大分子活性膠原蛋白的制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種大分子活性膠原蛋白的制備方法，包括以下步驟：魚皮的預處理；活性膠原蛋白的提取；活性膠原蛋白溶液的純化。本發明通過超聲波、乙酸和復合酶的協同作用提取膠原蛋白，并綜合運用鹽析、透析和超濾技術制得大分子活性膠原蛋白溶液，并能穩定存在。
【專利說明】大分子活性膠原蛋白的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物醫用材料的制備領域，具體涉及一種大分子活性膠原蛋白的制備方法。
【背景技術】
[0002]膠原蛋白是具有獨特結構的一族蛋白質，廣泛存在于哺乳動物組織中，約占總蛋白質的30%以上。膠原蛋白為骨、皮膚、肌腱和韌帶提供生物力學性能、控制發育中的細胞基因表型。膠原蛋白的結構呈三股螺旋結構，由三條多肽鏈組成，每一條膠原鏈都是左手螺旋構型，三條左手螺旋α-鏈又互相纏成右手螺旋結構一即超螺旋結構。單個α-鏈含有至少一個Gly-X-Y序列。每三個氨基酸就有一個甘氨酸殘基。膠原蛋白的特有結構和化學組成使其具有許多獨特性質和功能。這些性質和功能使其在各個領域得到了廣泛應用，如生物醫學材料、藥物輸送載體、組織工程、化妝品和食品等領域。
[0003]目前，國內活性膠原蛋白雖有科研單位進行了研究和開發，并有一些活性膠原蛋白提取工藝方面的專利與報道，但目前離產業化水平仍有一定差距，只限于少數幾家公司能夠進行中試或小規模試生產。由于活性膠原蛋白產業化水平較低，限制了它的下游產品開發與應用。目前，活性膠原蛋白在保健食品、化妝品領域中的應用有大量報道和銷售，但對于醫用級大分子量活性膠原蛋白的提取技術僅處于小規模水平。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種大分子活性膠原蛋白的制備方法。
[0005]本發明采用的技術方案為:一種大分子活性膠原蛋白的制備方法，包括以下步驟:
一、魚皮的預處理
選取新鮮魚皮，100重量份，水洗去肉后，加入20-30% NaCI (0.05Μ Tris-HCI,ρΗ7.5)溶液中(1:20-40，w/v)均質5-lOmin，用轉速為10000-15000rpm高速冷凍離心機離心10-25min，取沉淀，重復上述操作，直到沒有浮游脂肪和氣泡產生，然后用去離子水清洗；
二、活性膠原蛋白的提取
將預處理后的魚皮加入預冷的去離子水中(1:5 O -10 O，w/ V )，冰浴，加入乙酸至0.5-1.0M超聲10-25min,超聲波功率300-600W,加入0.1-0.5重量份胃蛋白酶、酸性酶3350和木瓜蛋白酶中的一種或數種，酶解5-8h，離心，取上清，所得沉淀加去離子水(1:50-100)，調pH值至中性，加入0.1-0.5重量份中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶中的一種或兩種，酶解3-6h，離心，取上清，合并兩份上清，得膠原蛋白溶液；
三、活性膠原蛋白溶液的純化
選孔徑為10-50nm的超濾膜濃縮上述膠原蛋白溶液，加入NaCl至終濃度為0.5-1.3M，鹽析過夜，然后離心10-30min，取沉淀，沉淀再次用0.5-1M乙酸溶解后，離心l_2h，取上清，對0.1-0.2M乙酸透析脫鹽，用100-200nm孔徑的超濾膜去除小分子物質和多肽，得到濃度為20-50%的大分子活性膠原蛋白溶液。
[0006]有益效果:本發明通過超聲波、乙酸和復合酶的協同作用提取膠原蛋白，并綜合運用鹽析、透析和超濾技術制得大分子活性膠原蛋白溶液，并能穩定存在。
【具體實施方式】
[0007]下面對本發明的【具體實施方式】進行詳細的說明。
[0008]實施例1:選取新鮮魚皮，100重量份，水洗去肉后，加入20% NaCI (0.05MTris-HCI, pH7.5)溶液中(1:20, w/v)均質5min,用轉速為1000Orpm高速冷凍離心機離心lOmin，取沉淀，重復上述操作，直到沒有浮游脂肪和氣泡產生，然后用去離子水清洗。將預處理后的魚皮加入預冷的去離子水中(1:50, w/v),冰浴,加入乙酸至0.5M超聲IOmin,超聲波功率300W。加入0.1重量份胃蛋白酶，酶解5h，離心，取上清。所得沉淀加去離子水(1:50)，調pH值至中性，加入0.1重量份中性蛋白酶，酶解3h，離心，取上清。合并兩份上清，得膠原蛋白溶液。選孔徑為IOnm的超濾膜濃縮上述膠原蛋白溶液，加入NaCl至終濃度為0.5M,鹽析過 夜,然后離心IOmin,取沉淀。沉淀再次用0.5M乙酸溶解后，離心Ih,取上清，對0.1M乙酸透析脫鹽，用IOOnm孔徑的超濾膜去除小分子物質和多肽，得到濃度為20%的大分子活性膠原蛋白溶液。
[0009]實施例2:選取新鮮魚皮，100重量份，水洗去肉后，加入30% NaCI (0.05MTris-HCI, pH7.5)溶液中(1:40, w/v)均質IOmin,用轉速為15000rpm高速冷凍離心機離心25min，取沉淀，重復上述操作，直到沒有浮游脂肪和氣泡產生，然后用去離子水清洗。將預處理后的魚皮加入預冷的去離子水中(1: 100, w/v),冰浴,加入乙酸至1.0|/[超聲251]1；[11,超聲波功率600W。加入0.5重量份胃木瓜蛋白酶，酶解8h，離心，取上清。所得沉淀加去離子水(1:100)，調pH值至中性，加入0.5重量份菠蘿蛋白酶，酶解6h，離心，取上清。合并兩份上清，得膠原蛋白溶液。選孔徑為50nm的超濾膜濃縮上述膠原蛋白溶液，加入NaCl至終濃度為1.3M，鹽析過夜，然后離心30min，取沉淀。沉淀再次用IM乙酸溶解后，離心2h，取上清，對0.2M乙酸透析脫鹽，用200nm孔徑的超濾膜去除小分子物質和多肽，得到濃度為50%的大分子活性膠原蛋白溶液。
[0010]實施例3:選取新鮮魚皮，100重量份，水洗去肉后，加入25% NaCI (0.05MTris-HCI, pH7.5)溶液中(1:30, w/v)均質8min,用轉速為12000rpm高速冷凍離心機離心20min,取沉淀，重復上述操作，直到沒有浮游脂肪和氣泡產生，然后用去離子水清洗；將預處理后的魚皮加入預冷的去離子水中(1:70, w/v),冰浴,加入乙酸至0.8M超聲20min,超聲波功率400W，加入0.3重量份胃蛋白酶、酸性酶3350和木瓜蛋白酶中的一種或數種，酶解6h，離心，取上清，所得沉淀加去離子水(1:80)，調pH值至中性，加入0.3重量份中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶中的一種或兩種，酶解5h，離心，取上清，合并兩份上清，得膠原蛋白溶液；選孔徑為30nm的超濾膜濃縮上述膠原蛋白溶液，加入NaCl至終濃度為0.9M，鹽析過夜，然后離心20min，取沉淀，沉淀再次用0.8M乙酸溶解后，離心1.5h，取上清，對0.15M乙酸透析脫鹽，用150nm孔徑的超濾膜去除小分子物質和多肽，得到濃度為30%的大分子活性膠原蛋白溶液。[0011]應當指出，對于本【技術領域】的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。本實施例中未明確的各組成部分均可用現有技·術加以實現。
【權利要求】
1.一種大分子活性膠原蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 一、魚皮的預處理
選取新鮮魚皮，100重量份，水洗去肉后，加入20-30% NaCI (0.05M Tris-HCI,pH7.5)溶液中(1:20-40，w/v)均質5-lOmin，用轉速為10000-15000rpm高速冷凍離心機離心10-25min，取沉淀，重復上述操作，直到沒有浮游脂肪和氣泡產生，然后用去離子水清洗； 二、活性膠原蛋白的提取
將預處理后的魚皮加入預冷的去離子水中(I: 50-100, w/v),冰浴，加入乙酸至0.5-1.0M超聲10-25min,超聲波功率300-600W,加入0.1-0.5重量份胃蛋白酶、酸性酶3350和木瓜蛋白酶中的一種或數種，酶解5-8h，離心，取上清，所得沉淀加去離子水(1:50-100)，調pH值至中性，加入0.1-0.5重量份中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶中的一種或兩種，酶解3-6h，離心，取上清，合并兩份上清，得膠原蛋白溶液； 三、活性膠原蛋白溶液的純化 選孔徑為10-50nm的超濾膜濃縮上述膠原蛋白溶液，加入NaCl至終濃度為0.5-1.3M，鹽析過夜，然后離心10-30min，取沉淀，沉淀再次用0.5-1M乙酸溶解后，離心l_2h，取上清，對0.1-0.2M乙酸透析脫鹽，用100-200nm孔徑的超濾膜去除小分子物質和多肽，得到濃度為20-50%的大分子活性膠原·蛋白溶液。
【文檔編號】C12P21/06GK103571901SQ201210276450
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年8月6日 優先權日:2012年8月6日
【發明者】郁帥陸, 黃榮醒, 林琳 申請人:江蘇奧普萊醫療用品有限公司