專利名稱：一種擬穴青蟹基于微衛星標記的系譜認證方法
技術領域：
本發明屬于擬穴青蟹養殖分子標記輔助育種領域，特別涉及一種擬穴青蟹基于微衛星標記的系譜認證方法。
背景技術：
擬穴青蟹(Scylla paramamosain)屬節肢動物門(Arthropoda)、甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae)、青蟹屬(Scylla),在我國主要分布于長江口及以南沿海海域，是我國重要的海洋漁業資源和海水養殖蟹類。擬穴青蟹具有體型大、生長快、肉味鮮美等優點，頗受廣大消費者青睞。近年來，我國擬穴青蟹的人工養殖年產量一直穩定在10萬噸以上，保持了健康的發展勢頭。在擬穴青蟹家系選擇育種中，需要將培育的多個家系混合在一個池塘中進行養殖，以保持養殖環境等因素的一致性，并對不同家系的生長、抗逆性能進行評價，從而選擇表現優秀的家系進行育種。育種學家常采用物理標記，如注射熒光粉的方法對混養的家系進行區分。由于擬穴青蟹等甲殼類動物營蛻殼生長方式，因此，隨著蛻殼次數的增加，物理標記將隨之減弱或消失。采用分子標記的方法進行輔助育種，能夠起到很好的效果。微衛星標記是一種共顯性分子標記，已經在動物新品種選育中得到了應用。目前，尚未見微衛星分子標記在擬穴青蟹選擇育種中應用的研究報道。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種擬穴青蟹基于微衛星標記的系譜認證方法，該方法能夠克服物理標記的不足，可準確、有效區分擬穴青蟹不同家系來源的個體，適用于家系選育中鑒定混合養殖的多家系來源的不同個體，將促進擬穴青蟹人工選育工作健康、快速發展，具有良好的應用前景。本發明的一種擬穴青蟹基于微衛星標記的系譜認證方法，包括(I)取擬穴青蟹肌肉組織100_150mg，置于500 600 μ I組織提取液中剪碎，加入終濃度為2(T25mg/ml的蛋白酶K和終濃度為100 110 μ g/ml的RNase A, 55 60°C下消化2-3個小時；用混合液抽提，然后用組織提取液2倍體積的無水乙醇沉淀DNA，再經乙醇洗滌和自然干燥后，溶解于5(Γ60μ I TE緩沖液中；最后將DNA濃度稀釋為10(Tll0ng/μ 1，并保存在_20°C備用；(2)采用微衛星引物對上述得到的待檢測個體的DNA進行PCR擴增；(3)采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離PCR擴增產物，對PCR擴增產物進行染色和顯色，根據擴增產物的不同遷移距離確定擬穴青蟹個體的基因型；(4)利用軟件對上述擬穴青蟹基因型進行分析得到聚類圖譜，用以區分擬穴青蟹個體。所述步驟(I)中的組織提取液的組分為10mmol/L Tris-Cl, ρΗ8· O ; 100mmol/LEDTA, ρΗ8· 0 ； IOOmmoI/L NaCl ；0.5wt%SDS。
所述步驟(I)中的混合液為體積比25:24:1的苯酚、氯仿和異戊醇。所述步驟(I)中的TE 緩沖液的組分為 10mmol/L Tris-HCl, pH8. 0 ；10mmol/LEDTA, pH8. 0。所述步驟(2)中的微衛星引物共7對，如表I所示表I本發明所用的7對微衛星引物的序列、退火溫度及GenBank登陸號
權利要求
1.一種擬穴青蟹基于微衛星標記的系譜認證方法，包括 (1)取擬穴青蟹肌肉組織100-150mg，置于50(Γ600μI組織提取液中剪碎，加入終濃度為2(T25mg/ml的蛋白酶K和終濃度為10(Γ 10μ g/ml的RNase A，55 60°C下消化2-3個小時；用混合液抽提，然后用組織提取液2倍體積的無水乙醇沉淀DNA，再經乙醇洗滌和自然干燥后，溶解于50 60 μ I TE緩沖液中；最后將DNA濃度稀釋為100 IlOng/ μ 1，并保存在-20°C備用； (2)采用微衛星引物對上述得到的待檢測個體的DNA進行PCR擴增； (3)采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離PCR擴增產物，對PCR擴增產物進行染色和顯色，根據擴增產物的不同遷移距離確定擬穴青蟹個體的基因型； (4)利用軟件對上述擬穴青蟹基因型進行分析得到聚類圖譜，用以區分擬穴青蟹個體。
2.根據權利要求I所述的一種擬穴青蟹基于微衛星標記的系譜認證方法，其特征在于所述步驟(I)中的組織提取液的組分為10mmol/L Tris-Cl, pH8. O ；100mmol/LEDTA, ρΗ8· O ； IOOmmoI/L NaCl ；0.5wt%SDS。
3.根據權利要求I所述的一種擬穴青蟹基于微衛星標記的系譜認證方法，其特征在于所述步驟(I)中的混合液為體積比25:24:1的苯酚、氯仿和異戊醇。
4.根據權利要求I所述的一種擬穴青蟹基于微衛星標記的系譜認證方法，其特征在于:所述步驟(I)中的TE緩沖液的組分為IOmmoI/L Tris-HCl, ρΗ8· O ；10mmol/L EDTA,ρΗ8· O0
5.根據權利要求I所述的一種擬穴青蟹基于微衛星標記的系譜認證方法，其特征在于所述步驟(2)中的微衛星引物共7對，特征如下Scypal:F:CCCTACCTACCATTACACCC ；R:TATTACAAAGGACAGCCAGACA ； 退火溫度為53. 50C ；Scypa3:F:GCGGTTCATTTGCTTCG ；R:GAGACTGGGTTGTCCTTA ； 退火溫度為54 °C ；Scypa5:F:ATAGTTGCTGGTTGATGAAG ；R:GGTCTGCGGCGAAT ； 退火溫度為54 °C ；Scypa7:F:GCTCTGAGGCAAGAAG ；R:TTAGCCATACATCTCCCAT ； 退火溫度為62°C ；Scypa8:F:ACGAGACAGAGGGAGGC ；R:GGG TTCGAGATACAAGAT ； 退火溫度為63°C ；ScypalI:F:AACGCTACATCATACTGC ；R:CTGTTGCTATTTCTGCTT ； 退火溫度為48°C ；ScpaOI:F:CGATTAACCATGCCTTAAAATAA ；R:ATCAGCTCAGGGCAAAACTGA ； 退火溫度為54 °C。
6.根據權利要求I所述的一種擬穴青蟹基于微衛星標記的系譜認證方法，其特征在于所述步驟(2)中的PCR擴增條件為 PCR反應體系包括基因組DNA模板I μ I、終濃度均為O. 4μ mol/L的上下游引物、終濃度為 1.5mmol/L Mg2+、終濃度為 O. 2mmol/L dNTP、0. 75U Tag DNA聚合酶和 IXPCR buffer,最后補充滅菌雙蒸水至總體積為25μ I ; PCR反應程序為94°C預變性5分鐘，94°C變性30秒，特異性退火溫度退火50秒，72°C延伸50秒，30個循環；最后于72°C延伸7分鐘。
7.根據權利要求I所述的一種擬穴青蟹基于微衛星標記的系譜認證方法，其特征在于所述步驟(3)中的變性聚丙烯酰胺凝膠質量百分比濃度為6%。
8.根據權利要求I所述的一種擬穴青蟹基于微衛星標記的系譜認證方法，其特征在于所述步驟(4)中的利用軟件對擬穴青蟹基因型進行分析具體為將擬穴青蟹基因型數據轉換為生物學軟件NTsys2. I所識別的格式，根據使用說明書的提示，計算得到兩兩個體間的遺傳距離；再將距離矩陣輸入軟件MEGA4. O,采用UPGMA法進行聚類分析，即得聚類圖-i'TfeP曰。
全文摘要
本發明涉及一種擬穴青蟹基于微衛星標記的系譜認證方法，包括(1)基因組DNA提取；(2)微衛星引物的PCR擴增；(3)擴增產物的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳；(4)家系區分。本發明能夠克服物理標記的不足，可準確、有效區分擬穴青蟹不同家系來源的個體，適用于家系選育中鑒定混合養殖的多家系來源的不同個體，將促進擬穴青蟹人工選育工作健康、快速發展，具有良好的應用前景。
文檔編號C12Q1/68GK102816843SQ20121027361
公開日2012年12月12日 申請日期2012年8月2日 優先權日2012年8月2日
發明者馬洪雨, 馬群群, 馬凌波, 馬春艷, 喬振國 申請人:中國水產科學研究院東海水產研究所