專利名稱：一種鑒定水稻紋枯病菌Sdh基因核苷酸點突變及其對噻呋酰胺抗藥性的方法
技術領域：
本發明涉及一種鑒定水稻紋枯病菌Sdh基因核苷酸點突變及其對噻呋酰胺抗藥性的方法和專用引物。屬于分子生物學技術領域。
背景技術：
水稻紋枯病是由立枯絲核菌(Rhizoctonia solani Kiihn)引起的一種世界范圍的水稻病害，該病害引起水稻結實率和千粒重顯著降低，甚至植株倒伏枯死，是造成水稻減產的主要原因之一。水稻紋枯病菌屬于立枯絲核菌的AG-I融合群，其基因組序列未知，這也為該病原菌的深入研究帶來一定困難。隨著矮桿、早熟、多蘗型品種的大量推廣，以及施肥水平的不斷提高，水稻紋枯病危害逐步加重，近年來已成為我國水稻三大病害之首，嚴重影響了水稻產量和質量。目前對水稻紋枯病的防治以化學措施為主。噻呋酰胺(thifluzamide)商品名為“滿穗”，是陶氏益農公司開發的噻二唑羧酰苯胺類化合物，是近年來推出的新型、高效防治紋枯病藥劑。噻呋酰胺屬于呼吸抑制劑中作用于復合物II處的琥珀酸脫氫酶抑制劑(SDHIs)，這類藥劑還包括萎銹靈、啶酰菌胺、氟吡菌酰胺、吡噻菌胺等，它們具有相似的作用機制和抗性機制，相互間具有正交互抗藥性，多對擔子菌或子囊菌特效。使用初期，這類藥劑因其用藥量少，防效顯著而備受青睞，但因其作用位點單一，田間很快就產生了抗藥性。已有研究發現，病原菌對此類藥劑的抗性機制主要是琥珀酸脫氫酶B、C、D亞基(sdhB、sdhC、sdhD)發生點突變所致，如玉米瘤黑粉病菌、小麥殼針孢葉枯病菌、灰霉菌等均在sdhB第三個半胱氨酸簇的保守組氨酸位點發生點突變，灰蓋鬼傘病菌、菌核病菌等則在膜錨蛋白sdhC、sdhD位點發生點突變，脫氮副球菌在sdhB、sdhD發生點突變，而鏈格孢菌、米曲霉菌、多主棒孢在sdhB、sdhC、sdhD基因均發生突變。水稻紋枯病菌對噻呋酰胺的抗性機制目前還未明確，明確其具體的抗性基因及抗性檢測方法，可以對抗性菌株進行早期檢測，了解其抗性發展動態，制定合理的病害管理方案，延緩抗藥性的產生。傳統的抗性檢測方法主要為室內生物學測定，包括菌絲生長速率法、孢子萌發法、菌絲干重法、水平擴散法等。這些傳統的敏感性測定方法均需要制備含藥培養基，計算抑制中濃度，耗費時間長，工作量大，靈敏度低。隨著分子生物學的快速發展，分子技術得以在抗藥性檢測中應用，其速度快，效率高，是田間抗性檢測的理想方法。針對單堿基突變引起的抗性，AS-PCR和CAPS方法已成功應用于抗性菌株的分子檢測。等位特異PCR(Allele-Specific PCR，AS-PCR)是在引物的3’端設計一個堿基與突變位點匹配，在PCR擴增時引物只與突變菌株結合，敏感菌株的DNA則不能擴增，從而將敏感和抗性菌株區分開來。最近的研究發現，在原引物基礎上，改變倒數第二個堿基為不同核苷酸后，可以顯著提高引物的特異性，使得AS-PCR技術應用更為廣泛。CAPS (Cleaved amplified polymorphicsequences)是酶切擴增多態性序列標記技術，也稱為PCR-RFLP技術，敏感和抗性菌株由于核苷酸序列的差異可能導致了酶切位點的改變，對PCR擴增的DNA片段進行限制性酶切，經電泳分離后敏感和抗性菌株的表型不同，從而加以區分。
發明內容
本發明的一個目的是提供兩種檢測或輔助檢測水稻紋枯病菌中SdhB基因是否存在突變位點的方法及其專用引物。本發明所提供的第一種檢測或輔助檢測水稻紋枯病菌中sdhB基因是否存在突變位點的方法，包括如下步驟以待測水稻紋枯病菌的基因組DNA為模板，用SEQ ID NO : I和SEQ ID NO 2所示引物對進行PCR擴增，若能擴增出條帶，則所述待測水稻紋枯病菌中sdhB基因存在或候選存在突變位點；所述突變位點指水稻紋枯病菌中sdhB基因的基因組序列自5’末端起第975位核 苷酸為C和T雜合或T純合。上述過程中，所述sdhB基因的基因組序列自5’末端起第975位核苷酸也就是SEQID NO :4中自5’末端起第975位核苷酸。上述過程中，所述PCR擴增中，退火溫度為56°C。本發明所提供的另一種檢測或輔助檢測水稻紋枯病菌中sdhB基因是否存在突變位點的方法，包括如下步驟以待測水稻紋枯病菌的基因組DNA為模板，擴增得到sdhB基因，再用NlaIV酶切所得sdhB基因，若酶切產物中含有230bp片段，則所述待測水稻紋枯病菌中sdhB基因存在或候選存在突變位點；所述突變位點指水稻紋枯病菌中sdhB基因的基因組序列自5’末端起第975位核苷酸為C和T雜合或T純合。上述過程中，所述sdhB基因的基因組序列自5’末端起第975位核苷酸也就是SEQID NO :4中自5’末端起第975位核苷酸。本發明所提供的檢測或輔助檢測水稻紋枯病菌中sdhB基因是否存在突變位點的引物對，由SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示DNA分子組成。本發明的另一個目的是提供水稻紋枯病菌中sdhB基因或蛋白的突變位點。本發明所提供的水稻紋枯病菌中sdhB基因的一個突變位點，為水稻紋枯病菌中sdhB基因的基因組序列自5’末端起第975位核苷酸為C和T雜合或T純合。其中，所述sdhB基因的基因組序列自5’末端起第975位核苷酸也就是SEQ ID NO :4中自5’末端起第975位核苷酸。本發明所提供的水稻紋枯病菌中sdhB蛋白的一個突變位點，為水稻紋枯病菌中sdhB蛋白的自N端起第249位氨基酸為組氨酸與酪氨酸雜合或純合的酪氨酸。其中，所述sdhB蛋白的自N端起第249位氨基酸也就是SEQ ID NO :3中自N端起第249位氨基酸。上述任一所述突變位點在鑒定水稻紋枯病菌抗藥性中的應用也屬于本發明的保護范圍；所述抗藥性為抗噻呋酰胺。上述應用中，存在所述突變位點的水稻紋枯病菌具有或候選具有抗藥性。SEQ ID NO :3所示蛋白或SEQ ID NO :4所示基因也屬于本發明的保護范圍。上述中，任一所述水稻紋枯病菌具體是立枯絲核菌。
上述中，所述敏感菌株為噻呋酰胺的平均EC5tl小于O. I μ g/ml，抗性菌株為噻呋酰胺的平均 EC50 為 19. 558 μ g/ml。本發明提供的檢測水稻紋枯病菌對噻呋酰胺產生抗藥性的點突變的方法，對抗性菌株進行高靈敏度、簡單快速的分子檢測，及時了解抗藥性發生動態，對制定合理的病害管理方案、有效控制抗藥性病害發展具有重要意義。本發明方法具有以下技術優勢和特點結果可靠用本發明建立的分子檢測方法檢測菌株DNA，所有的抗性菌株都能與敏感菌株區分開來，其結果可靠性有保證。簡單快速傳統的生物學測定方法從病菌分離，到敏感性檢測，至少需要5天時間，工作量大，周期長。而分子檢測從提DNA到PCR或酶切分析，最多需要I. 5天時間，省時 省工。
圖I為水稻紋枯病菌敏感與抗性菌株的序列比對。A :sdhB、sdhC、sdhD基因的突變情況，B sdhB基因975位的堿基雜合，C :敏感菌株與抗性菌株的sdhB氨基酸比對。圖2為抗性與敏感菌株的NlaIV酶切位點。圖3為CAPS方法酶切檢測結果。I 4泳道為敏感菌株，5 16泳道為抗性菌株。圖4為AS-PCR方法檢測水稻紋枯病菌抗性突變體。A :四對AS-PCR引物在不同溫度條件下的電泳結果。B :引物BF975C/BR32在56°C下的擴增結果。S為敏感菌株，R為抗性雜合菌株，T為抗性純合菌株。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。文中“抗性菌株”均指對噻呋酰胺抗性的立枯絲核菌(Rhizoctonia solaniKiihn);“敏感菌株”均指對噻呋酰胺敏感的立枯絲核菌(Rhizoctonia solani Kiihn)。下述實施例中使用的立枯絲核菌為抗性菌株J-I，J-3，J-3-1、J-6、J_10、J-II、J-14、J-16、J-20、J-24、B-U B-I-U B-1-31、T2 ;敏感菌株 FBS-3、B310、D179、JHT158-3,JHM-4 和 E67。上述菌株分別采自FBS-3(福建)，B310、B-1、B-1-1、B-1-31 (廣東)，D179 (廣西)，JHM-4、JHT158-3, J-I、J-3、J-3-1、J-6、J-10、J-II、J-14、J-16、J-20、J-24、T2 (吉林)，E67(江蘇)。通過形態學并結合分子生物學方法鑒定所有菌株為立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani Kiihn)。實施例I、立枯絲核菌對噻呋酰胺的敏感性測定五株立枯絲核菌敏感菌株，菌株編號分別為FBS-3，B310, D179，JHT158-3, E67 ;十株立枯絲核菌抗性菌株，菌株編號分別為J-3，J-3-1，J-24，J-20, B-I, B-1-31, J-14，J-6，J-I 和 T2。馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基馬鈴薯200g，瓊脂粉14g，葡萄糖18g，蒸餾水定容至1L，121°C濕熱滅菌20分鐘。
I、實驗步驟如下I)將噻呋酰胺用二甲基亞砜(DMSO)配成105μ g/ml的母液。對于立枯絲核菌敏感菌株的敏感性測定，將噻呋酰胺逐級稀釋成500 μ g/mL, 100 μ g/mL, 50 μ g/mL, 25 μ g/mL, 10 μ g/mL的濃度梯度；對于立枯絲核菌抗性雜合菌株的敏感性測定，將供試藥劑噻呋酰胺逐級稀釋成 2 X IO4 μ g/mL, 5 X IO3 μ g/mL, I. 5 X IO3 μ g/mL, 500 μ g/mL, 200 μ g/mL 的濃度梯度；對于立枯絲核菌抗性純合菌株的敏感性測定，將供試藥劑噻呋酰胺逐級稀釋成 2 X IO5 μ g/mL, 8 X IO4 μ g/mL, IO4 μ g/mL, 5 X IO3 μ g/mL, 2. 5 X IO3 μ g/mL, IO3 μ g/mL,500 μ g/mL的濃度梯度。2)用移液槍吸取噻呋酰胺藥液60 μ I加入已滅菌的冷卻至45°C的60ml PDA培養基中，使溶劑含量為1%。，混勻，將帶藥的培 養基倒入直徑為9cm的培養皿中，設只加60 μ I二甲基亞砜的處理為空白對照，每個比例藥劑設3次重復。3)立枯絲核菌在PDA平板上培養3天后，沿菌落邊緣用打孔器打取直徑為O. 5cm的菌餅，菌絲面向下接種于步驟2)中的帶藥和對照培養基中，置于28°C培養箱中黑暗培養，I. 5d后測量菌落直徑。4)十字交叉法測量菌落直徑，根據菌落平均直徑值計算出各濃度藥劑對供試菌株菌絲生長的抑制率。然后將抑制率轉化成機率值(Y)，藥劑濃度轉換成以10為底的對數值(X)，在Microsoft Excel中作回歸直線，求出噻呋酰胺對立枯絲核菌的毒力回歸曲線方程Y=a+bX,以及相關系數r和有效抑制中濃度EC5tl值，并計算抗性倍數。
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抗性感菌株的ECso
抗件倍數= ____
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敏慼菌株I 平均EC502.結果表I.立枯絲核菌對噻呋酰胺的敏感性
權利要求
1.一種檢測或輔助檢測水稻紋枯病菌中SdhB基因是否存在突變位點的方法，包括如下步驟 以待測水稻紋枯病菌的基因組DNA為模板，用SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示引物對進行PCR擴增，若能擴增出條帶，則所述待測水稻紋枯病菌中sdhB基因存在或候選存在突變位點； 所述突變位點指水稻紋枯病菌中sdhB基因的基因組序列自5’末端起第975位核苷酸為C和T雜合或T純合。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述PCR擴增中，退火溫度為56°C。
3.—種檢測或輔助檢測水稻紋枯病菌中sdhB基因是否存在突變位點的方法，包括如下步驟 以待測水稻紋枯病菌的基因組DNA為模板，擴增得到sdhB基因，再用NlaIV酶切所得sdhB基因，若酶切產物中含有230bp片段，則所述待測水稻紋枯病菌中sdhB基因存在或候選存在突變位點； 所述突變位點指水稻紋枯病菌中sdhB基因的基因組序列自5’末端起第975位核苷酸為C和T雜合或T純合。
4.一種檢測或輔助檢測水稻紋枯病菌中sdhB基因是否存在突變位點的引物對，由SEQID NO 1和SEQ ID NO 2所示DNA分子組成。
5.水稻紋枯病菌中sdhB基因的一個突變位點，為水稻紋枯病菌中sdhB基因的基因組序列自5’末端起第975位核苷酸為C和T雜合或T純合。
6.水稻紋枯病菌中sdhB蛋白的一個突變位點，為水稻紋枯病菌中sdhB蛋白的自N端起第249位氨基酸為組氨酸與酪氨酸雜合或純合的酪氨酸。
7.權利要求5或6所述突變位點在鑒定水稻紋枯病菌抗藥性中的應用；所述抗藥性為抗噻呋酰胺。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于存在所述突變位點的水稻紋枯病菌具有或候選具有抗藥性。
9.SEQ ID NO 3所示蛋白。
10.SEQ ID NO 4 所示基因。
全文摘要
本發明涉及及一種鑒定水稻紋枯病菌Sdh基因核苷酸點突變及其對噻呋酰胺抗藥性的分子檢測方法和專用引物。屬于分子生物學技術領域。該引物對，由SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示核苷酸序列組成。本發明提供的檢測水稻紋枯病菌對噻呋酰胺產生抗藥性的點突變的方法，具有高靈敏度、簡單快速、穩定性好的特點，可以有效地區分敏感菌株和抗藥性菌株，用于檢測田間水稻紋枯病菌對噻呋酰胺的抗性發生發展動態。本發明對于抗性病害的早期預警，以及制定合理的病害管理方案、有效控制抗藥性病害發展具有重要意義。
文檔編號C12Q1/02GK102864220SQ201210281520
公開日2013年1月9日 申請日期2012年8月9日 優先權日2012年8月9日
發明者劉西莉, 牟文君, 李波濤, 劉鵬飛, 李健強, 王厚涵, 林東 申請人:中國農業大學