一種基于質譜技術快速鑒定布魯氏菌的方法及其用途的制作方法

專利名稱：一種基于質譜技術快速鑒定布魯氏菌的方法及其用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及一種布魯氏菌核酸指紋圖譜制備的方法，以及使用該方法，對布魯氏菌進行快速鑒定的方法。
背景技術：
布魯氏菌病(Brucellosis)又稱地中海弛張熱，馬爾他熱，波浪熱或波狀熱，是由布魯氏菌引起的人畜共患性全身傳染病，主要通過皮膚、黏膜、消化道和呼吸道感染，尤其以感染羊種布魯氏菌、牛種布魯氏菌最為嚴重。豬種布魯氏菌感染人較少見，犬種布魯氏菌感染人罕見，綿羊附睪種布魯氏菌、沙林鼠種布魯氏菌基本不感染人。其臨床特點為長期發熱、多汗、關節痛及肝脾腫大等。1886年英國軍醫Bruce在馬爾他島從死于“馬爾他熱”的士兵脾臟中分離出“布魯氏菌”，首次明確了該病的病原體。1897年Wright與其同事發現 病人血清與布魯氏菌的培養物可發生凝集反應，稱為Wright凝集反應，從而建立了迄今仍用的血清學診斷方法。我國古代醫籍中對本病雖有描述，但直到1905年Boone于重慶對本病作正式報道。目前該病在世界分布，只有幾個國家消滅此病，而在中國的東北，華北，西北一帶有流行和分布，其它地區有散發，且日益廣泛和危害嚴重。對畜牧業和人類來嚴重經濟損失。布魯氏菌是一類革蘭陰性的短小桿菌，兩端鈍圓，偶見兩極濃染，一般長O. 4-1. 5um，寬O. 4^0. 8um，羊種布魯氏菌較小，長O. 3^0. 6um，近似球狀，豬種布魯氏菌和牛種布魯氏菌呈桿狀。通常呈散在狀態.很少成對或短鏈狀排列。該菌無鞭毛，無芽孢.光滑型有莢膜。常在細胞內寄生。內毒素是重要的致病物質。布魯氏菌有強侵襲力，細菌可通過完整皮膚和粘膜進入宿主。布魯氏菌有6個生物型，我國流行的是羊布魯氏菌，牛布魯氏菌和豬布魯氏菌三種，其中以羊布魯氏菌最常見。自然情況下，有60多種動物可感染布魯氏菌，其主要是山羊，綿羊，牛和豬，以流產為主，孕期動物最為宜感。人類對布魯氏菌易感，細菌進入人體后，遷延不愈，反復發作，發熱呈波浪式，如不治療，后果嚴重。布魯氏菌是需氧菌.營養要求較高，需硫胺素.煙酸胺和酵母生長素。葡萄糖.甘油和復合氨基酸可促進布魯氏菌的生長泛酸鈣和赤鮮醇也可促進某些布魯氏菌的生長；來自人或動物的標本最好接種在胰酶消化液或血液培養基中。在固體培養基上，菌落為無色.半透明.圓形.表面光滑.邊緣整齊.中央稍凸起.直徑約2 3_。有時可出現黏液樣或干燥的硬皮樣菌落；在血瓊脂平板上，表現不溶血。在液體培養基中，呈均勻混濁生長，不形成菌膜；在柯氏染色法(沙黃與孔雀綠對染)培養基上，該菌為鮮紅色，其它雜菌被染成綠色。該菌對磺胺及鏈霉京.四環素、慶大霉索等均較敏感，面對青霉素及頭孢菌素則不敏感。根據臨床癥狀、流行病學特點以及布魯斯菌以上生化特性，不難做出布魯氏菌病的初步診斷，但由于在臨床上小腸結腸炎耶氏菌、乙型副傷寒桿菌、大腸桿菌0:157感染存在相似的癥狀，必須借助實驗室診斷技術才能對布魯氏菌病進行最后確診。為了建立適合本病診斷和流行病學調查的快速、敏感、特異、準確的方法，國內外許多學者進行了大量研究，并取得了顯著的成績。先后建立了病原鑒定、熒光抗體中和檢等檢測方法。我國目前應用虎紅和試管凝集的方法，它們的敏感性及特異性差，是國際貿易淘汰的技術，且反應時間較長，與我國實際檢測普查工作需求存在一定的矛盾。目前布魯氏菌病的診斷主要依靠針對脂多糖的血清學試驗，特異性不強，常常出現假陽性結果。而且，由于布病感染后2周血中才開始出現抗體，所以感染早期血清學診斷往往出現假陰性的結果。以PCR為基礎的核酸檢測方法，對布病的早期診斷和傳染源的發現有重要意義。單重PCR檢測，當引物針對的序列發生了突變時則可能出現假陰性結果。而針對同種病原的多重PCR檢測，因為針對的是多個基因，雖假陰性率降低，但操作比較復雜。近年來，已經出現質譜技術來檢測核酸和蛋白質領域，其中質譜技術應用于核酸檢測領域的理論基礎在于，組成遺傳物質DNA的基本單元——四種核苷酸之間存在質量差異，如 ddAMP、ddCMP、ddGMP、ddTMP 的分子量依次為 271. 2Da、247. 2Da、287. 2Da、327. IDa(其中ddTMP是經過修飾的)，它們之間的最小分子量差異在16Da，完全可以通過質譜進行分 辨。使用質譜能夠對堿基突變或多態位點(SNP)、插入/缺失(InDeI)、甲基化位點、基因定量、拷貝數變化(copy number variation, CNV)等多種DNA變化類型進行檢測。已有一些公開文獻使用質譜技術對微生物進行分類和鑒定，例如，中國專利申請CN102337223A、“產黃青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin及其制備方法”，公開了一種檢測產黃青霉抗真菌蛋白Pc-Arctin的MALDI-T0F鑒定方法，其中從平板上挑取產黃青霉A096孢子接種于SGY液體培養基培養，預處理得到粗蛋白溶液在色譜柱上分離純化，并在羧甲基陽離子交換色譜柱上分離純化，收集各洗脫組分，各組分離心超濾濃縮至所需體積，以宛氏擬青霉為敏感受試指示菌，追蹤抗真菌活性組分，確定的活性成分判斷獲得蛋白的純度；割取SDS-PAGE電泳圖上的單一條帶，進行MALDI-T0F鑒定。該方法僅適用于特定微生物，且需要多重蛋白純化過程，最終用MALDI-T0F鑒定特征蛋白Pc-Arctin，其過程繁瑣、適用面窄，不能實現質譜分類細菌或微生物的目的。中國專利申請200910157210、“一種李斯特菌屬細胞中脂肪酸組分的分析方法”公開了一種利用氣相色譜質譜(GC-MS)分析法針對細菌脂肪酸進行分類的方法，包括李斯特菌復壯，用牛津瓊脂平板和胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂平板分別分離和純化李斯特菌，培養單個典型菌落的李斯特菌并制成菌懸液，用甲醛滅活處理，把經甲醛處理后的菌懸液平均分裝在離心管洗滌，用鹽酸和甲醇的混合液甲酯化，把制得的脂肪酸進行氣相色譜質譜(GC-MS)分析。雖然該方法打破傳統細菌分類學的局限，減少人為因素對傳統形態分類帶來的誤差，同時為新的菌種和毒種的分類鑒定提供強有力的工具，但該法仍然屬于利用質譜法進行細胞化學分析分類，并未針對核酸進行檢測。國際專利申請 W02010/021548、“Method for identifying biological materiale. g. bacteria in sample of patient, involves separating stream of liquidcontaining sample into successive portions to form flying drops and ionizingflying drops to measure mass spectra”,公開了一種使用MALDI-MS (基質輔助激光解吸和電離質譜)用于識別生物材料的方法和裝置，包括準備包含試樣和MALDI基質材料的液體，并將其用于形成液體的連續流束。將該流束分散成接連的部分，以形成發射到飛行中的液滴，或將流束發射到飛行中，然后分散成液滴。可使用從噴墨印刷機中已知的液滴形成技術。對飛行中的液滴電離出材料。測量來自各個液滴的電離材料的質譜。但該方法目的在于如何改善MALDI-MS檢測生物物質的靈敏度，并不涉及質譜鑒定和分類任意微生物，因此也不能解決上述技術問題。由于質譜技術檢測細菌存在著難以確定標準質譜特征圖譜的問題。也就是說，盡管不同細菌之間的基因組DNA存在差異，將產生不同的核酸指紋圖譜，但如果沒有建立標準的質譜圖譜數據庫，則因為出現每次質譜檢測細菌的結果因待檢的基因組過于龐大而缺乏重復性，導致準確度下降。例如，朱健等人(“高效液相色譜-電噴霧多級質譜法對格爾德霉素粗品中各組分的初步判別及分類”，《中國抗生素》，2011年03期)報道了應用高效液相色譜-電噴霧多級質譜法(LC-ESI-MSn)對格爾德霉素(GDM)粗品中各組分進行與質量數相關的結構信息方面的初步判別及分類。該方法針對格爾德霉素(GDM)中不同組分的多級質譜碎片進行的分析整理,并對各種化合物進行了準確分類,但并不涉及針對細菌特定物質(如核酸)進行檢測從而對細菌進行分類的方法。
劉海洪(“MALDI TOF MS在細菌檢測和鑒定中的應用”，《微生物學免疫學進展》，2003年02期)報道了“細菌體內含有大量的生物標志分子能用于細菌的化學分類和鑒定，針對如根據細菌的組成成分獲得指紋圖譜檢測和鑒定細菌”，并對該方法預測其理論上的可行性。然而，該研究僅僅是理論上探討了利用MALDI TOF MS對細菌進行分類的方向，其既沒有指明所針對細菌的何種組分進行檢測，也沒有說明具體研究方法和過程。由于細菌中可用于分類的組分(如蛋白、DNA、RNA、多糖等)種類太多，且質譜技術針對不同待測物也存在各種實驗參數的組合和選擇，因此在此之后的近10年內并沒有利用MALDI TOF MS進行細菌鑒定的新的報道。中國專利申請201110154723、“MALDI TOF MS輔助鑒定單增李斯特氏菌的方法”和201110154469、“MALDI TOF MS輔助鑒定霍亂弧菌的方法”公開了一種利用MALDI TOF MS技術輔助鑒定細菌的方法，包括預處理細菌培養物，采集所有菌株樣品的MALDI TOF MS圖譜，根據軟件制備細菌標準圖譜，使用相同的方法檢測并采集待測細菌的圖譜，以及比較二者圖譜，根據匹配分數進行判定。由于該方法使用常規的處理(通過無水乙醇、甲酸和乙腈處理，并輔以離心，最后吸取上清液進行檢測)，盡管其在一定程度上能表征該細菌的特征圖譜，但由于其待測物中含有蛋白質、脂類、脂多糖和脂寡糖、DNA、多肽及其它能被離子化的分子，其得到的圖譜實質上是上述各種分子的圖譜集合，因此既需要處理和比對的圖譜信息量過大，并且因待檢分子過于龐大而導致其圖譜特征性偏低，只適用于某具體細菌而無法推廣到其他大量的細菌檢測中。由于質譜技術檢測細菌存在的上述缺陷，導致目前使用質譜技術檢測細菌甚至布魯氏菌一直沒有進展。作為最接近的現有技術，顧超慧等人(“蛋白質組學在布魯氏菌病研究中的應用”，《疾病監測》第24卷第5期，2009)和王玉飛等人(“羊布魯氏菌的分泌蛋白質組分析”，《微生物學通報》，第36卷第8期，2009)報道了利用質譜技術分析羊布魯氏菌分泌蛋白的指紋圖譜，并根據NCBI數據庫的相關蛋白序列庫進行比對分析，從而鑒定布魯氏菌的蛋白。然而該方法仍然停留在對布魯氏菌的特征蛋白的分析上，并不涉及如何建立布魯氏菌相關核酸質譜特征庫并利用該庫進行細菌鑒定、分型的用途，因此也無法解決上述問題。因此目前需要新的布魯氏菌的鑒定和分析方法(如質譜法)來實現快速、準確、廉價、便捷的分類結果。

發明內容
本發明原理在于組成遺傳物質DNA的基本單元一四種核苷酸之間存在質量差異，對布魯氏菌基因組DNA上某個或某幾個片段進行PCR和酶切后，將產生分子量和豐度各異的片段，使用質譜檢測可產生核酸指紋圖譜，不同布魯氏菌之間基因組DNA存在差異，將產生不同的核酸指紋圖譜，建立數據庫后，可以實驗結果與數據庫中布魯氏菌標準圖譜信息進行比對，即可完成對布魯氏菌的鑒定。因此，針對布魯氏菌屬不同菌種的特定區域的DNA設計合適的引物進行PCR擴增，然后將PCR產物通過特定內切酶進行消化，產生一系列長度不一豐度不一的核酸片段，并通過MALDI-TOF MS質譜進行核酸分析檢測，并形成譜圖。對布魯氏菌目標基因序列進行擴增后酶切，得到布魯氏菌屬不同菌種的圖譜。可以實驗結果與數據庫中布魯氏菌屬標準圖譜信息進行比對，即可完成對布魯氏菌的分類和鑒定(鑒定、分型、分類等)。此方法具有特異性強，靈敏度高，成本低，操作簡便，用時少等優勢。 因此，本發明第一目的是提供一種基于酶切的布魯氏菌屬核酸指紋圖譜制備方法。其特征在于，它至少包括如下步驟(I)PCR反應使用針對細菌的PCR通用引物，分別擴增多個細菌的核酸模板，得到含擴增目標區域的PCR產物；(2) SAP酶消化用堿性磷酸酶(SAP酶)處理步驟(I)得到的PCR產物；(3)轉錄和核酸酶切使用特定的轉錄和內切酶，分別在一個反應體系中，對步驟
(2)得到的各個細菌的消化產物進行轉錄和核酸酶切，獲得一系列長度不一、豐度不一的核酸片段；(4)純化使用樹脂處理步驟(3)得到的酶切產物；(5)質譜儀檢測將步驟(4)得到的純化產物上點在含有基質的靶片上，上質譜儀進行檢測，得到不同布魯氏菌的特征核酸指紋譜圖。在一個實施方案中，PCR反應所擴增的細菌核酸序列，包括但不限定于布魯氏菌DNA基因組上一個區域。在一個實施方案中，所述通用引物包括但不限于SEQ ID No :1至SEQ ID No :2所示序列。在另一實施方案中，步驟3所述的特定酶,包括但不限于RNaseA酶。在一個具體實施方案中，步驟5的純化包括在轉錄和酶切產物中加入超純水，混勻后，再加入樹脂，上下顛倒混勻15分鐘。在另一個具體實施方案中，其中所述質譜儀是MALDI TOF MS質譜儀。上述任一方案中，其中所述細菌包括但不限于羊種布魯氏菌(Brucellamelitensis)、牛種布魯氏菌(Brucella abortus)及豬種布魯氏菌(Brucella suis)。本發明的第二目的是建立布魯氏菌屬的標準圖譜庫，至少包括上述步驟1-5，和；(6)將步驟5得到的不同分離株的核酸指紋特征圖譜，通過計算機軟件進行匯總和整理，得到布魯氏菌的標準核酸指紋特征圖譜。在一個實施方案中，所述軟件是發明人自行研究開發的BioExplore軟件，其版權號為軟著登字第136879號、登記號2009SR10700。
本發明的第三目的是提供一種快速鑒定布魯氏菌的方法，包括(I)PCR反應使用針對布魯氏菌的PCR通用引物，擴增待測菌的核酸模板，得到含擴增目標區域的PCR產物；(2) SAP酶消化用堿性磷酸酶(SAP酶)處理步驟(I)得到的PCR產物；(3)轉錄和核酸酶切使用特定的轉錄和內切酶，在一個反應體系中，對步驟(2)得到的細菌的消化產物進行轉錄和核酸酶切，獲得一系列長度不一、豐度不一的核酸片段；(4)純化使用樹脂處理步驟(3)得到的酶切產物；(5)質譜儀檢測將步驟(4)得到的純化產物上點在含有基質的靶片上，上質譜儀 進行檢測，得到該菌的核酸指紋特征圖譜；(6)將所得核酸指紋特征圖譜與庫中布魯氏菌核酸指紋特征圖譜進行比較，從而判斷待測細菌的種屬。本發明的第四目的是提供能用于布魯氏菌分類和鑒定、臨床檢驗的試劑盒，包括(I)用于擴增細菌DNA的通用引物對及其緩沖液；(2) SAP酶及其緩沖液；(3) RNAase 及其緩沖液；(4)用于純化酶切產物的樹脂；(5)用于比對核酸指紋特征圖譜的分析軟件。在一個實施方案中，其中所述引物是SEQ ID N0:l_2。在另一實施方案中，其中所述軟件是BioExplore軟件，其版權號為(軟著登字第136879 號、登記號 2009SR10700)。定義本發明所述的“細菌或布魯氏菌分類和鑒定”，包括對細菌進行鑒定和識別、分型、分種、分類。例如在食品安全檢測中(如奶制品、肉制品)，通過布魯氏菌分類或鑒定，能準確識別傳染源和細菌組成，以備采用合理措施進行保障食品安全。又如，在研究細菌的進化中，通過對布魯氏菌的識別和分類/分型，能夠確定各種布魯氏菌種屬之間的親緣遠近關系O本發明所述的布魯氏菌DNA基因組上一個區域，優選是具有高度保守同時又具有一定多態性的區域。本發明所述的保守區域或保守片段，優選是布魯氏菌rRNA區域。rRNA是研究細菌進化和親緣關系的重要指標，它含量達80%，并存在于所有細菌中，rRNA基因由保守區和可變區組成，在細菌中高度保守，素有“細菌化石”之稱，是細菌系統分類學研究中最有用和最常用的分子鐘。目前以16SrDNA進行布魯氏菌分類和鑒定的方法主要是采用PCR產物直接測序，結果與數據庫進行比對的方法。測序法應用于臨床檢測，目前存在如下問題(1)成本高；
(2)耗時；(3)對于混合樣本，測序易產生套峰，難以進行有效區分；(4)16S rDNA全長I. 5kb以上，一般需要經過兩次測序并將結果進行拼接，在這個過程中易引入誤差。如前所述，16S rDNA對布魯氏菌分類鑒定具有重要的意義，但是傳統測序等方法檢測成本高、耗時長；對于混合感染的樣品，測序法將得到混合的序列峰圖，難以進行有效的區分，并且利用質譜進行待測物分析，需要選擇合適的待測物和優化質譜參數，因此目前需要新的細菌分類技術(如質譜法)來實現快速、準確、廉價、便捷的分類結果。本發明所述的“通用引物”是能位于各種細菌基因組的待擴增區域的上下游，能在不同細菌基因組中擴增相應片段的引物。其中，本發明所述的基因組上的待擴增區域選自與SEQ ID NO:3所示序列具有至少60%同源性的序列，優選該序列具有62%、65%、68%、70%、72%、75%、78%、80%、82%、85%、88%、89%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 同源性的序列。由于對于細菌DNA (例如16S rDNA)而言，其序列通常由保守區和可變區組成，且可變區多為不連續或短片段甚至SNP形式夾雜在保守區中間或兩端，因此使用通用引物即能在不同細菌基因組中擴增相應片段。因各種細菌的該片段均具有一定同源性，故在與SEQ IDN0:3所示序列具有至少60%同源性的片段中，經過酶切和質譜后能得到待測細菌的核酸指紋特征圖譜。在一個實施方案中，羊種布魯氏菌16S rDNA的特定區域是16S rDNA序列AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGCAGGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGCCCCGCAAGGGGAG CGGCAGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAACGTACCATTTGCTACGGAATAACTCAGGGAAACTTGTGCTAATACCGTATGTGCCCTTCGGGGGAAAGATTTATCGGCAAATGATCGGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCTCACCAAGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAG，即SEQ ID N0:3。在一個具體實施方案中，該特定區域的引物是SEQ ID No 1 和 SEQ ID No :2。有益效果I、本發明基于質譜檢測技術，由于質譜檢測的高靈敏性，使用本方案對布魯氏菌存在與否的檢測下限能夠遠超出其他技術方案；2、對于不同的樣本，本發明可比對它們產生的核酸指紋圖譜，將實驗產生的核酸指紋圖譜與數據庫中布魯氏菌標準菌株的圖譜進行對比，經生物信息學分析，可以判斷該菌是否為布魯氏菌分離株；3、使用本方案可以進行布魯氏菌的分類與鑒定，并可用于臨床檢驗等方面。4、相對于現有技術，全過程僅僅數小時內完成，省時省力；5、本發明的數據庫是開放式的，可不斷補充新的分離株，不斷完善和擴大數據庫，以便更為準確的完成布魯氏菌的鑒定；6、另外，本發明首次提出將布魯氏菌的16S rDNA區域作為待測物進行質譜檢測，以獲得不同布魯氏菌種的核酸指紋圖譜，用于布魯氏菌的分類與鑒定。


圖1、2為羊種布魯氏菌的核酸指紋特征圖譜。圖3為牛種布魯氏菌的核酸指紋特征圖譜。圖4為豬種布魯氏囷的核酸指紋特征圖譜。圖5為待測樣品I的核酸指紋特征圖譜。圖6為牛布魯氏菌在抗生素SDA培養基上菌落形態圖。圖7為牛布魯氏菌在柯氏染色培養上菌落形態圖。圖8為待測樣品2的核酸指紋特征圖譜。
圖9為羊布魯氏菌在柯氏染色培養上菌落形態圖。圖10為待測樣品2的電泳檢測結果。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步詳細說明。實施例一羊種布魯氏菌核酸指紋圖譜的建立一、設計并選擇合適弓I物根據羊布魯氏菌(Brucella melitensis)的16S基因序列，設計PCR引物,分別
為
權利要求
1.一種基于酶切的布魯氏菌核酸指紋圖譜制備方法，其特征在干，它至少包括如下步驟 (1)PCR反應使用針對細菌的PCR通用引物，分別擴增多個細菌的核酸模板，得到含擴增目標區域的PCR產物； (2)SAP酶消化用堿性磷酸酶(SAP酶)處理步驟(I)得到的PCR產物； (3)轉錄和核酸酶切使用特定的轉錄和內切酶，分別在ー個反應體系中，對步驟(2)得到的各個細菌的消化產物進行轉錄和核酸酶切，獲得ー系列長度不一、豐度不一的核酸片段； (4)純化使用樹脂處理步驟(3)得到的酶切產物； (5)質譜儀檢測將步驟(4)得到的純化產物上點在含有基質的靶片上，上質譜儀進行檢測，得到布魯氏菌的特征核酸指紋譜圖。
2.根據權利要求I的方法，其中通用引物包括但不限于SEQID No 1和SEQ ID No 2所示序列；且用于核酸酶切的特定酶，包括但不限于RNaseA酶。
3.權利要求I或2的方法，其中步驟5的純化包括在轉錄和酶切產物中加入超純水，混勻后，再加入樹脂，上下顛倒混勻15分鐘；所述質譜儀是MALDI TOF MS質譜儀。
4.權利要求1-3中任ー項的方法，其中所述布魯氏菌包括常見的對人感染的幾種布魯氏國。
5.利用權利要求I的方法用于建立布魯氏菌核酸指紋特征圖譜庫的方法，至少包括上述步驟1-5，和； (6)將步驟5得到的各種布魯氏菌的核酸指紋特征圖譜，通過計算機軟件進行匯總和整理，得到所述的布魯氏菌核酸指紋特征圖譜庫。
6.權利要求7的方法，其中所述軟件是BioExplore軟件，其版權號為軟著登字第136879 號、登記號 2009SR10700。
7.利用權利要求5或6的方法所建立的布魯氏菌核酸指紋特征圖譜，用于布魯氏菌鑒定或分類的方法，包括 (I )PCR反應使用針對細菌的PCR通用引物，擴增待測細菌的核酸模板，得到含擴增目標區域的PCR產物； (2)SAP酶消化用堿性磷酸酶(SAP酶)處理步驟(I)得到的PCR產物； (3)轉錄和核酸酶切使用特定的轉錄和內切酶，在一個反應體系中，對步驟(2)得到的細菌的消化產物進行轉錄和核酸酶切，獲得ー系列長度不一、豐度不一的核酸片段； (4)純化使用樹脂處理步驟(3)得到的酶切產物； (5)質譜儀檢測將步驟(4)得到的純化產物上點在含有基質的靶片上，上質譜儀進行檢測，得到該菌株的核酸指紋特征圖譜； (6)將所得核酸指紋特征圖譜與布魯氏菌核酸指紋特征圖譜庫進行比較，從而判斷待測菌株的類別或種屬。
8.權利要求7的方法,其中步驟6通過BioExplore軟件進行比較檢測。
9.提供能用于布魯氏菌分類和鑒定、臨床檢測的試劑盒，包括 (1)用于擴增細菌DNA的通用引物對及其緩沖液； (2)SAP酶及其緩沖液；(3)RNAase及其緩沖液； (4)用于純化酶切產物的樹脂； (5)用于比對核酸指紋特征圖譜的分析軟件。
10.權利要求9的試劑盒，其中所述引物是SEQ ID NO: 1-2，所述軟件是BioExplore軟件，其版權號為(軟著登字第136879號、登記號2009SR10700)。
全文摘要
一種基于質譜技術快速鑒定布魯氏菌的方法及其用途，本發明公開了一種用于快速鑒定布魯氏菌的方法，包括PCR擴增、SAP酶消化、轉錄和核酸酶切、純化、質譜儀檢測等步驟。基于該方法，建立常見布魯氏菌的核酸指紋圖譜數據庫。根據實驗產生的質譜峰圖，可對待檢樣品中的布魯氏菌進行分類與鑒定，結果可廣泛運用于布魯氏菌的分型和分類、及環境衛生和公共安全檢疫等領域。
文檔編號C12Q1/68GK102851362SQ20121027386
公開日2013年1月2日 申請日期2012年8月2日 優先權日2012年8月2日
發明者馬慶偉, 趙洪斌, 張海燕, 趙艷梅 申請人:向華