專利名稱：一種2-酮基-l-古龍酸高耐受型氧化葡糖酸桿菌及其在維生素c發酵生產中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種2-酮基-L-古龍酸高耐受型菌種一氧化葡糖酸桿菌TL-1045及其在維生素C發酵生產中的應用，具體為其在發酵制備維生素C中間體2-酮基-L-古龍酸及維生素C中的應用，屬于微生物發酵生產領域。
背景技術：
維生素C又稱L-抗壞血酸，它能參與體內多種氧化還原反應及羥化反應，是一類重要的細胞代謝氧化還原化合物，在人體內起到必不可少的重要生理作用，如治療人類壞血病，增強人體抵抗力。綠色植物能夠自己合成維生素C，然而人和許多動物由于身體肝臟中缺少古洛內酯氧化酶，因此不能自己合成，必須從外界攝取。目前維生素C已廣泛應用于 醫藥、食品、保健品和化妝品等領域。并且隨著其用途的開發和人們物質文化生活水平的提高,對維生素C的需求量也不斷增加。1933年，德國化學家Reichstein等發明了以化學合成法為主的萊氏法，是最早工業化生產維生素C的方法，但此法合成路線過長，有毒有害的中間產物以及有機原料消耗量多，需要生產商在環境污染防治方面進行較大的投入，導致維生素C生產成本較高。七十年代初，我國首創了維生素C 二步發酵法并將其應用于工業生產。該法在萊氏法一步發酵的基礎上，采用混菌發酵，使山梨糖轉化為2-酮基-L-古龍酸，工藝簡單、成本低、無污染，是目前維生素C工業生產的主要方法。維生素C 二步發酵法，第一步是在醋酸桿菌作用下將D-山梨醇氧化為L-山梨糖，此步發酵工藝成熟，發酵周期約為20-30 h，且轉化率很高，現已能達98%以上；第二步是將L-山梨糖進一步氧化生成2-酮基-L-古龍酸，此步發酵由兩種微生物混菌發酵進行，一種為氧化葡糖酸桿菌，俗稱小菌，另一種常采用巨大芽孢桿菌，俗稱大菌。小菌能夠轉化山梨糖生成2-酮基-L-古龍酸，但其單獨培養生長較弱；大菌不能產酸，但和小菌混合培養，能夠顯著促進小菌產酸。目前維生素C生產第二步發酵，發酵周期約為40-50 h，產物濃度約為80-95 g/L，轉化率約為80-95%。第二步發酵周期長、產物濃度和轉化率相對較低，因此是限制維生素C發酵生產效率的關鍵環節。為了進一步提高維生素C發酵的生產效率，近年來許多研究機構對維生素C第二步發酵進行了研究。專利200910148114. X公開了一種維生素C第二步發酵菌種制備方法，菌種茄瓶制備過程中，先將小菌接種茄瓶，培養16-48 h，然后再接種大菌，繼續培養24-72h，這種條件下，可以提高小菌在混菌中的比例，提高菌種活力，發酵45 h，2-酮基-L-古龍酸可達到100 g/L，轉化率達到90%左右，該方法效率有所提高，但是發酵時間較長。專利200910069697. 7公開了一種在發酵過程中添加巰基化合物來取代大菌促進小菌的生長和產酸，但其實際生產效率仍低于大、小菌混菌發酵的效率。專利200910034773. 0公開了一種強化2-酮基-L-古龍酸生產強度的方法，通過添加海藻糖，提高菌體對古龍酸的耐受性，發酵52 h，2-酮基-L-古龍酸可達到69. 38 g/L，該方法需要添加海藻糖，海藻糖價格較高，導致生產成本上升，不具有實用性。
發明內容
本發明針對現有技術中氧化葡糖酸桿菌對2-酮基-L-古龍酸耐受性較差，導致維生素C生產中第二步發酵效率低下的問題，提供了一種2-酮基-L-古龍酸高耐受型氧化葡糖酸桿菌TL-1045，該菌種2-酮基-L-古龍酸耐受性強，在二步發酵中轉化L-山梨糖的效率高，所得2-酮基-L-古龍酸產率顯著提高。本發明還提供了該菌種在維生素C發酵生產中的應用，具體為其在維生素C及其中間體2-酮基-L-古龍酸發酵制備中的應用。發明人經過大量實驗研究，發現對2-酮基-L-古龍酸耐受性越強的氧化葡糖酸桿 菌菌株，其和巨大芽孢桿菌混菌發酵轉化山梨糖生產2-酮基-L-古龍酸的效率越高，推測可能是2-酮基-L-古龍酸耐受性強的菌株解除了產物反饋抑制效應，使得在第二步發酵過程中后期，高2-酮基-L-古龍酸濃度下，菌體生長和合成產物效率提高。針對這一發現，發明人通過對現有生產菌株氧化葡糖酸桿菌TL-347進行反復多次紫外誘變篩選，選育得到了本發明2-酮基-L-古龍酸高耐受型氧化葡糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)TL-1045(即該菌種能耐高濃度2-酮基-L-古龍酸)。本發明氧化葡糖酸桿菌(Gluconobacteroxydans) TL-1045,已由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏,保藏編號為CGMCC NO. 6188，保藏日期為2012年6月6日。以篩選得到的氧化葡糖酸桿菌TL-347為出發菌株，TL-347對2_酮基-L-古龍酸的耐受濃度為85 g/L，發酵生產2-酮基-L-古龍酸的產量約為95 g/L。氧化葡糖酸桿菌TL-1045的誘變篩選過程為挑取出發菌株氧化葡糖酸桿菌TL-347的單菌落，接入裝有玻璃珠的無菌三角瓶中，加30 ml無菌生理鹽水，150 rpm震蕩20 min，將菌落打散，制成菌懸液。取菌懸液5 ml加入培養皿中，于40瓦紫外燈下,20-40 cm處照射I min、5 min、10 min,然后將三個處理的菌懸液分別稀釋至10_3-10_5，涂布含有篩選培養基(2-酮基-L-古龍酸90-130 g/L，山梨糖15 g/L，胰蛋白胨3 g/L，尿素0.1 g/L，玉米漿4 8/1，牛肉膏1.2 g/L,酵母膏I. 2 g/L，磷酸二氫鉀I g/L，硫酸鎂0.2 g/L，瓊脂粉17 g/L,pH 6. 7)的平板中，避光培養72 h，挑取平板上的菌落，分別和巨大芽孢桿菌搭配，然后混菌接發酵搖瓶，檢測發酵產2-酮基-L-古龍酸效率，將初步篩選的菌株反復多次誘變得到本發明中的2-酮基-L-古龍酸高耐受型氧化葡糖酸桿菌TL-1045，其在110 g/L或更高濃度的2-酮基-L-古龍酸中能夠正常生長繁殖，其與巨大芽孢桿菌混菌發酵所得發酵液中2-酮基-L-古龍酸產量在125g/L以上，L-山梨糖對2-酮基-L-古龍酸的轉化率在90%以上。對氧化葡糖酸桿菌TL-1045的分類學特征進行研究，如下
一、氧化葡糖酸桿菌TL-1045的菌體和菌落形態見表I。
上述氧化葡糖酸桿菌TL-1045可用于維生素C發酵生產中，具體的為用其發酵生產維生素C中間體2-酮基-L-古龍酸，步驟包括以巨大芽孢桿菌(簡稱大菌，下同)為伴生菌，與氧化葡糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans) TL-1045 (簡稱小菌,下同)組成混合菌種進行混菌有氧發酵，以L-山梨糖為原料進行混菌有氧發酵，將L-山梨糖轉化為2-酮基-L-古龍酸。混菌發酵的培養基中除了 L-山梨糖外，還含有碳源、氮源、無機鹽等營養成分。進一步的，維生素C中間體2-酮基-L-古龍酸的制備方法包括以下步驟
(1)菌種的活化將用茄瓶保存的巨大芽孢桿菌和氧化葡糖酸桿菌用活化培養基洗下，然后在活化培養基中于27-32°C下培養18-24 h，得活化的菌種液；
(2)菌種的分離純化在無菌條件下，用無菌生理鹽水將步驟(I)得到的活化菌種液進行梯度稀釋，取10_5-10_7稀釋液0. I ml涂布在平板上，平板在27-32°C下培養4_6天；
(3)混菌的培養用接種環將步驟(2)中10-25個平板上培養得到的全部氧化葡糖酸桿菌菌落挑取到0. 2ml無菌生理鹽水中，制成氧化葡糖酸桿菌菌懸液；然后從步驟(2)中平板上選擇色白、飽滿且邊緣整齊的巨大芽孢桿菌菌落，用接種環在巨大芽孢桿菌菌落內環和外環之間挑取針尖大小的巨大芽孢桿菌接到氧化葡糖酸桿菌菌懸液中，攪拌混勻制得混菌懸液；取混菌懸液0. 05-0. I ml接種到茄瓶培養基中，涂布均勻，27-32 °C培養3_5天；
(4)種子液的制備將步驟(3)中茄瓶培養得到的混菌用種子培養基洗下，接種到盛有種子培養基的搖瓶中，在27-32°C、80-250 rpm的條件下培養18-24 h，得種子液，每個茄瓶接種兩個搖瓶；
(5)種子液的擴大培養將步驟(4)得到的種子液按5-20%的接種量接種到擴大培養基中，在 80-250 rpm、通氣比 0. 3-0. 8 L/L*min、27_32°C條件下培養 20-30 h ；
(6)發酵培養將步驟(5)擴大培養所得的種子液按5-20%接種量接種到發酵培養基中，在80-250 rpm、通氣比0. 3-0. 8 L/L*min、27_32°C條件下培養25-40 h，發酵過程中流加堿性物質溶液控制PH始終為6. 7-7. 3，L-山梨糖下降到5-15 g/L時，流加L-山梨糖保持L-山梨糖濃度為10-25 g/L。上述方法中，步驟(I)中活化培養基的組成為山梨糖5-15 g/L，葡萄糖2-5 g/L,酵母膏 3-8 g/L，玉米漿 3-10 g/L，尿素 0.05-0. 2 g/L, pH 6. 7-7. 2。上述方法中，步驟(2)中平板培養基組成為山梨糖5-20 g/L，胰蛋白胨1-5 g/L,尿素0.05-0. 2 g/L，玉米漿2-6 g/L，牛肉膏0.5-2 g/L，酵母膏0. 5-2. 0 g/L，磷酸二氫鉀
0.5-1. 5 g/L，硫酸鎂 0. 1-0. 3 g/L，瓊脂粉 17 g/L, pH 6. 7-7. 2。上述方法中，步驟(3)中茄瓶培養基組成為山梨糖3-8 g/L，酵母膏2-6 g/L，硫酸鎂 1-3 g/L，瓊脂粉 17 g/L, pH 6. 7-7. 2。上述方法中，步驟(4)中種子培養基的組成為山梨糖8-20 g/L，葡萄糖1-5 g/L,玉米漿 5-12 g/L，尿素 0. 05-0. 2 g/L, pH 6. 7-7. 2。上述方法中，步驟(5)中擴大培養基組成為山梨糖8-20 g/L，葡萄糖1-5 g/L，玉米漿 5-12 g/L，尿素 0. 05-0. 2 g/L, pH 6. 7-7. 2。上述方法中，步驟(6)中發酵培養基組成為山梨糖20-30 g/L，玉米漿5-12 g/L,尿素 0. 05-0. 2 g/L, pH 6. 7-7. 3。上述方法中，步驟(6)中發酵時間優選為32-35 h，此外，步驟(6)中流加的堿性物質溶液可以是碳酸鈉溶液、碳酸鉀溶液、氫氧化鈉溶液、氫氧化鉀溶液等。上述2-酮基-L-古龍酸的發酵方法中，所用的伴生菌巨大芽孢桿菌無產酸作用，但能顯著促進氧化葡糖酸桿菌TL-1045的產酸能力，本發明所用的巨大芽孢桿菌為現有技術中公開的普通巨大芽孢桿菌，可以在市場上買到。、
上述氧化葡糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans) TL-1045還可以用于維生素C 二步發酵中，將L-山梨糖高效率轉化為2-酮基-L-古龍酸。本發明的上述技術方案與現有技術相比具有以下優點
I、本發明中氧化葡糖酸桿菌TL-1045經過物理誘變所得，在含有110 g/L 2-酮基-L-古龍酸的培養基中正常生長繁殖，解除了維生素C生產第二步發酵中產物對菌體的反饋抑制，發酵生產2-酮基-L-古龍酸的產量可達到125 g/L以上，較初始菌株的產量有顯著性提高，且傳代穩定，高于目前文獻報道的2-酮基-L-古龍酸發酵生產效率。2、將本發明氧化葡糖酸桿菌TL-1045用于維生素C發酵生產中簡單易行，能夠顯著提高維生素C第二步發酵的生產效率，提高2-酮基-L-古龍酸的產量，降低維生素C生產成本。保藏信息
本發明氧化葡糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans) TL-1045 (即2_酮基_L_古龍酸高耐受型氧化葡糖酸桿菌)已由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC No. 6188，保藏日期為2012年6月6日。
為了使本發明的內容更容易被清楚的理解，下面根據本發明的具體實施例并結合附圖，對本發明作進一步詳細的說明，其中
圖I為本發明所述的氧化葡糖酸桿菌TL-1045和巨大芽孢桿菌混菌發酵過程中的鏡檢圖片，圖中大型桿菌為巨大芽孢桿菌，小型球菌為氧化葡糖酸桿菌TL-1045。
具體實施例方式根據下述實施例，可以更好地理解本發明。但是本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的具體工藝條件、物料配比及其結果僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所描述的本發明。以下實施例中所用2-酮基-L-古龍酸高耐受型氧化葡糖酸桿菌TL-1045簡稱為小菌，已由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為=CGMCCN0.6188，保藏日期為2012年6月6日；所用巨大芽孢桿菌為巨大芽孢桿菌ATCC 14581，簡稱為大菌，購于上海復祥生物科技有限公司。以下實施例中所用氧化葡糖酸桿菌TL-1045是以現有生產菌株氧化葡糖酸桿菌TL-347 (保藏于本單位研發中心)為出發菌株，通過紫外誘變處理獲得，其在110 g/L或更高濃度的2-酮基-L-古龍酸中能夠正常生長繁殖。下述實施例中所用到的TL-1045菌種和巨大芽孢桿菌接種在同一茄瓶中在冰箱中進行保存，溫度在4°C左右，在使用時將茄瓶上保存的大、小菌洗下進行活化等處理進行進一步的應用。保存所用的培養基為山梨糖3-8 g/L，酵母膏2-6 g/L，硫酸鎂1-3 g/L,瓊脂粉 17 g/L, pH 6. 7-7. 2。實施例I
氧化葡糖酸桿菌TL-1045的誘變篩選
挑取出發菌株氧化葡糖酸桿菌TL-347的單菌落，接入裝有玻璃珠的無菌三角瓶中，力口30 ml無菌生理鹽水，150 rpm震蕩20 min，將菌落打散，制成菌懸液。取5 ml菌懸液加入培養皿中，于40瓦紫外燈下，20-40 cm處照射I min、5 minUO min，然后將三個處理的菌懸液分別稀釋至10_3_10_5，涂布含有篩選培養基(2-酮基-L-古龍酸110 g/L，山梨糖15 g/L，胰蛋白胨3 g/L，尿素0. I g/L，玉米漿4 8/1，牛肉膏1.2 8/1，酵母膏1.2 g/L，磷酸二氫鉀I g/L，硫酸鎂0. 2 g/L，瓊脂粉17 g/L, pH 6. 7)的平板中，避光培養72 h，挑取平板上的菌落，分別和巨大芽孢桿菌搭配，然后混菌接發酵搖瓶，檢測發酵產2-酮基-L-古龍酸效率，將初步篩選的菌株反復誘變多次，獲得多株古龍酸高耐受型氧化葡糖酸桿菌菌株(見表3)，其中氧化葡糖酸桿菌TL-1045對2-酮基-L-古龍酸高耐受性最好，發酵產酸最高。
表3不同葡■糖酸桿菌菌株對2" 基-L-古龍Klt受性及產簾水平
權利要求
1.一種2-酮基-L-古龍酸高耐受型菌種，其特征是所述菌種為氧化葡糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)TL_1045,該菌種已于2012年6月6日保藏至中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO. 6188。
2.—種維生素C中間體2-酮基-L-古龍酸的發酵方法，其特征是，步驟包括以巨大芽孢桿菌為伴生菌，與權利要求I所述的氧化葡糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)TL_1045組成混合菌種，以L-山梨糖為原料進行混菌有氧發酵，將L-山梨糖轉化為2-酮基-L-古龍酸。
3.根據權利要求2所述的發酵方法，其特征是，具體包括以下步驟 (1)菌種的活化將用茄瓶保存的巨大芽孢桿菌和氧化葡糖酸桿菌用活化培養基洗下，然后在活化培養基中于27-32°C下培養18-24 h，得活化的菌種液； (2)菌種的分離純化用無菌生理鹽水將步驟(I)得到的活化菌種液進行梯度稀釋，取10_5-10_7稀釋液0. I ml涂布在平板上，然后將平板在27-32 °C下培養4_6天； (3)混菌的培養用接種環將步驟(2)中10-25個平板上培養得到的全部氧化葡糖酸桿菌菌落挑取到0. 2 ml無菌生理鹽水中，制成氧化葡糖酸桿菌菌懸液；然后從步驟(2)中平板上選擇巨大芽孢桿菌菌落，用接種環在巨大芽孢桿菌菌落內環和外環之間挑取針尖大小的巨大芽孢桿菌接到氧化葡糖酸桿菌菌懸液中，攪拌混勻制得混菌懸液；取混菌懸液0.05-0. I ml接種到茄瓶培養基中，涂布均勻，27-32 °C培養3_5天； (4)種子液的制備將步驟(3)中茄瓶培養得到的混菌用種子培養基洗下，接種到盛有種子培養基的搖瓶中，在27-32°C、80-250 rpm的條件下培養18-24 h，得種子液，每個茄瓶接種兩個搖瓶； (5)種子液的擴大培養將步驟(4)得到的種子液按5-20%的接種量接種到擴大培養基中，在 80-250 rpm、通氣比 0. 3-0. 8 L/L min、27_32°C條件下培養 20-30 h ； (6)發酵培養將步驟(5)擴大培養所得的種子液按5-20%接種量接種到發酵培養基中，在80-250 rpm、通氣比為0. 3-0. 8 L/L.min、27-32°C條件下培養25-40 h，發酵過程中流加堿性物質溶液控制PH始終為6. 7-7. 3，L-山梨糖下降到5-15 g/L時，流加L-山梨糖保持L-山梨糖濃度為10-25 g/L。
4.根據權利要求3所述的發酵方法，其特征是步驟(I)中活化培養基的組成為山梨糖 5-15 g/L,葡萄糖 2-5 g/L,酵母膏 3-8 g/L,玉米衆 3-10 g/L,尿素 0. 05-0. 2 g/L, pH6. 7-7. 2。
5.根據權利要求3所述的發酵方法，其特征是步驟(2)中平板培養基組成為山梨糖 5-20 g/L，胰蛋白胨 1-5 g/L，尿素 0.05-0. 2 g/L，玉米漿 2-6 g/L，牛肉膏 0.5-2 g/L,酵母膏 0.5-2. 0 g/L，磷酸二氫鉀 0.5-1. 5 g/L，硫酸鎂 0. 1-0. 3 g/L，瓊脂粉 17 g/L, pH6.7-7. 2。
6.根據權利要求3所述的發酵方法，其特征是步驟(3)中茄瓶培養基組成為山梨糖3-8 g/L，酵母膏 2-6 g/L，硫酸鎂 1-3 g/L，瓊脂粉 17 g/L, pH 6. 7-7. 20
7.根據權利要求3所述的發酵方法，其特征是步驟(4)中種子培養基的組成為山梨糖 8-20 g/L，葡萄糖 1-5 g/L，玉米漿 5-12 g/L，尿素 0. 05-0. 2 g/L, pH 6. 7-7. 2 ;步驟(5)中擴大培養基組成為山梨糖8-20 g/L，葡萄糖1-5 g/L，玉米漿5-12 g/L，尿素0. 05-0. 2g/L, pH 6. 7-7. 2。
8.根據權利要求3所述的發酵方法，其特征是步驟(6)中發酵培養基組成為山梨糖20-30 g/L，玉米漿 5-12 g/L，尿素 0. 05-0. 2 g/L, pH 6. 7-7. 3。
9.根據權利要求3所述的發酵方法，其特征是步驟(6)中發酵時間為32-35h。
10.一種維生素C的制備方法，采用二步發酵法制備維生素C，其特征是采用權利要求2-9中任一項所述的維生素C中間體2-酮基-L-古龍酸的發酵方法將L-山梨糖轉化為2-酮基-L-古龍酸。
全文摘要
本發明公開了一種2-酮基-L-古龍酸高耐受型氧化葡糖酸桿菌(Gluconobacteroxydans)TL-1045，還提供了該菌株在維生素C發酵生產中的應用。本發明提供的氧化葡糖酸桿菌TL-1045能夠耐受高濃度的2-酮基-L-古龍酸，解除了維生素C發酵生產第二步中產物對菌體的反饋抑制，2-酮基-L-古龍酸的產量可達到125g/L以上，使得維生素C生產效率顯著提高，有效降低了維生素C的生產成本。
文檔編號C12R1/01GK102757928SQ20121028143
公開日2012年10月31日 申請日期2012年8月9日 優先權日2012年8月9日
發明者付吉明, 劉敏, 莊祎, 張全景, 王喬隆, 鄭秀寧 申請人:山東天力藥業有限公司