專利名稱：一種通過發酵補料培養分批培養提高酶活力的方法
技術領域：
本發明涉及一種通過發酵補料培養分批培養提高酶活力的方法。
背景技術：
19世紀末，從丙烯酰氯與氨首次合成了丙烯酰胺。1954年，美國氰氨公司采用丙烯腈硫酸水解工藝進行工業生產。1972年，日本三井東壓化學公司首先建立了骨架銅催化丙烯腈水合制丙烯酰胺的工業裝置，此后各國相繼開發了不同類型的催化劑，采用此項工藝進行工業生產。80年代，日本日東化學工業公司實現了用生物催化劑由丙烯腈制丙烯酰胺的工業生產。微生物法是利用生物技術培養出的細胞體作為酶催化劑，在適宜的條件下
催化丙烯腈合成丙烯酰胺。微生物催化法生產丙烯酰胺的關鍵是制備高活力的腈水合酶。腈水合酶活力的提高，有利于丙烯腈向丙烯酰胺反應方向進行，降低丙烯酰胺生產成本，提高生產效率，對微生物法生產丙烯酰胺工業的發展有重要的意義。
發明內容
本發明的目的在是提供一種通過發酵補料培養分批培養提高酶活力的方法，提高發酵獲得的腈水合酶的活性，從而促進后續水合生產丙烯酰胺。為了解決上述技術問題，本發明的技術方案為一種通過發酵補料培養分批培養提高酶活力的方法，其特征在于包括以下步驟
1)種子培養將諾卡氏菌用固體培養基在28°C培養箱中活化90-120 h,挑接菌落于三角瓶中進行種子培養，將三角瓶置于溫度設定為28±2°C、轉速為150-200 r/min的搖床中培養48 h ；
2)補料分批發酵將5%種子液接種于發酵培養基中進行補料分批發酵培養，發酵條件為發酵培養使用2. 5L的自動控制發酵罐，發酵體積為1.2 L，發酵溫度28±2°C，攪拌轉速150-200 r/min，通氣量為35-40 L/min，pH值和溶解氧由發酵罐控制單元控制，在發酵過程中，向發酵培養基中補加堿液和葡萄糖，滿足菌體生長和腈水合酶合成營養的需要，延長菌體生長時間，培養40-50h后發酵結束，測菌體酶活。進一步地，所述的固體培養基成分為葡萄糖20 g/L、磷酸氫二鉀0. 5 g/L、酵母膏5g/L、蛋白胨5 g/L、硫酸鎂0. lg/L、味精lg/L、磷酸氫二鉀0. 5g/L，尿素7g/L，瓊脂20 g/L0進一步地，所述的發酵培養基成分為葡萄糖25 g/L、酵母膏5 g/L、尿素8g/L、味精I. 5 g/L、磷酸二氫鉀0. 8/L、磷酸氫二鉀0. 8 g/L、硫酸鎂I. Og/L、消泡劑150ppm。進一步地，所述的堿液補加工藝為當發酵液的pH小于6時，通過補加堿液使發酵液pH值維持在6. 0-7.0。進一步地,所述的堿液為氫氧化鈉或氨水,所述的pH值為6. 5。進一步地，所述的堿液為氨水。進一步地，所述的補糖工藝為在發酵中后期，通過補加150_180g/L的葡萄糖溶液使其濃度保持在6-15g/L。本發明的有益效果采用本發明在發酵過程中，通過向發酵培養基中補加堿液和葡萄糖，滿足菌體生長和腈水合酶合成營養的需要，不僅能延長菌體生長時間，而且使諾卡氏菌產酶水平有了較大的提高，該工藝的酶活達到2934. 6U/ml為分批發酵的9. 3倍，補料方式簡單易行，便于操作。
具體實施方式
實施例I分批發酵對照試驗 (I)固體培養基
葡萄糖20 g/L、磷酸氫二鉀0. 5 g/L、酵母膏5g/L、蛋白胨5 g/L、硫酸鎂0. lg/L、味精lg/L、磷酸氫二鉀0. 5g/L,尿素7g/L,瓊脂20 g/L。
(2)發酵培養基
葡萄糖25 g/L、酵母膏5 8/1、尿素88/1、味精1.5 g/L、磷酸二氫鉀0.8/L、磷酸氫二鉀
0.8 g/L、硫酸鎂 I. Og/L、消泡劑 150ppm。(3)種子培養
將諾卡氏菌用固體培養基在28 °C培養箱中活化90-120 h,挑接菌落于三角瓶中進行種子培養，將三角瓶置于溫度設定為28±2°C、轉速為150-200 r/min的搖床中培養48h ；
(4)分批發酵培養
腈水合酶發酵制備在2. 5 L自動控制發酵罐中進行，發酵條件為發酵體積為I. 2 L，發酵溫度28±2°C，攪拌轉速150-200 r/min，通氣量為35-40 L/min。(5)發酵結果
發酵進行40h后結束，酶活為314. 56U/ml。實施例2補料分批發酵
(I)(2) (3)步驟同實施例I
(4)補料發酵培養
以5%的接種量接入發酵培養基，發酵培養使用2. OL發酵罐，裝液量I. 2L，發酵溫度28±2°C，攪拌轉速150-200 r/min，通氣量為35-40 L/min。當發酵培養基中溶液pH小于
6.5時，補加2%的氨水維持發酵液pH在6. 5，在發酵中后期，補加180g/L的葡萄糖溶液使其濃度保持在6-15g/L。(5)發酵結果
發酵進行50h后結束，與對照分批發酵延長了 10h，補料分批式培養的菌體酶活達到2934. 6 U/ml，為分批發酵的9. 3倍。
權利要求
1.一種通過發酵補料培養分批培養提高酶活力的方法，其特征在于包括以下步驟 1)種子培養將諾卡氏菌用固體培養基在28°C培養箱中活化90-120 h,挑接菌落于三角瓶中進行種子培養，將三角瓶置于溫度設定為28±2°C、轉速為150-200 r/min的搖床中培養48 h ； 2)補料分批發酵將5%種子液接種于發酵培養基中進行補料分批發酵培養，發酵條件為發酵培養使用2. 5L的自動控制發酵罐，發酵體積為I. 2 L,發酵溫度28±2°C，攪拌轉速150-200 r/min，通氣量為35-40 L/min，pH值和溶解氧由發酵罐控制單元控制，在發酵過程中，向發酵培養基中補加堿液和葡萄糖，滿足菌體生長和腈水合酶合成營養的需要，延長菌體生長時間，培養40-50h后發酵結束，測菌體酶活。
2.根據權利要求書I種子培養基，其特征在于固體培養基成分為葡萄糖20g/L、磷酸氫二鉀0.5 g/L、酵母膏5g/L、蛋白胨5 g/L、硫酸鎂0. lg/L、味精lg/L、磷酸氫二鉀0. 5g/L，尿素 7g/L，瓊脂 20 g/L。
3.根據權利要求書I所述的一種通過發酵補料培養分批培養提高酶活力的方法，其特征在于所述的發酵培養基成分為葡萄糖25 g/L、酵母膏5 8/1、尿素88/1、味精1.5 g/L、磷酸二氫鉀0. 8/L、磷酸氫二鉀0. 8 g/L、硫酸鎂I. Og/L、消泡劑150ppm。
4.根據權利要求書I所述的一種通過發酵補料培養分批培養提高酶活力的方法，其特征在于所述的堿液補加工藝為當發酵液的PH小于6時，通過補加堿液使發酵液pH值維持在 6. 0-7.0。
5.根據權利要求書4所述的一種通過發酵補料培養分批培養提高酶活力的方法，其特征在于所述的堿液為氫氧化鈉或氨水，所述的pH值為6. 5。
6.根據權利要求書5所述的一種通過發酵補料培養分批培養提高酶活力的方法，其特征在于所述的堿液為氨水。
7.根據權利要求書I所述的一種通過發酵補料培養分批培養提高酶活力的方法，其特征在于所述的補糖工藝為在發酵中后期，通過補加150-180g/L的葡萄糖溶液使其濃度保持在6-15g/L。
全文摘要
本發明涉及一種通過發酵補料培養分批培養提高酶活力的方法。在發酵過程中，通過向發酵培養基中補加堿液和葡萄糖，滿足菌體生長和腈水合酶合成營養的需要，不僅能延長菌體生長時間，而且使諾卡氏菌產酶水平有了較大的提高，該工藝的酶活達到2934.6U/ml為分批發酵的9.3倍，補料方式簡單易行，便于操作。
文檔編號C12R1/365GK102776168SQ20121025162
公開日2012年11月14日 申請日期2012年7月20日 優先權日2012年7月20日
發明者丁建華, 曹艷, 楊濤, 沈瑞華, 熊光輝, 錢小方, 顧稀平 申請人:江蘇南天農科化工有限公司