一種單克隆雜交瘤的制備方法

專利名稱：一種單克隆雜交瘤的制備方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種單克隆雜交瘤的制備方法。
背景技術：
自從Kohler和Milstein發明單克隆抗體技術以來,該技術不斷發展完善,在生物醫藥領域疾病的診斷、治療以及科學研究中得到了廣泛應用，市場需求越來越大。但制備單克隆抗體一個必不可少的環節而且也是最重要環節就是陽性雜交瘤的克隆建系。融合后篩選出的雜交瘤細胞群系不完全是純系，仍屬于異質性的細胞群。因此，必須根據實驗目的對雜交細胞群體進一步純化，以便獲得同質性的細胞群體。最常用的純化方法就是雜交瘤細胞的克隆化培養。克隆化培養是指單個雜交細胞在一個獨立的空間增值，最終擴增為一群相對較純 的，且能夠穩定表達某些特定性狀的細胞群體的培養方式。用于這種方法的細胞群體由于均來源于同一個祖先細胞，故可認為其遺傳特性較為一致。常見的克隆化培養方法有以下五種I :有限稀釋法這是一種比較傳統的方法，即將ELISA檢測出的陽性孔，稀釋到4-8細胞/mL。取20mL放入96孔培養板中培養。這樣約有36%的孔含有I個細胞，當細胞長到2(Γ80%孔底時，用ELISA檢測，將檢測出的陽性孔按照上述方法再克隆，直到所有具有雜交瘤的孔中都呈陽性，即陽性率需達到100%。此亞克隆方法的缺點有1、對細胞的計數要求非常高；2、由于陽性的克隆容易被陰性的克隆所排擠，導致陽性克隆容易丟失；3、由于需要反復克隆再克隆，細胞培養的工作量大、操作繁瑣、克隆效率低。因此，它不能適應需要建立幾十株以上雜交瘤的功能性抗體篩選的研究。但用甲基纖維素制成半固體培養基可以克服以上方法的局限性，直接進行克隆化的培養，提高了工作效率。2 甲基纖維素半固體培養基一步法國內外均有報道選用甲基纖維素半固體培養基法篩選雜交瘤細胞，此法是將細胞接種于半固體培養基里使細胞以分散的方式單個生長，增值后的細胞后代不能遷移，只是在祖先細胞鄰近形成細胞集落，然后挑出這些細胞集落再進行擴大培養，獲得較純的雜交瘤細胞群體的方法。半固體培養基最常見的有軟瓊脂培養基和甲基纖維素培養基。但這個方法應用并不廣泛，主要原因是在甲基纖維素半固體培養環境下，雜交瘤細胞生長受到限制，其生長狀態不如液體培養基好，原因可能是因為甲基纖維素限制雜交瘤細胞葡萄糖的利用，增加了氨基酸的消耗。由于融合后的細胞膜較脆弱，其最適的培養基是液體培養基，因而不容易在半固體培養基中生長。因而用甲基纖維素半固體培養基一步法需要加入昂貴的細胞因子等來促進雜交瘤的存活，才有利于簡化實驗步驟，但是很多細胞因子的成份都是商業化的，因此其缺點就是增加了成本。軟瓊脂半固體培養基法，此方法由于瓊脂粉中存在有對細胞有毒性的物質，容易導致細胞長出來的較少，同時由于瓊脂在室溫下操作容易凝固，故需要在較高的溫度下加入細胞，由于溫度控制不好，可能直接導致細胞死亡。
3 :凝血素半固體培養基法此種方法需要使用凝血因子使得培養基凝固，使得雜交瘤長出來的較少，因此不太常用。4:單細胞顯微技術這一方法是通過顯微操作分離單個雜交細胞，然后將其植入單個培養空間，最終獲得單個雜交細胞的后代。但用于顯微操作的雜交細胞應具備可辨認的獨特形態學特征，并且需借助倒置顯微鏡。5:熒光激活分選此方法是采用激活分選儀進行的。方法是用熒光物質標記特選的雜交細胞，然后將細胞懸液通過分選以上的細胞噴嘴，可形成單個細胞液滴。此法的基本原理是被熒光標 記的待選細胞在激光照射下能夠發射熒光，再通過調整儀器參數使發射不同熒光的單個細胞液滴帶不同電荷，這些具有不同電荷的細胞液滴在電場中的偏轉角度不同，因此利用這一原理通過電腦處理，可分離不同雜交瘤。加入特定的熒光物質，這些熒光物質能夠特異性的在陽性雜交瘤的周圍形成激光激發下的明亮的熒光光環，從而使得陽性雜交瘤的篩選和亞克隆一步到位，大大節約了時間和勞力，但是由于其專利的技術和高昂的設備及試劑費用阻礙著其成為一種常規的單抗生產方法。

發明內容
發明目的本發明的目的是提供一種成本低、效率高的單克隆雜交瘤的制備方法。技術方案本發明提供的一種單克隆雜交瘤細胞的制備方法，包括以下步驟(I)融合使用聚乙二醇水溶液融合骨髓瘤細胞與抗原免疫后的淋巴細胞，得融合細胞；(2)培養將融合細胞接入次黃嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧啶(HAT)液體培養基中于二氧化碳培養箱中培養，得雜交瘤細胞；(3)篩選將步驟(2)中含雜交瘤細胞的HAT液體培養基的上清液采用間接ELISA篩選，得陽性雜交瘤細胞；(4)亞克隆將陽性雜交瘤細胞接入亞克隆半固體培養基中于二氧化碳培養箱培養，得單個雜交瘤細胞集落；(5)擴大培養取單個雜交瘤細胞集落的細胞接入胎牛血清培養液中于二氧化碳培養箱中擴大培養，即得單克隆雜交瘤細胞。作為本發明單克隆雜交瘤細胞的制備方法的一種優選，步驟(I)中，所述淋巴細胞為小鼠脾細胞，所述骨髓瘤細胞包括sp2/0細胞或NS-I細胞。作為本發明單克隆雜交瘤細胞的制備方法的另一種優選，步驟(I)中，所述淋巴細胞與骨髓瘤細胞的細胞數量比為(10-2):1，所述聚乙二醇的分子量為1000-6000，所述聚乙二醇水溶液的體積分數為40-60%。作為本發明單克隆雜交瘤細胞的制備方法的另一種優選，步驟(I)中，將融合細胞接入含胎牛血清培養液中于二氧化碳培養箱中培養；從而使融合細胞生長更好，獲得更多的融合細胞，有利于步驟(2)的進一步培養。作為進一步優選，所述胎牛血清培養液的胎牛血清體積百分比為10% -20%,所述培養箱中二氧化碳濃度為5-7%，培養溫度為25-37°C，培養時間為16-24h。作為本發明單克隆雜交瘤細胞的制備方法的另一種優選，步驟(2)中，HAT液體培養基為HAT水溶液，其中HAT的體積百分比為2-5%，培養箱中二氧化碳濃度為5_7%，培養溫度為25-37°C，培養時間8-12d。作為本發明單克隆雜交瘤細胞的制備方法的另一種優選，步驟(4)中所述亞克隆半固體培養基的配方為谷氨酰胺I水溶液O. 1-1. OmL,體積分數O. 25 % -2. 5% ；非必需氨基酸水溶液(MEM)O. 1-1. OmL,體積分數O. 25% -2. 5% ；
β —巰基乙醇O. 1-1. OmL,體積分數 O. 25% -2. 5% ；次黃嘌呤-胸腺嘧啶(HT)水溶液 O. 1-1. OmL,體積分數O. 25% -2. 5% ；
青霉素及鏈霉素水溶液O. 1-1. OmL,體積分數O. 25%—2. 5% ；胎牛血清水溶液5-10mL，體積分數12. 5% — 25% ;甲基纖維素O. l_lg, 2. 5mg/ml—25mg/ml ；DMEM 高糖水溶液25_35mL，體積分數 62. 5%—87. 5%。作為本發明單克隆雜交瘤細胞的制備方法的另一種優選，步驟(4)中，所述培養箱中二氧化碳濃度為5-7%，培養溫度為25-37°C，培養時間為7-14天。作為本發明單克隆雜交瘤細胞的制備方法的另一種優選，步驟(5)中，所述培養液為體積百分比的10%-20%胎牛血清培養液，所述培養箱中二氧化碳濃度為1_5%，培養溫度為25-37 °C，培養時間為3-5天。有益效果本發明提供的單克隆雜交瘤細胞的制備方法培養周期短、成本低、篩得的陽性克隆細胞株全。該方法首先采用液體培養基培養融合細胞，并通過HAT液體培養基篩選得陽性雜交瘤細胞，最后用未添加細胞因子的亞克隆半固體培養基對陽性雜交瘤細胞培養制備得到單克隆雜交瘤細胞。該方法通過控制亞克隆半固體培養基中甲基纖維素的含量，在二氧化碳培養箱中培養，得到大量肉眼可見的單個雜交瘤細胞集落，該方法與現有技術相比，其顯著優點是—是,米用液體培養基培養融合細胞可以使剛融合的細胞處于好的生長狀態，從而保證篩到所有的陽性克隆細胞株，有效避免了融合細胞在半固體培養基中成活率低的問題；二是，亞克隆半固體培養基采用甲基纖維素培養基，一方面該培養基制備方法簡單，粘度易控制，細胞在其中可呈現單克隆集落生長，另一方面基纖維素對細胞的毒性小，甲基纖維素半固體培養基適合于雜交瘤細胞的生長；因此只需一次亞克隆即可得到單克隆，大大縮短了亞克隆過程中的時間和減輕了亞克隆的工作量。三是，亞克隆在液體培養基培養之后進行，此時雜交瘤細胞達到較好狀態，因此半固體培養基中不添加細胞因子也能使得單個雜交瘤細胞長出來，大大的降低了生產成本。


圖Ia為在甲基纖維素半固體培養基中生長的雜交瘤細胞群。圖Ib為在顯微鏡下甲基纖維素半固體培養基中生長的單個雜交瘤細胞群(放大10 倍)。圖2為單克隆抗體亞型鑒定結果圖。
具體實施例方式根據下述實施例，大家可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。所用試劑I、甲基纖維素(Methyl cellulose) (Sigma, CAT:9004-67-5)2、DMEM 高糖水溶液(Hyclone, CAT:SH3OO22. 01B) 3、β —巰基乙醇(2-ME)(Sigma, CAT: M3148)4、0·22μπι 濾膜(Millipore, CAT: SL⑶33RB)5、次黃嘌呤-胸腺嘧啶(HT)水溶液 (Gibco，CAT: 21060-017)6、胎牛血清水溶液(Hyclone, CAT;SV30087. 02)7、谷氨酸胺 I 水溶液(Invitrogen, CAT:35050061)8、非必需氨基酸(MEM)水溶液(Gibco, CAT: 11140-050)9、青霉素及鏈霉素水溶液(Hyclone, CAT:SV30010)所用溶液及培養基配制方法(I)甲基纖維素母液稱取甲基纖維素固體于三角燒瓶中，加入干凈的轉子。使用鋁箔紙密封后，高溫高壓滅菌。在無菌的條件下加入冰冷的DMEM高糖溶液后，4°C快速攪拌12-24小時，直至甲基纖維素全部溶解。(2) β —巰基乙醇母液取β —巰基乙醇加入DMEM高糖溶液中，使用0. 22 μ m的濾膜過濾除菌。(3)亞克隆半固體培養基在在滅好菌的50mL離心管中依次加入以下配方并上下顛倒劇烈混勻6_10次。谷氨酰胺I水溶液市售0. 1-1. OmL,在培養基中體積分數0. 25% -2. 5% ；非必需氨基酸水溶液市售0. 1-1. OmL,在培養基中體積分數0. 25% -2. 5% ；β —巰基乙醇市售0. 1-1. OmL，在培養基中體積分數0. 25% -2. 5% ；次黃嘌呤-胸腺嘧啶水溶液市售0. 1-1. OmL,在培養基中體積分數0. 25%—2. 5% ；青霉素及鏈霉素水溶液市售0. 1-1. OmL，在培養基中體積分數0.25%—
2.5% ；胎牛血清水溶液市售 5-10mL，在培養基中體積分數12. 5%—25% ；甲基纖維素市售0. Ι-lg,在培養基中濃度為2. 5mg/ml—25mg/ml ；DMEM高糖水溶液市售 25-35mL，在培養基中體積分數62. 5%—87. 5%。
實施例I克隆雜交瘤細胞的制備。I.融合取常規免疫后的小鼠的脾細胞與狀態好的sp2/0細胞，控制脾細胞和sp2/0細胞數量比在5 :1，使用體積分數為50%的PEG 4000融合；可選地，也可以控制脾細胞和sp2/0細胞數量比在(10-2) :1之間，也可以選擇分子量范圍在1000-6000的PEG。將融合后的細胞使用20%的胎牛血清培養液在37度5-7%的二氧化碳培養箱中培養16小時。2.培養輕輕吹下雜交瘤細胞并離心沉淀后使用5-10mL常規的HAT的體積百分比為2%的HAT液體培養基重懸后再用上述培養基定容至120mL，分裝到6塊96孔板中，200 μ L/孔；37°C 5-7%的二氧化碳培養箱中培養7天后使用HAT培養基全量換液。 3.篩選繼續培養3天后開始吸上清液整板進行ELISA檢測。其中，ELISA檢測方法如下3. I抗原包被用包被緩沖液將完全抗原進行稀釋，以100 μ I/孔加入酶標板，4°C過夜，一般稀釋濃度為2 μ g/ml ；3.2 封閉取出酶標板，不用棄去孔內液體，配制75%的脫脂奶粉，每孔200ul，37°C溫育
I.5h ；3. 3 洗滌棄去孔內液體，用自來水洗12遍，然后拍干；3. 4 加樣吸取上清抗體檢測加入各個孔的上清，同時做陽性對照(小鼠血清)，陰性對照(PBST), 100 μ I/ 孔，37。。Ih ；3. 5 洗板棄去孔內液體，用自來水洗12遍，拍干；3. 6加入酶標二抗每孔加入I :5000— I :10000倍稀釋的合適的酶標二抗(IgG-HRP)現配，100 μ I/孔，37°C Ih ；3. 7 洗滌棄去孔內液體，洗板12次，拍干；3. 8顯色反應加入新配的底物液(TMB使用液)，100 μ I/孔，37°C避光反應15_20min ；3. 9終止每孔加終止液50 μ 1，(2M H2SO4)振蕩混勻；3. 10 測定靜置10-15min后于酶標儀上讀取450nm處的OD值；3. 11結果判定若OD450X). 5，則判斷為陽性孔。
4.亞克隆選擇ELISA檢測陽性孔進行亞克隆；用200 μ L/孔的DMEM重懸細胞后，計數細胞，取400-500個細胞放入40mL的亞克隆半固體培養基中，上下顛倒10-20次混勻后，靜置5min ；將其中20mL分裝到10個6孔培養皿中，使每個6孔培養皿中細胞數在40_50個，這樣做的目的是爭取在一次亞克隆即可達到單克隆；再向剩下的20mL亞克隆半固體培養基中再次加入200個左右的細胞，重復上述操作，分裝于5個中型培養皿中，每個中型培養皿細胞數在80-100，這樣做目的是確保能夠得到雜交瘤；最后封好封口膜后置于37°C 5-7%的二氧化碳培養箱中培養7天后，使用封口膜可防止培養皿變干。 5.擴大培養長出肉眼可見的細胞集落后，使用微量移液器挑取培養皿中較分散的細胞集落到96孔細胞培養板中置于37°C 5-7%的二氧化碳培養箱中培養3天后擴大培養，即得單克隆雜交瘤細胞。采用有限稀釋法、甲基纖維素半固體培養基法和本發明方法相比，各自所需時間見表I。表I不同方法制備方法所需時間
首次克隆二次克隆三次克隆擴大培養
方法名稱融合時間
lit IR」 Ut 間時 間時 間 冇限稀釋法 1.5周2周2周2周14天
半固體培養基法 1.5周 0.5周不需要不需耍 14天
本發明方法 1.5周 1.5周不需要不需要 14天實施例2克隆雜交瘤細胞的制備。I.融合取常規免疫后的小鼠的脾細胞與狀態好的NS-I細胞，控制脾細胞和NS-I細胞數量比在10 :1，使用體積分數為60%的PEG 1000融合；可選地，也可以控制脾細胞和NS-I細胞數量比在(10-2) 1之間，也可以選擇分子量范圍在1000-6000的PEG。將融合后的細胞使用15%的胎牛血清培養液在25度5-7%的二氧化碳培養箱中培養24小時。2.培養輕輕吹下雜交瘤細胞并離心沉淀后使用5-10mL常規的HAT的體積百分比為5%的HAT液體培養基重懸后再用上述培養基定容至120mL，分裝到6塊96孔板中，200 μ L/孔；25°C 5-7%的二氧化碳培養箱中培養7天后使用HAT培養基全量換液。繼續培養5天后開始吸上清液整板進行ELISA檢測，方法同實施例I。3.亞克隆選擇ELISA檢測陽性孔進行亞克隆；
用200 μ L/孔的DMEM重懸細胞后，計數細胞，取400-500個細胞放入40mL的亞克隆半固體培養基中，上下顛倒10-20次混勻后，靜置5min ；將其中20mL分裝到10個6孔培養皿中，使每個6孔培養皿中細胞數在40_50個，這樣做的目的是爭取在一次亞克隆即可達到單克隆；再向剩下的20mL亞克隆半固體培養基中再次加入200個左右的細胞，重復上述操作，分裝于5個中型培養皿中，每個中型培養皿細胞數在80-100，這樣做目的是確保能夠得到雜交瘤；最后封好封口膜后置于25°C 5-7%的二氧化碳培養箱中培養14天后,使用封口膜可防止培養皿變干。4.擴大培養
長出肉眼可見的細胞集落后，使用微量移液器挑取培養皿中較分散的細胞集落到96孔細胞培養板中置于25°C 5-7%的二氧化碳培養箱中培養5天后擴大培養，即得單克隆雜交瘤細胞。實施例3克隆雜交瘤細胞的制備。I.融合取常規免疫后的小鼠的脾細胞與狀態好的sp2/0細胞，控制脾細胞和sp2/0細胞數量比在2 :1，使用體積分數為40%的PEG 6000融合；可選地，也可以控制脾細胞和sp2/0細胞數量比在(10-2) 1之間，也可以選擇分子量范圍在1000-6000的PEG。將融合后的細胞使用10%的胎牛血清培養液在30度5-7%的二氧化碳培養箱中培養20小時。2.培養輕輕吹下雜交瘤細胞并離心沉淀后使用5-10mL常規的HAT的體積百分比為4%的HAT液體培養基重懸后再用上述培養基定容至120mL，分裝到6塊96孔板中，200 μ L/孔；30°C 5-7%的二氧化碳培養箱中培養5天后使用HAT培養基全量換液。3.篩選繼續培養3天后開始吸上清液整板進行ELISA檢測。4.亞克隆選擇ELISA檢測陽性孔進行亞克隆；用200 μ L/孔的DMEM重懸細胞后，計數細胞，取400-500個細胞放入40mL的亞克隆半固體培養基中，上下顛倒10-20次混勻后，靜置5min ；將其中20mL分裝到10個6孔培養皿中，使每個6孔培養皿中細胞數在40_50個，這樣做的目的是爭取在一次亞克隆即可達到單克隆；再向剩下的20mL亞克隆半固體培養基中再次加入200個左右的細胞，重復上述操作，分裝于5個中型培養皿中，每個中型培養皿細胞數在80-100，這樣做目的是確保能夠得到雜交瘤；最后封好封口膜后置于30°C 5-7%的二氧化碳培養箱中培養10天后,使用封口膜可防止培養皿變干。5.擴大培養長出肉眼可見的細胞集落后，使用微量移液器挑取培養皿中較分散的細胞集落到96孔細胞培養板中置于30°C 5-7%的二氧化碳培養箱中培養4天后擴大培養，即得單克隆雜交瘤細胞。實施例4單克隆抗體制備及亞型鑒定。I.單克隆抗體的制備提前7-10天接種液體石蠟于8-12周齡Balb/c小鼠腹腔中，O. 5-0. 6mL/只；再用不完全培養基即DMEM培養基稀釋的實施例I的單克隆雜交瘤細胞接種于每只已注射液體石臘的Balb/c小鼠腹腔,計數板計數,約I. OX 10~6個/mL,即大約O. 5mL/只；注射雜交瘤后大約5-7天后，每天觀察記錄Babl/c小鼠產生腹水狀況，如果小鼠腹腔明顯膨大即可用針頭抽取腹水(針頭標準為7號針頭)，一般可連續收集3-4次，通常每只小鼠收集5-1 OmL。
將腹水純化后，即制得單克隆抗體。2.單克隆抗體制備及亞型鑒定將制得得單克隆抗體采用Sigma的亞型鑒定試劑盒(Mouse Monoclonal AntibodyIsotyping Reagents、Stock No. IS0-2)鑒定單克隆抗體亞型。細胞上清可采用抗原介導ELISA法和捕獲ELISA法兩種方法進行亞型鑒定。用抗原介導ELISA法基本步驟如下(I)抗原包被用包被緩沖液將完全抗原進行稀釋，以100 μ L每孔加入酶標板，37度溫育lh，一般稀釋濃度為2 μ g/mL ；(2)封閉配制75%的脫脂奶粉，不需棄掉孔內液體，直接加入酶標板孔中，每孔200 μ L, 37 度溫育 Ih ；(3)洗板棄去孔內液體，用自來水洗12遍，拍干；(4)加樣加入每個與包被原對應的亞克隆上清，同時以每個亞克隆上清按六個亞型做對應的六個孔，剩余兩個孔做陰性對照(PBST)，每孔100 μ L,室溫反應2h ；(5)洗板棄去孔內液體，用自來水洗12遍，拍干；(6)加入六個亞型按1:1000用PBST稀釋個個亞型，以每孔IOOul按順序加入對應的亞型加入酶標板，記清楚對應加入的亞型順序，室溫反應30min ；(7)洗板棄去孔內液體，自來水洗12遍，拍干；(8)加入酶標記二抗用PBST稀釋1:5000，加入酶標板，每孔100 μ L，室溫反應15min ；(9)洗板棄去孔內液體，自來水12遍，拍干；(10)顯色以每孔100 μ L計算所需的量，配制顯色液(Na2HPO4. 12Η20+檸檬酸+雙蒸水 +ΤΜΒ+Η202)每孔 100 μ L，37 度溫育 15min ；(11)終止每孔加終止液2mol/L H2SO4IOO μ L震蕩混勻；(12)測OD值在酶標儀450nm處檢測OD值，記錄數據(表2);(13)結果顯示在C行IgGl處，數值最高；可以判定該細胞亞型為IgGl亞型。圖2顯示了抗原介導ELISA法基本步驟后的最終顯色情況；其中，第三行有明顯顯色，說明該檢測的雜交瘤細胞株的亞型為IgGl。表2單克隆亞型鑒定結果
權利要求
1.一種單克隆雜交瘤細胞的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)融合使用聚乙二醇水溶液融合骨髓瘤細胞與抗原免疫后的淋巴細胞，得融合細胞； (2)培養將融合細胞接入HAT液體培養基中于二氧化碳培養箱中培養，得雜交瘤細胞； (3)篩選將雜交瘤細胞上清液采用間接ELISA篩選，得陽性雜交瘤細胞； (4)亞克隆將陽性雜交瘤細胞接入亞克隆半固體培養基中于二氧化碳培養箱培養，得單個雜交瘤細胞集落； (5)擴大培養取單個雜交瘤細胞集落的細胞接入胎牛血清培養液中于二氧化碳培養箱中擴大培養，即得單克隆雜交瘤細胞。
2.根據權利要求I所述的一種單克隆雜交瘤細胞的制備方法，其特征在于步驟(I)中，所述淋巴細胞為小鼠脾細胞，所述骨髓瘤細胞包括sp2/0細胞或NS-I細胞。
3.根據權利要求I所述的一種單克隆雜交瘤細胞的制備方法，其特征在于步驟(O中，所述淋巴細胞與骨髓瘤細胞的細胞數量比為(10-2) 所述聚乙二醇的分子量為1000-6000，所述聚乙二醇水溶液的體積分數為40-60%。
4.根據權利要求I所述的一種單克隆雜交瘤細胞的制備方法，其特征在于步驟(I)中，還可以將融合細胞接入含胎牛血清培養液中于二氧化碳培養箱中培養。
5.根據權利要求4所述的一種單克隆雜交瘤細胞的制備方法，其特征在于所述胎牛血清培養液的胎牛血清體積百分比為10% _20%，所述培養箱中二氧化碳濃度為5-7%，培養溫度為25-37°C，培養時間為16-24h。
6.根據權利要求I所述的一種單克隆雜交瘤細胞的制備方法，其特征在于步驟(2)中，HAT液體培養基的HAT的體積分數為2-5%，培養箱中二氧化碳濃度為5_7%，培養溫度為25-37°C，培養時間8-12天。
7.根據權利要求I所述的一種單克隆雜交瘤細胞的制備方法，其特征在于步驟(4)中，所述亞克隆半固體培養基的配方為 谷氨酰胺I水溶液O. 1-1. OmL,體積分數O. 25 % -2. 5% ； 非必需氨基酸水溶液O. 1-1. OmL,體積分數O. 25% -2. 5% ； β —巰基乙醇O. 1-1. OmL,體積分數O. 25% -2. 5% ； 次黃嘌呤-胸腺嘧啶水溶液O. 1-1. OmL,體積分數O. 25 % -2. 5% ； 青霉素及鏈霉素水溶液O. 1-1. OmL,體積分數O. 25% -2. 5% ； 胎牛血清水溶液5-10mL，體積分數12.5% -25% ； 甲基纖維素O. 1-lg, 2. 5mg/ml-25mg/ml ； DMEM高糖水溶液25-35mL，體積分數62. 5%—87. 5%。
8.根據權利要求I所述的一種單克隆雜交瘤細胞的制備方法，其特征在于步驟(4)中，所述培養箱中二氧化碳濃度為5-7%，培養溫度為25-37°C，培養時間為7-14天。
9.根據權利要求I所述的一種單克隆雜交瘤細胞的制備方法，其特征在于步驟(5)中，所述培養液為體積百分比的10%_20%胎牛血清培養液，所述培養箱中二氧化碳濃度為5-7%，培養溫度為25-37°C，培養時間為3-5天。
全文摘要
本發明提供了一種單克隆雜交瘤細胞的制備方法，包括以下步驟步驟一，融合使用聚乙二醇水溶液融合骨髓瘤細胞與抗原免疫后的淋巴細胞，得融合細胞；步驟二，培養將融合細胞接入HAT液體培養基中于二氧化碳培養箱中培養，得雜交瘤細胞；步驟三，篩選將雜交瘤細胞上清液采用間接ELISA篩選，得陽性雜交瘤細胞；步驟四，亞克隆將陽性雜交瘤細胞接入亞克隆半固體培養基中于二氧化碳培養箱培養，得單個雜交瘤細胞集落；步驟五，擴大培養取單個雜交瘤細胞集落的細胞接入胎牛血清培養液中于二氧化碳培養箱中擴大培養，即得單克隆雜交瘤細胞。該制備方法培養周期短、成本低、篩得的陽性克隆細胞株全。
文檔編號C12N5/20GK102864125SQ20121028049
公開日2013年1月9日 申請日期2012年8月8日 優先權日2012年8月8日
發明者周軍, 王玉燕, 馮展波 申請人:南京巴傲得生物科技有限公司