專利名稱：水稻轉錄因子Os05g41070基因的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于遺傳工程領域，具體地說，涉及水稻轉錄因子0s05g41070基因的應用。
背景技術：
在長日照植物(LDP)擬南芥(Baurle和 Dean, 2006; Imaizumi 和 Kay, 2006)和短日照植物(SDP)水稻(Izawa，2007;Tuji等，2008)中，開花信號途徑已得到了廣泛的研究。GI-CO-FT是控制水稻開花保守的途徑(Yano等，2000; Kojima等，2002; Hayama等，2002)。Hd3a是水稻中FT的同源基因，它受到一個B-型響應調控子Ehdl的誘導，該途徑在短日照條件下獨立于Hdl基因(Doi等，2004)。0sMADS51受OsGI的調控，該作用位于Ehdl的上 游(Kim等，2007)。相反，在長日照條件下，Hdl抑制Hd3a的表達而推遲水稻開花(Hayama等，2003)。最新研究表明，Hd3a與14-3-3蛋白形成復合體后轉入細胞核內，與轉錄因子FDl結合形成三聚體FAC (f lorigen activation complex),誘導0sMADS15的轉錄,從而導致水稻開花。VP16最早在動物病毒基因中發現，現已被廣泛應用到植物中，主要用于植物基因的轉錄調控的研究中。轉錄因子在體內的作用大體上可以分成兩種一種為轉錄增強子，另一種為轉錄抑制子。當轉錄因子和VP16功能域基序融合之后，它就會增強轉錄因子的功能，從而在轉基因植株中出現更明顯的表型變化。
發明內容
本發明的目的是提供水稻轉錄因子0s05g41070基因的應用。為了實現本發明目的，本發明首先提供一種融合蛋白，該融合蛋白為0s05g41070-Linker- (VP16) n 或(VP16) n-Linker_0s05g41070 ;其中，η 為彡 I 的整數;Linker由1 20個柔性氨基酸串聯而成(例如，GGGGG, GPPPG,或Gatway載體重組位點編碼的氛基酸序列DPAFLYKVVPR) ；VP16為來自單純抱疫病毒(Herpes simplex virus)的VP16蛋白；0s05g41070為水稻轉錄因子0s05g41070，其氨基酸序列如SEQ ID No. I所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。優選地，前述融合蛋白中η為4。其中，(VP16)4即VP64，是由4個VP16功能域基序融合在一起組成的增強子，其氨基酸序列如SEQID No. 2所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。更優選地，前述融合蛋白為0s05g41070-Linker_ (VP16)4。本發明還提供編碼所述融合蛋白的基因，以及在嚴格條件下，可與該基因的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；其中，所述嚴格條件為65°C，在O. I X SSPE或O. 1XSSC、0. 1%SDS的溶液中雜交并洗膜。本發明還提供含有編碼所述融合蛋白的基因的載體。所述載體為任一種可引導外源基因在宿主中表達的載體。優選地，所述載體為植物雙元表達載體(例如，PCAMBIA1301)。在將本發明編碼所述融合蛋白的基因構建到植物表達載體中時，可在其轉錄起始核苷酸前添加任一種強啟動子(例如，玉米強啟動子Ubiquitin)或誘導型啟動子。此外，在將本發明編碼所述融合蛋白的基因構建到植物表達載體中時，還可以使用增強子，且這些增強子區域必須與編碼序列的閱讀框相同，以確保整條序列的翻譯。本發明還提供含有編碼所述融合蛋白的基因的轉基因細胞系。 本發明還提供含有編碼所述融合蛋白的基因的工程菌。本發明還提供編碼所述融合蛋白的基因在推遲水稻抽穗、延長生育期中的應用。
本發明進一步提供水稻轉錄因子0s05g41070基因的應用，其是將水稻轉錄因子0s05g41070基因的⑶S序列(完整翻譯區)構建到4個轉錄因子激活基序VP16的上游，轉化植物，篩選并最終獲得轉基因植物。前述的應用，其是將水稻轉錄因子0s05g41070基因的CDS序列通過Gateway系統構建到4個轉錄因子激活基序VP16的上游，轉化水稻(例如，水稻品種‘kitaake’)，從而推遲轉基因水稻的抽穗期、延長生育期。其中，水稻轉錄因子0s05g41070基因的⑶S序列如SEQ IDNo. 3所示,4個轉錄因子激活基序VP16的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。攜帶有編碼所述融合蛋白的基因的表達載體可通過使用Ti質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、微注射、電穿孔等常規生物技術方法導入植物細胞中(Weissbach，1998，Method for Plant Molecular Biology VIII, Academy Press, New York,第 411-463 頁；Geiserson 和 Corey,1998, Plant Molecular Biology, 2nd Edition)。本發明首次利用轉錄因子激活基序VP64 (即4個轉錄因子激活基序VP16)與水稻轉錄因子0s05g41070基因融合構建得到組成型轉錄因子，并轉化到農作物，如水稻中，從而推遲轉基因水稻的抽穗期、延長生育期。對于詳細闡明水稻抽穗調控的分子機理，具有重要的理論價值，并且可以通過轉基因手段，延長水稻生育期，改善水稻對不同生態區的適應能力，因此在生產中同樣具有重要意義。
圖I為本發明實施例I中cVP64-bar_asRED載體圖譜。圖2為本發明實施例I中ubi:0s05g41070-VP64載體圖譜。圖3為本發明實施例3中Western Blot檢測轉基因陽性水稻株系的結果；其中，WT為野生型水稻‘kitaake’，bzip74_VP64為0s05g41070_VP64轉基因水稻株系。圖4為本發明實施例4中0s05g41070-VP64轉基因水稻株系的表型分析結果；其中，WT為野生型水稻‘kitaake’，bzip74_VP64為0s05g41070_VP64轉基因水稻株系。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。實施例I水稻轉錄因子0s05g41070基因的獲得及植物表達載體的構建登錄 http://rice. plantbiology. msu. edu/analyses_search_locus. shtml 網站，找到水稻轉錄因子0s05g41070基因，根據其序列設計PCR擴增引物0s05g41070-F :5’-CAAAAAAGCAGGCTTCATGATTCAGGCAATGGCTTCGCA-3’
0s05g41070-R:5’-CAAGAAAGCTGGGTCGAAGGCGGCCGAGCTTGTTCGCCT-3’以水稻‘日本晴’葉片為材料，TRIzol法提取總RNA，反轉錄得cDNA，反應步驟如下(1)在冰上向不含核酸酶的PCR反應管中依次加入下列物質總RNA
6μ I (O. lng-5 μ g), Oligo (dT) 18 引物 1μ 1，不含核酸酶的 ddH20 5 μ 1，置于 PCR 儀中65°C反應5min ； (2)然后再加入下列物質5X反應緩沖液4 μ 1，RNase抑制劑I μ 1，IOmMdNTP2y I, M-Mμ IV反轉錄酶I μ 1，輕輕混勻，在PCR儀中45°C反應60min ; (3) PCR儀中，700C 5min，終止反應。以總cDNA為模板，進行PCR擴增，擴增體系為反應緩沖液25 μ 1，dNTP 4 μ I, ddH2017. 5μ I, Taq DNA 聚合酶 O. 5 μ 1，反應程序為熱啟動 98°C 10s，57°C 5s，72°C lmin,30個循環后，72°C延伸lOmin，最后25°C反應結束。獲得水稻轉錄因子0s05g41070基因的CDS序列，其核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。按照PrimeSTAR聚合酶擴增體系和反應程序進行PCR。根據Gateway克隆技術的要求，此過程中包含兩輪PCR,第一輪PCR的引物用加部分adaptor attB接頭的引物，而第二輪的模板用第一輪的PCR產物，并且引物采用完整的adaptor attB引物。將PCR·產物克隆到連接PDONR克隆載體上，經測序鑒定得到與目的基因完全相同的序列。通過LR反應將0s05g41070基因構建到植物表達載體cVP64-bar_asRED (圖I)上，獲得載體ubi:0s05g41070-VP64 (圖 2，載體全序列如 SEQ ID No. 6 所示)。其中，植物表達載體cVP64-bar_asRED的構建過程為以雙元表達載體pCAMBIA1300左右邊界包含的序列為骨架序列，通過體外重組，將ubipromoter_Gateway-VP64 表達單兀、35S promoter-asRED 表達單兀和 35S promoter-bar 表達單元與之融合構建得到，載體cVP64-bar_asRED的全序列如SEQ ID No. 5所示。實施例2轉基因水稻植株的獲得取水稻‘kitaake’成熟種子，人工或機械脫殼，挑選飽滿光潔無菌斑的種子經消毒之后接種到誘導培養基上進行誘導培養。選擇外觀良好，生長力好的水稻愈傷組織為受體材料，采用農桿菌介導法將ubi :0s05g41070-VP64轉入水稻愈傷組織中，用含有100 μ M的乙酰丁香酮和0. D.值為0. 7的農桿菌的AAM轉化液進行轉化，將轉化液浸泡過的愈傷組織置于共培養基上進行共培養，25°C暗培養3d后置于篩選培養基上培養約30d,每IOd繼代一次。然后將篩出的抗性愈傷轉移到分化培養基上分化約20d，每IOd繼代一次。將分化出綠色小苗的抗性愈傷轉移到生根培養基上生根，待約7d長出發達根系后煉苗，并計算轉化所獲轉基因苗數。煉苗7d后轉移至大田生長。用Basta篩選轉基因水稻，長出4片幼葉后開始噴灑Basta(l: 1000，v:v)，隔I天噴I次，共噴灑3次。共獲得轉基因水稻20株。其中，誘導培養基配方為N6大量+B5微量+NB有機+鐵鹽+銅鈷母液+2. 5mg/L2，4D+0. 6g/L酸水解酪蛋白+2. 878g/L脯氨酸+0. 5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制，調pH至5. 8^5. 9后加入植物凝膠4g/L。共培養基配方為N6大量+B5微量+NB有機+鐵鹽+2. 5mg/L2, 4D+0. 5g/L谷氨酰胺+0. 6g/L酸水解酪蛋白+10g/L葡萄糖+30g/L鹿糖，以水配制,調pH至5. 2后加入植物凝膠4g/L。滅菌后，50°C左右加入AS (乙酰丁香酮)10(T200yg/mL。篩選培養基配方為N6大量+B5微量+NB有機+鐵鹽+銅鈷母液+2. 5mg/L2, 4D+0. 6g/L酸水解酪蛋白+2. 878g/L脯氨酸+0. 5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制，調pH至5. 8^5. 9后加入植物凝膠4g/L。滅菌后加入35mg/L潮霉素(購自上海紐津生物技術有限公司)或5mg/L Bialaphos (購自北京拜爾迪生物技術公司)。分化培養基配方為MS無機+MS-B5微量+MS有機+鐵鹽+MS-銅鈷母液+0. 05mg/L NAA+2. Omg/L Kinetin (激動素)+30g/L山梨醇+2g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖，以水配制，調pH至5. 8^5. 9后加入植物凝膠4g/L。實施例3Western Blot檢測轉基因水稻中融合蛋白0s05g41070_VP64的表達為檢測0s05g41070_VP64基因在T2代轉基因水稻中的過表達情況，利用VP64抗體對其在蛋白質水平上進行鑒定，經過SDS-PAGE蛋白電泳一免疫印記一免疫熒光反應，Western Blot鑒定結果表明轉基因植株存在目的蛋白，而野生型未雜出條帶(圖3)。具體的Western Blot實驗流程如下將適量樣品放入液氮冰凍后研磨成粉末，加入適量上樣緩沖液混勻，12000rpm離 心10分鐘;取5 μ I上清加樣，以90V電壓SDS-PAGE電泳30分鐘后，120V電泳60-90分鐘，當溴酚藍到達凝膠的底端即可停止電泳；電泳后采用半干轉移法轉膜，并用麗春紅染色液對膜進行染色，觀察轉膜效果；轉膜完畢后，將膜放入含5%的脫脂奶粉的PBST溶液中封閉室溫封閉60分鐘或4°C過夜；室溫下一抗(VP64抗體)孵育I小時或4°C孵育過夜,然后用PBST洗滌3次，每次5分鐘；室溫下二抗(羊抗兔，購自Abmart，貨號M21002S)孵育I小時，然后用PBST洗滌3次，每次5分鐘；在膜上加入底物，進行曝光。其中，VP64抗體是由艾比瑪特生物醫藥(上海)有限公司根據VP64的氨基酸序列合成多肽作為特異抗原而制備的兔源多抗。實施例4轉基因水稻表型分析與野生型水稻‘kitaake’相比，0s05g41070-VP64轉基因水稻株系bzip74-VP64的抽穗期明顯推遲，野生型雖已抽穗，但轉基因株系的劍葉仍未完全抽出(圖4)。以上提供的實施例是將水稻轉錄因子0s05g41070基因的CDS序列通過Gateway系統構建到4個轉錄因子激活基序VP16的上游，轉化水稻品種‘kitaake’，從而推遲轉基因水稻的抽穗期、延長生育期。同樣地，將水稻轉錄因子0s05g41070基因的⑶S序列通過Gateway系統構建到彡I個轉錄因子激活基序VP16的下游,或通過Gateway系統構建到1 3個或4個以上轉錄因子激活基序VP16的上游，轉化水稻品種，也能夠達到推遲轉基因水稻的抽穗期、延長生育期的效果。雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
權利要求
1.一種融合蛋白，其特征在于，該融合蛋白為Os05g41070-Linkei'- (VP16)n或(乂 16)n-Linker-0s05g41070 ； 其中，η為彡I的整數；Linker由廣20個柔性氨基酸串聯而成；VP16為來自單純皰疹病毒(Herpes simplex virus)的 VP16 蛋白;0s05g41070 為水稻轉錄因子 0s05g41070。
2.根據權利要求I所述的融合蛋白，其特征在于，η為4。
3.根據權利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，該融合蛋白為0s05g41070-Linker- (VP16)4。
4.編碼權利要求1-3任一項所述融合蛋白的基因。
5.含有權利要求4所述基因的載體。
6.含有權利要求4所述基因的轉基因細胞系。
7.含有權利要求4所述基因的工程菌。
8.權利要求4所述的基因在推遲水稻抽穗、延長生育期中的應用。
9.水稻轉錄因子0s05g41070基因的應用，其特征在于，其是將水稻轉錄因子0s05g41070基因的⑶S序列構建到4個轉錄因子激活基序VP16的上游，轉化植物，篩選并最終獲得轉基因植物。
10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于，其是將水稻轉錄因子0s05g41070基因的⑶S序列通過Gateway系統構建到4個轉錄因子激活基序VP16的上游，轉化水稻，從而推遲轉基因水稻的抽穗期、延長生育期。
全文摘要
本發明涉及水稻轉錄因子Os05g41070基因的應用，其是利用轉錄因子激活基序VP64(即4個轉錄因子激活基序VP16)與水稻轉錄因子Os05g41070基因融合構建得到組成型轉錄因子，并轉化到農作物如水稻中，從而推遲轉基因水稻的抽穗期、延長生育期。對于詳細闡明水稻抽穗調控的分子機理，具有重要的理論價值，并且可以通過轉基因手段，延長水稻生育期，改善水稻對不同生態區的適應能力，因此在生產實踐中同樣具有重要意義。
文檔編號C12N1/21GK102775498SQ20121027254
公開日2012年11月14日 申請日期2012年8月1日 優先權日2012年8月1日
發明者劉軍, 劉斌, 張春雨, 李宏宇, 林辰濤, 趙濤 申請人:中國農業科學院作物科學研究所