專利名稱：：一種利用silac標記大腸桿菌蛋白質組的方法及其專用培養基的制作方法
技術領域：
：本發明涉及生物
技術領域：
，尤其涉及一種利用SILAC標記大腸桿菌蛋白質組的方法及其專用培養基。
背景技術：
：大腸桿菌是大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)的簡稱，因1885年被TheodorEscherich發現而得名。大腸桿菌屬細菌界(Bacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、Y_變形菌綱(Gammaproteobacteria)、腸桿菌目(Enterobacteriales)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、埃希氏菌屬(Escherichia)的大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)，是革蘭氏陰性短桿菌，大小0.5X13微米，周身鞭毛，能運動，無芽孢。大腸桿菌在自然界廣泛分布，也是人和許多動物腸道中最主要且數量最多的一種細菌，主要寄生在大腸內，大多數不致病，與人終身相伴。其代謝活動能抑制腸道內分解蛋白質的微生物生長，減少蛋白質分解產物對人體的危害，還能合成維生素B和K，并產生有殺菌作用的大腸桿菌素，惠及其寄生的宿主。由于菌體繁殖迅速，易培養，價廉，易變異且易被檢出等諸多優點，大腸桿菌已經成為現代生物學中研究最多的一種模式生物。由于其結構簡單，大腸桿菌被廣泛用于生物化學、遺傳學、分子生物學和代謝途徑的研究，以揭示生命的奧秘。大腸桿菌對于分子遺傳學的建立和發展以及生物工程的興起均發揮了重要作用。Cohen和Boyer于1973年在大腸桿菌中創造了重組DNA技術，開創了基因工程研究的先河，使得該菌成為代謝途徑和生物機制研究最透徹的微生物之一。由于遺傳背景清楚、載體和受體系統完備、技術操作簡單、生長迅速、培養簡單、重組子穩定和大規模發酵便宜等優點，使得大腸桿菌成為基因工程研究中最主要的原核受體菌，廣泛應用于外源DNA的克隆和擴增、原核基因高效表達和基因文庫構建等基礎研究。用大腸桿菌生產的人生長激素、生長激素釋放抑制因子、胰島素等均已經取得了成功，并成功地實現了產業化，創造了巨大的產業價值。盡管大腸桿菌具有諸多優點，但也給人類帶來了諸多麻煩，如果控制不當，還可能引起突發事件。作為條件致病菌，在腸道中的大腸桿菌一旦離開腸道進入膽囊、尿道、膀胱、闌尾等，可引起炎癥反應。當細菌由于如潰瘍等因素導致的穿孔而進入腹腔時，通常會導致致命性的腹膜炎癥感染。大腸桿菌的某些菌株本身還具有毒性(其中一些類似導致痢疾的毒素)，可以導致食物中毒，使得細胞脫水引起腹瀉等，并可引發群體的急性感染，如1996年5-8月份日本的0157H7大腸桿菌引起的疫情，波及9000多人。不僅如此，由于許多大腸桿菌可在菌體死亡溶解后產生內毒素，對機體產生強烈的毒性，可引起宿主發熱、毒血癥、敗血癥、心包炎、肝周炎、氣囊炎、輸卵管炎、腎炎等嚴重疾患，甚至休克死亡，使得大腸桿菌所致疾病的治療更為復雜。而抗藥性基因的衍變以及在菌株間的廣泛傳播，使得耐藥菌泛濫成災，難治愈，死亡率高并且極易復發，這已經成為人類臨床治療的重大難題和養禽業的重大威脅，困擾和阻滯了養殖業的發展。因此，耐藥基因及其質粒在大腸桿菌菌株間的轉殖、衍變和耐藥菌的產生、發展的系統生物學探索也同樣具有重要的生物醫學研究價值。蛋白質是基因功能的直接執行者，且相互關聯，共同執行細胞復雜的生命活動過程。蛋白質組學是系統鑒定和定量細胞內蛋白質，并研究其功能的新興學科。大腸桿菌的蛋白質組學研究，特別是定量蛋白質組學研究可以發現、鑒別基因差異和生物學處理的效應，揭示其分子調控網絡及其分子機制。但由于技術的限制，早期大腸桿菌組學水平的蛋白質鑒定主要依靠雙向凝膠電泳，難于分清所有的蛋白質及其量的變化。近來，基于液相色譜-質譜聯用技術為簡單蛋白質組的高覆蓋奠定了技術基礎。由于質譜本身并不是好的定量工具，定量蛋白質組學研究需要定量標準。目前基于細胞培養過程中的重穩定性同位素標記氨基酸的整體蛋白質組標記技術(stableisotopelabelingbyaminoacidincellculture,SILAC)已經成為定量蛋白質組學研究的金標準。Krijgsveld等在進行15N標記的線蟲定量蛋白質組學研究時利用15N標記的銨鹽作為唯一氮源培養大腸桿菌，這種培養基不但價格昂貴，難以達到高水平標記，并且對數據處理要求較高。丁琢等利用哺乳動物細胞的SILAC培養基培養大腸桿菌，用于制備目標導向蛋白質組學研究用的重穩定性同位素標記肽段。但這種標記方法使用哺乳動物細胞的培養基，完全改變了普通的大腸桿菌培養基組成和特性，無法研究大腸桿菌的正常發酵條件，且價格昂貴。Carroll等利用M9鹽基礎培養基制備目標導向蛋白質組學研究用的重穩定性同位素標記肽段，盡管也獲得了單個目的蛋白的較高的標記效率，但生長緩慢，也沒有對標記過程進行有效監測，難于應用于定量蛋白質組學研究。由于缺乏有效的標記方法，至今還沒有大腸桿菌高效SILAC培養基的問世和大規模定量蛋白質組學研究論文的發表，阻礙了大腸桿菌定量蛋白質組學研究的進展及其在發酵產業、基礎醫學研究中作用的發揮。
發明內容本發明的一個目的是提供一種SILAC標記大腸桿菌專用培養基。本發明提供的專用培養基，包括無機鹽、組氨酸鹽酸鹽、異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、絲氨酸、重穩定性同位素標記賴氨酸、精氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、腺嘌呤硫酸鹽、尿嘧啶、鹽酸噻胺和葡萄糖；所述無機鹽為Na2HPO412H20、KH2PO4,NaCUMgSO4,NH4Cl和CaCl2。上述培養基中，所述組氨酸鹽酸鹽為L-組氨酸鹽酸鹽；所述異亮氨酸為L-異亮氨酸；所述纈氨酸為L-纈氨酸；所述亮氨酸為L-亮氨酸；所述苯丙氨酸為L-苯丙氨酸；所述色氨酸為L-色氨酸；所述絲氨酸為L-絲氨酸；所述重穩定性同位素標記賴氨酸為重穩定性同位素標記L-賴氨酸；所述精氨酸為L-精氨酸；所述蘇氨酸為L-蘇氨酸；所述酪氨酸為L-酪氨酸；所述蛋氨酸為L-蛋氨酸。上述培養基中，所述Na2HPO412H20、所述KH2P04、所述NaCl、所述MgS04、所述NH4C1、所述CaCl2、所述鹽酸噻胺、所述葡萄糖、所述L-組氨酸鹽酸鹽、所述L-異亮氨酸、所述L-纈氨酸、所述L-亮氨酸、所述L-苯丙氨酸、所述L-色氨酸、所述L-絲氨酸、所述重穩定性同位素標記L-賴氨酸、所述L-精氨酸、所述L-蘇氨酸、所述L-酪氨酸、所述L-蛋氨酸、所述腺嘌呤硫酸鹽和所述尿嘧啶的質量比為17100:3000:580:120:100011110000:203015030:50:20:400:30:100:200:30:20:20:20。上述培養基還包括水；所述培養基由所述Na2HPO412H20、所述KH2PO4、所述NaCl、所述MgSO4、所述NH4C1、所述CaCl2、所述鹽酸噻胺、所述葡萄糖、所述L-組氨酸鹽酸鹽、所述L-異亮氨酸、所述L-纈氨酸、所述L-亮氨酸、所述L-苯丙氨酸、所述L-色氨酸、所述L-絲氨酸、所述重穩定性同位素標記L-賴氨酸、所述L-精氨酸、所述L-蘇氨酸、所述L-酪氨酸、所述L-蛋氨酸、所述腺嘌呤硫酸鹽、所述尿喃唳和水組成。上述培養基中，所述Na2HPO412H20在所述培養基中的終濃度為17100mg/L；所述KH2PO4在所述培養基中的終濃度為3000mg/L；所述NaCl在所述培養基中的終濃度為580mg/L；所述MgSO4在所述培養基中的終濃度為120mg/L；所述NH4Cl在所述培養基中的終濃度為1000mg/L；所述CaCl2在所述培養基中的終濃度為Ilmg/L；所述葡萄糖在所述培養基中的終濃度為10000mg/L;所述鹽酸噻胺在所述培養基中的終濃度為lmg/L；所述L-組氨酸鹽酸鹽在所述培養基中的終濃度為20mg/L；所述L-異亮氨酸在所述培養基中的終濃度為30mg/L；所述L-纈氨酸在所述培養基中的終濃度為150mg/L；所述L-亮氨酸在所述培養基中的終濃度為30mg/L；所述L-苯丙氨酸在所述培養基中的終濃度為50mg/L；所述L-色氨酸在所述培養基中的終濃度為20mg/L；所述L-絲氨酸在所述培養基中的終濃度為400mg/L；所述重穩定性同位素標記L-賴氨酸在所述培養基中的終濃度為30mg/L；所述L-精氨酸在所述培養基中的終濃度為100mg/L；所述L-蘇氨酸在所述培養基中的終濃度為200mg/L；所述L-酪氨酸在所述培養基中的終濃度為30mg/L；所述L-蛋氨酸在所述培養基中的終濃度為20mg/L；所述腺嘌呤硫酸鹽在所述培養基中的終濃度為20mg/L；所述尿嘧啶在所述培養基中的終濃度為20mg/L。上述培養基中，所述重穩定性同位素標記L-賴氨酸為L-Iysine-13C6或L-Iysine-13C615N20本發明的另一個目的是提供一種制備上述的專用培養基的方法，包括如下步驟按照所述終濃度將所述Na2HPO412H20、所述KH2PO4、所述NaCl、所述MgSO4、所述NH4Cl、所述CaCl2、所述L-組氨酸鹽酸鹽、所述L-異亮氨酸、所述L-纈氨酸、所述L-亮氨酸、所述L-苯丙氨酸、所述L-色氨酸、所述L-絲氨酸、所述重穩定性同位素標記L-賴氨酸、所述L-精氨酸、所述L-蘇氨酸、所述L-酪氨酸、所述L-蛋氨酸、所述腺嘌呤硫酸鹽、所述尿嘧啶、所述鹽酸噻胺、所述葡萄糖和水混合，得到培養基。上述的培養基在SILAC標記大腸桿菌蛋白質組中的應用也是本發明保護的范圍。本發明的第三個目的是提供一種SILAC標記大腸桿菌蛋白質組的方法。本發明提供的方法，為將大腸桿菌在上述的培養基中培養，實現SILAC標記大腸桿菌蛋白質組。上述方法中，所述培養的方式為37°C培養7-12代。本發明的實驗證明，本發明開發的一種SILAC標記大腸桿菌專用培養基，可以專門用于SILAC標記大腸桿菌蛋白質組，不僅省卻了營養缺陷型構筑的繁瑣步驟和遺傳條件限制，而且可以實現快速、聞效地標記，為定量內標的制備和聞效精確地定量蛋白質組研究創造了條件。圖I為SILAC標記的大腸桿菌蛋白的色譜-質譜聯用結果2為SILAC標記的大腸桿菌蛋白的標記效率測試結果圖具體實施方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。本發明可以通過以下實例更容易地理解，但本發明并不僅限于這些實例。實施例I、SILAC標記大腸桿菌專用培養基表I為SILAC標記大腸桿菌專用培養基組分權利要求1.一種SILAC標記大腸桿菌專用培養基，包括無機鹽、組氨酸鹽酸鹽、異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、絲氨酸、重穩定性同位素標記賴氨酸、精氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、腺嘌呤硫酸鹽、尿嘧啶、鹽酸噻胺和葡萄糖；所述無機鹽為Na2HPO412H20、KH2PO4,NaCUMgSO4,NH4Cl和CaCl2。2.根據權利要求I所述的培養基，其特征在于所述組氨酸鹽酸鹽為L-組氨酸鹽酸鹽；所述異亮氨酸為L-異亮氨酸；所述纈氨酸為L-纈氨酸；所述亮氨酸為L-亮氨酸；所述苯丙氨酸為L-苯丙氨酸；所述色氨酸為L-色氨酸；所述絲氨酸為L-絲氨酸；所述重穩定性同位素標記賴氨酸為重穩定性同位素標記L-賴氨酸；所述精氨酸為L-精氨酸；所述蘇氨酸為L-蘇氨酸；所述酪氨酸為L-酪氨酸；所述蛋氨酸為L-蛋氨酸。3.根據權利要求2所述的培養基，其特征在于所述Na2HPO412H20、所述KH2PO4、所述NaCl、所述MgSO4、所述NH4C1、所述CaCl2、所述鹽酸噻胺、所述葡萄糖、所述L-組氨酸鹽酸鹽、所述L-異亮氨酸、所述L-纈氨酸、所述L-亮氨酸、所述L-苯丙氨酸、所述L-色氨酸、所述L-絲氨酸、所述重穩定性同位素標記L-賴氨酸、所述L-精氨酸、所述L-蘇氨酸、所述L-酪氨酸、所述L-蛋氨酸、所述腺嘌呤硫酸鹽和所述尿嘧啶的質量比為17100:3000:580:120:1000111:10000:20:30:150:30:502040030100200:30:20:20:20。4.根據權利要求2或3所述的培養基，其特征在于所述培養基還包括水；所述培養基由所述Na2HPO412H20、所述KH2PO4、所述NaCl、所述MgSO4、所述NH4C1、所述CaCl2、所述鹽酸噻胺、所述葡萄糖、所述L-組氨酸鹽酸鹽、所述L-異亮氨酸、所述L-纈氨酸、所述L-亮氨酸、所述L-苯丙氨酸、所述L-色氨酸、所述L-絲氨酸、所述重穩定性同位素標記L-賴氨酸、所述L-精氨酸、所述L-蘇氨酸、所述L-酪氨酸、所述L-蛋氨酸、所述腺嘌呤硫酸鹽、所述尿嘧啶和水組成。5.根據權利要求2-4中任一所述的培養基,其特征在于所述Na2HPO412H20在所述培養基中的終濃度為17100mg/L；所述KH2PO4在所述培養基中的終濃度為3000mg/L；所述NaCl在所述培養基中的終濃度為580mg/L；所述MgSO4在所述培養基中的終濃度為120mg/L；所述NH4Cl在所述培養基中的終濃度為1000mg/L；所述CaCl2在所述培養基中的終濃度為llmg/L；所述葡萄糖在所述培養基中的終濃度為10000mg/L；所述鹽酸噻胺在所述培養基中的終濃度為lmg/L；所述L-組氨酸鹽酸鹽在所述培養基中的終濃度為20mg/L；所述L-異亮氨酸在所述培養基中的終濃度為30mg/L；所述L-纈氨酸在所述培養基中的終濃度為150mg/L；所述L-亮氨酸在所述培養基中的終濃度為30mg/L；所述L-苯丙氨酸在所述培養基中的終濃度為50mg/L；所述L-色氨酸在所述培養基中的終濃度為20mg/L；所述L-絲氨酸在所述培養基中的終濃度為400mg/L；所述重穩定性同位素標記L-賴氨酸在所述培養基中的終濃度為30mg/L；所述L-精氨酸在所述培養基中的終濃度為100mg/L；所述L-蘇氨酸在所述培養基中的終濃度為200mg/L；所述L-酪氨酸在所述培養基中的終濃度為30mg/L；所述L-蛋氨酸在所述培養基中的終濃度為20mg/L；所述腺嘌呤硫酸鹽在所述培養基中的終濃度為20mg/L；所述尿嘧啶在所述培養基中的終濃度為20mg/L。6.根據權利要求1-5中任一所述的培養基,其特征在于所述重穩定性同位素標記L-賴氨酸為L-Iysine-13C6或L_lysine-13C615N2。7.一種制備權利要求2-6中任一所述的專用培養基的方法，包括如下步驟按照所述終濃度將所述Na2HPO412H20、所述KH2PO4、所述NaCl、所述MgSO4、所述NH4C1、所述CaCl2、所述L-組氨酸鹽酸鹽、所述L-異亮氨酸、所述L-纈氨酸、所述L-亮氨酸、所述L-苯丙氨酸、所述L-色氨酸、所述L-絲氨酸、所述重穩定性同位素標記L-賴氨酸、所述L-精氨酸、所述L-蘇氨酸、所述L-酪氨酸、所述L-蛋氨酸、所述腺嘌呤硫酸鹽、所述尿嘧啶、所述鹽酸噻胺、所述葡萄糖和水混合，得到培養基。8.權利要求1-6所述的專用培養基在SILAC標記大腸桿菌蛋白質組中的應用。9.一種SILAC標記大腸桿菌蛋白質組的方法，為將大腸桿菌在權利要求1-6所述的專用培養基中培養，實現SILAC標記大腸桿菌蛋白質組。10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于所述培養的方式為37°C培養7-12代。全文摘要本發明公開了一種利用SILAC標記大腸桿菌蛋白質組的方法及其專用培養基。本發明提供一種SILAC標記大腸桿菌專用培養基，包括無機鹽、組氨酸鹽酸鹽、異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、絲氨酸、重穩定性同位素標記賴氨酸、精氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、腺嘌呤硫酸鹽、尿嘧啶、鹽酸噻胺和葡萄糖；所述無機鹽為Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、NaCl、MgSO4、NH4Cl和CaCl2。本發明的實驗證明，本發明開發的一種SILAC標記大腸桿菌專用培養基，為標記大腸桿菌蛋白質組、定量內標的制備和高精度地定量蛋白質組研究創造了條件。文檔編號C12N1/20GK102796682SQ201210276080公開日2012年11月28日申請日期2012年8月3日優先權日2012年8月3日發明者徐平,平靈艷,楊大福,常蕾申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所