽孢桿菌Bacillus SSAL-6對水華魚腥藻的降解效果隨菌株濃度的增大而增加，當芽孢桿菌Bacillus SSAL-6的濃度為35%時，對水華魚腥藻葉綠素a的抑制率可高達96%。本發明所述的芽孢桿菌Bacillus SSAL-6具有良好的溶藻效應，能夠有效地降解水華魚腥藻，對水體富營養化的控制提供了有效手段，為微生物治理水華的研究提供了重要基礎。
圖I為本發明的芽孢桿菌Bacillus SSAL-6在1000X下的染色顯微圖。圖2為本發明的芽孢桿菌Bacillus SSAL-6對水華魚腥藻細胞數的影響。圖3為本發明的芽孢桿菌Bacillus SSAL-6對水華魚腥藻干重的影響。圖4為本發明的芽孢桿菌Bacillus SSAL-6對水華魚腥藻色素吸收光譜的影響。圖5為本發明的芽孢桿菌Bacillus SSAL-6對水華魚腥藻葉綠素a的影響。
具體實施例方式實施例I、芽孢桿菌Bacillus SSAL-6的分離、純化及其鑒定
I、芽孢桿菌Bacillus SSAL-6的分離及純化以農業部都市農業(南方)重點實驗室黃化的水華魚腥藻液作為溶藻細菌的分離源，采用涂布平板法及分區劃線法多次純化分離，將分離獲得的25株細菌分別置于IOOmLLB液體培養基中，搖床轉速為180r · π ιΓ1，〗？！下培養24h，然后分別取800 μ L滴加到水華魚腥藻固體平板上，通過溶藻斑的大小考察、比較各菌的溶藻效果，最終篩選出具有較高溶藻效應的菌株SSAL-6。經鑒定為芽孢桿菌，命名為Bacillus SSAL-6。將其接入斜面培養基，于冰箱4°C保存；將擴大培養制成的菌懸液加入到滅菌的甘油中，甘油的最終濃度為25%，放入-80 V的冰箱保藏。所述的LB液體培養基組分及配比為酵母提取物，5g ;胰蛋白胨，IOg ；NaCl, IOg ；蒸餾水 IOOOmL ；pH7. 0-7. 2。所述的LB固體培養基組分及配比為酵母提取物，5g ;胰蛋白胨，IOg ；NaCl, IOg ；瓊脂粉，15g ;蒸餾水 IOOOmL ；pH7. 0-7. 2。所述的水華魚腥藻固體培養基組分及配比為磷酸氫二鉀(K2HPO4)，O. 075g ;硫酸鎂(MgSO4 · H2O), O. 125g ;碳酸鈣(CaCO3)，O. IOOg ;檸檬酸鐵(1% 水溶液),0. 5mL ;檸檬酸(1%水溶液)，O. 5mL ;鑰酸(1%水溶液)，5滴；氫氧化鈉(1%水溶液)，I. 5mL ;瓊脂粉，15g ；蒸懼水，1000mL。2、芽孢桿菌Bacillus SSAL-6的生理生化鑒定該菌株為革蘭氏陽性芽孢桿菌，桿狀，芽孢為橢圓形，大多中央生菌落呈近橘黃色。使用弓 I 物 7f(5，-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3，)和1540r (5’ AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’)。經序列比對表明，該菌株為芽孢桿菌，將其命名為Bacillus SSAL-6。該芽孢桿菌Bacillus SSAL-6已于2012年6月6保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱06110，地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號)，保存號為CGMCCNo. 6195。實施例2、芽孢桿菌Bacillus SSAL-6對水華魚腥藻生長效應和光合色素的影響I、芽孢桿菌Bacillus SSAL-6對水華魚腥藻生長效應的影響水華魚腥藻培養參照藻類生長抑制實驗的標準方法(國家環保部)，采用水生111號無氮培養液培養，pH為7. 5。培養溫度30±2°C，連續24h光照，光照強度3000±2001x，
靜置培養，每天定期搖動3次。在水華魚腥藻濃度為5X10^1 X IO5個/mL時，分別向IOOmL藻液中加入芽孢桿菌BacillusSSAL-6 (菌體濃度約為IO9個/mL)，處理濃度(v/v)梯度為5%、10%、15%、20%、25%、30%和35%,每組樣設3個重復。制備與實驗組相同的一系列不同配比的培養液(LB培養液水生111號無氮培養液)，分別用于培養芽孢桿菌Bacillus SSAL-6和水華魚腥藻形成對照組。以細胞計數法測定藻體細胞數量并測定水華魚腥藻干重。細胞計數方法從接種計時起，每隔24h取樣，用計數框進行細胞計數。用移液器取經過超聲波破碎儀打碎過的藻液O. ImL于計數框中，在低倍鏡下觀察，放大倍數40 X 10 ，隨機取五個視野，數出所看到的細胞數，取其平均值。N=IO X aX Sit/Sft，其中，a—每個視野內細胞平均值，Sif-計數框面積，Sft-視野面積，N-每mL中細胞個數。水華魚腥藻干重測定方法取定量的藻液，離心得藻，加入稱量皿，在80°C烘至恒重。不同濃度的芽孢桿菌Bacillus SSAL-6對水華魚腥藻的細胞數的影響的測定結果如圖2所示。結果表明，水華魚腥藻細胞的去除效果與芽孢桿菌Bacillus SSAL-6濃度呈現出一定的濃度相關性，即隨著芽孢桿菌Bacillus SSAL-6濃度的增長，對水華魚腥藻細胞的去除作用增強。當芽孢桿菌BaciIIus SSAL-6菌體濃度為5%、10%、15%、20%、25%、30%和35%時，培養24h對水華魚腥藻細胞的去除率分別為3%、7%、12%、16%、19%,22%和25%，培養168h后分別變為5%、17%、26%、29%、31%、34%和36%，與對照相比，呈現顯著差異(P < O. 05)。不同濃度的芽孢桿菌Bacillus SSAL-6對水華魚腥藻的干重的影響的測定結果如圖3所示。結果表明，純LB液體培養基的投入對水華魚腥藻干重亦會產生影響，當LB液體培養基濃度依次為5%、10%、15%、20%、25%、30%和35%時，培養168h后的水華魚腥藻干重相應增加，分別為 15. 90、16. 40、16. 77、17. 74、18. 11、19. 38 和 22. 04mg/mL。通過排除 LB 液體培養基本身對水華魚腥藻生長的影響因素，可見，隨著菌體濃度從5%依次升至35%，芽孢桿菌Bacillus SSAL-6對水華魚腥藻干重的抑制率依次為5%、16%、27%、31%、36%、37%和40%。所述的水華魚腥藻液體培養基組分及配比為磷酸氫二鉀(K2HPO4)，O. 075g ;硫酸鎂(MgSO4 -H2O), O. 125g ;碳酸鈣(CaCO3)，O. IOOg ;檸檬酸鐵(1% 水溶液)，0. 5mL ;檸檬酸(1%水溶液)，O. 5mL ;鑰酸(1%水溶液)，5滴；氫氧化鈉(1%水溶液)，I. 5mL ;蒸懼水，1000mL。2、芽孢桿菌Bacillus SSAL-6對水華魚腥藻光合色素的影響以Bhandari and Sharma法連續掃描400 750nm波長范圍內色素吸收光譜，并對水華魚腥藻葉綠素a含量進行測定。葉綠素a的提取測定取水華魚腥藻藻液IOmL過O. 45 μ m的混合纖維素膜，將帶藻細胞的膜冷凍過夜，取出后迅速用SmL熱乙醇于熱水浴中萃取2min，將萃取液超聲破碎5-20min后，于暗處靜置2_6h，離心(5000r/min，4°C ) 5min后取上清液3. 5mL置于比色皿中，于665nm和750nm處測吸光值，計算酸化前的光密度值(E665b = Absea-Abs75tlb),然后滴加 200 μ L 的 lmol/L鹽酸酸化,5min 后于波長 665nm和 750nm處再測吸光值，計算酸化后的光密度值(E665a = Abs665a-Abs75tlaX采用熱乙醇為萃取溶劑，A=IL 5，K=2. 43，比色皿光程為Icm
27.9 X ( ββ5 - Ε665") X V 葉綠素 a ( pg/mL ) =---不同濃度的芽孢桿菌BaciIIus SSAL-6對水華魚腥藻色素吸收光譜的影響的測定結果如圖4所示。結果表明，不同濃度的芽孢桿菌Bacillus SSAL-6作用于水華魚腥藻時，其色素光譜吸收曲線變化差異較大。高濃度(> 25%)處理下光譜吸收曲線已非常不明顯，各處峰值模糊甚微，表明芽孢桿菌Bacillus SSAL-6已大大地抑制了藻體色素的種類和含量。中低濃度(5 25%)處理下，隨著菌體濃度的增加，各色素光譜吸收峰值均有降低，這與溶藻菌對藻體細胞數以及干重的影響相一致，譜圖充分體現溶藻菌的濃度相關性。葉綠素a是光能的捕獲者，也是葉綠體膜內光傳導者，因此葉綠素a含量的多少，充分反映出藻體光合成能力的強弱。不同濃度的芽孢桿菌Bacillus SSAL-6對水華魚腥藻葉綠素a的影響的測定結果如圖5所示(A、B、C、D、E、F、G、H分別代表芽孢桿菌BacillusSSAL-6 濃度為 0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%)。結果表明，芽孢桿菌 Bacillus SSAL-6對葉綠素a的抑制作用隨著菌體濃度的增加而增強。菌體濃度為5%、10%、15%、20%、25%、30%和35%，對芽孢桿菌Bacillus SSAL-6而言，24h對葉綠素a的抑制率分別為8%、14%、21%、29%,35%,42% 和 46%，168h 后依次升至 74%、81%、90%、94%、95%、95% 和 96%。此外，芽孢桿菌Bacillus SSAL-6對葉綠素a的抑制率亦隨著時間的延伸而增大，但增勢趨緩，如濃度為35%的芽孢桿菌Bacillus SSAL-6在24 120h內對水華魚腥藻葉綠素a的抑制率由46%逐漸升至95%，而120 168h由95%僅升至96%。·
權利要求
1.芽孢桿菌(Bacillus)SSAL-6，其特征在于其保藏編號為CGMCCNo. 6195。
2.如權利要求I所述的芽孢桿菌(Bacillus)SSAL-6在降解水華魚腥藻中的應用。
3.如權利要求2所述的芽孢桿菌(Bacillus)SSAL-6在降解水華魚腥藻中的應用的方法，其特征在于所述的芽孢桿菌Bacillus SSAL-6的濃度為35%。
全文摘要
本發明公開了一種芽孢桿菌及其在降解水華魚腥藻中的應用，所述芽孢桿菌從農業部都市農業(南方)重點實驗室黃化的水華魚腥藻液中分離篩選獲得，命名為芽孢桿菌Bacillus SSAL-6，已于2012年6月6日保存在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC No.6195；在自然條件下，芽孢桿菌Bacillus SSAL-6對水華魚腥藻的降解效果隨菌株濃度的增大而增加，當芽孢桿菌的濃度為35%時，對水華魚腥藻葉綠素a的抑制率可高達96%。本發明所述的芽孢桿菌Bacillus SSAL-6具有良好的溶藻效應，能夠有效地降解水華魚腥藻，對水體富營養化的控制提供了有效手段，為利用微生物治理水華提供了重要的方法。
文檔編號C12R1/07GK102796685SQ20121028507
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月10日 優先權日2012年8月10日
發明者沈健英, 孫秀敏 申請人:上海交通大學