專利名稱：利什曼原蟲液體培養基及其制備方法
技術領域：
本發明涉及黑熱病疫情監測和黑熱病診斷的液體培養基技術領域，是一種利什曼原蟲液體培養基及其制備方法。
背景技術：
黑熱病是我國《傳染病法》規定的乙類傳染病之一，是由利什曼原蟲引起的一種自然疫源性寄生蟲病，白蛉是傳播媒介，患病的人和動物是主要傳染源；有些地方的傳染源和傳播媒介還沒有查明。2012年WHO報告，利什曼病包括黑熱病，廣泛分布于88個國家和地區，每年新增病例2百萬，總病例已達到I. 2億，有3. 5億人處在該病的威脅中。近些年全世界的黑熱病患者人數呈上升趨勢，我國和印度的黑熱病病人約占世界利什曼病的30%。隨著石油、農業和旅游開發，進出疫區的人員日趨增加，增加了黑熱病向外擴散傳播的機會。由 于治療不徹底或治療方案不合理，抗藥性利什曼原蟲的分布范圍有擴大趨勢。培養分離利什曼原蟲不僅是判斷黑熱病的重要標準之一，而且是深入開展防治研究工作的基礎。3N培養基培養分離利什曼原蟲是世界衛生組織(WHO)和我國衛生部黑熱病診斷標準推薦的培養基和培養分離技術。3N培養基為雙相培養基，下層為固體瓊脂凝膠，結冰融化后就不能使用，只能在0°C以上保存，有效期為30天。使用3N培養基培養分離利什曼原蟲，在亞洲黑熱病疫區，黑熱病患者的利什曼原蟲的檢出率不到20% ;在荒漠型黑熱病疫區，黑熱病患者的利什曼原蟲檢出率不到1%，出結果時間長達15天。
發明內容
本發明提供了一種利什曼原蟲液體培養基及其制備方法，克服了上述現有技術之不足，其能有效解決使用3N培養基培養分離利什曼原蟲的檢出率低、檢測出結果時間長和有效期短的問題。本發明的技術方案之一是通過以下措施來實現的一種利什曼原蟲液體培養基，該利什曼原蟲液體培養基含有 NaCl 8. 5g、KCl 0. 4g、NaHCO3 I. 6g、KH2PO3 0. 2g、CaCl2
0.2g、葡萄糖 5. 0g、L-谷氨酰胺 0. lg、Hepes 4. 5g、RPMI-1640 10. 4g、小牛血清 200 ml、去離子水1700ml、青霉素100萬單位、鏈霉素100萬單位、兔溶血液100 ml ;該利什曼原蟲液體培養基按下述步驟得到第一步，依次將上述所需要量的NaCl、KCl,NaHC03> KH2PO3^CaCl2、葡萄糖和L-谷氨酰胺溶解混勻于上述所需要量的去離子水中，用0. IMol/L的NaOH溶液調節pH至7. 2，加入上述所需要量的H印es、RPMI-1640和小牛血清混勻；第二步，將充氣管插入到液體下部，用充氣管充注CO2氣體到液體中，直至液體顏色由淡紅色變為亮黃色,此時CO2氣體在液體中達到飽和；第三步,加入上述所需要量的兔溶血液、青霉素和鏈霉素充分混勻；第四步，將充分混勻后的液體放在除菌過濾器中用壓力為0. 4公斤/cm2的CO2氣體壓濾除菌后得到利什曼原蟲液體培養基，然后將利什曼原蟲液體培養基分裝到滅菌塑料瓶或玻璃瓶中，密閉，_20°C保存。下面是對上述發明技術方案之一的進一步優化或/和改進上述兔溶血液按下述步驟得到第一步，選I. 3Kg至I. 5Kg的雌兔，無菌采血，玻珠法脫纖維，按脫纖維之后血量體積的2倍加去離子水，在溫度為_5°C至5°C之間反復凍溶至血紅細胞破裂，然后在離心機中4000g離心20分鐘，棄沉淀，上清液即為兔溶血液。本發明的技術方案之二是通過以下措施來實現的一種利什曼原蟲液體培養基的制備方法按下述步驟進行該利什曼原蟲液體培養基含有NaCl 8. 5g、KCl 0. 4g、NaHCO3I. 6g、KH2PO3 0. 2g、CaCl2 0. 2g、葡萄糖 5. 0g、L-谷氨酰胺 0. lg、Hepes 4. 5g、RPMI-1640
10.4g、小牛血清200 ml、去離子水1700ml、青霉素100萬單位、鏈霉素100萬單位、兔溶血液100 ml ;該利什曼原蟲液體培養基按下述步驟進行第一步，依次將上述所需要量的NaCl、KC1、NaHC03、KH2P03、CaCl2、葡萄糖和L-谷氨酰胺溶解混勻于上述所需要量的去離子水中，用0. IMol/L的NaOH溶液調節pH至7. 2，加入上述所需要量的H印es、RPMI_1640和小牛血清混勻；第二步，將充氣管插入到液體下部，用充氣管充注CO2氣體到液體中，直至液體顏色由淡紅色變為亮黃色，此時CO2氣體在液體中達到飽和；第三步，加入上述所需要量的兔溶血液、青霉素和鏈霉素充分混勻；第四步，將充分混勻后的液體放在除菌過濾器中用壓力為
0.4公斤/cm2的CO2氣體壓濾除菌后得到利什曼原蟲液體培養基，然后將利什曼原蟲液體培養基分裝到滅菌塑料瓶或玻璃瓶中密閉保存。下面是對上述發明技術方案之二的進一步優化或/和改進
上述兔溶血液按下述步驟得到第一步，選I. 3Kg至I. 5Kg的雌兔，無菌采血，玻珠法脫纖維，按脫纖維之后血量體積的2倍加去離子水，在溫度為_5°C至5°C之間反復凍溶至血紅細胞破裂，然后在離心機中4000g離心20分鐘，棄沉淀，上清液即為兔溶血液。本發明通過利什曼原蟲液體培養基培養疑似黑熱病病人的骨髓和腫大的動物脾臟，培養并分離利什曼原蟲，培養出利什曼原蟲的確定為黑熱病，具有出結果快、保存方便和有效期長的特點，提高了利什曼原蟲的分離率，為黑熱病臨床診斷、流行病調查和利什曼原蟲抗藥性研究提供依據。
具體實施例方式本發明不受下述實施例的限制，可根據本發明的技術方案與實際情況來確定具體的實施方式。實施例I :該利什曼原蟲液體培養基含有NaCl 8.5g、KCl 0. 4g、NaHCO3 I. 6g、KH2PO3 0.2g、CaCl2 0. 2g、葡萄糖 5. 0g、L-谷氨酰胺 0. lg, Hepes 4. 5g, RPMI-1640 10. 4g、小牛血清200 ml、去離子水1700ml、青霉素100萬單位、鏈霉素100萬單位、兔溶血液100ml ;該利什曼原蟲液體培養基按下述步驟得到第一步，依次將上述所需要量的NaCl、KC1、NaHC03、KH2P03、CaCl2、葡萄糖和L-谷氨酰胺溶解混勻于上述所需要量的去離子水中，用
0.IMol/L的NaOH溶液調節pH至7. 2，加入上述所需要量的H印es、RPMI-1640和小牛血清混勻；第二步，將充氣管插入到液體下部，用充氣管充注CO2氣體到液體中，直至液體顏色由淡紅色變為亮黃色，此時CO2氣體在液體中達到飽和；第三步，加入上述所需要量的兔溶血液、青霉素和鏈霉素充分混勻；第四步，將充分混勻后的液體放在除菌過濾器中用壓力為
0.4公斤/cm2的CO2氣體壓濾除菌后得到利什曼原蟲液體培養基，然后將利什曼原蟲液體培養基分裝到滅菌塑料瓶或玻璃瓶中密閉保存。利什曼原蟲液體培養基在溫度為_20°C下可保存I. 5年、溫度為4°C下可保存3個月、溫度為25°C下可保存30天。
實施例2 :與實施例I的不同之處實施例2的兔溶血液按下述步驟得到第一步，選I. 3Kg至I. 5Kg的雌兔，無菌采血，玻珠法脫纖維，按脫纖維之后血量體積的2倍加去離子水，在溫度為_5°C至5°C之間反復凍溶至血紅細胞破裂，然后在離心機中4000g離心20分鐘，棄沉淀，上清液即為兔溶血液。上述實施例所得利什曼原蟲液體培養基按下述步驟進行應用
在以下實際應用中，嚴格按生物安全操作規定實施。一培養分離利什曼原蟲的設備和材料準備
I.設備和器材生物安全柜，倒置顯微鏡，細胞培養瓶，毛細玻管，rk39ELISA試劑盒，rk39dipstick，一次性注射器，0. 9%生理鹽水，眼科剪刀，5ml細胞培養瓶。2.利什曼原蟲液體培養基將上述實施例所得利什曼原蟲液體培養基調節為pH
7.2利什曼原蟲液體培養基用于培養利什曼原蟲前鞭毛體；將上述實施例所得利什曼原蟲液體培養基調節為PH 6. 4利什曼原蟲液體培養基用于培養利什曼原蟲利杜體。臨用前，將低溫保存的上述調節好的利什曼原蟲液體培養基融化并搖勻，無菌操作分裝于5ml細胞培養瓶，每瓶4ml。4°C可保存30天。二培養分離利什曼原蟲標本采集
I.采集疑似黑熱病病人骨髓
采取有疑似黑熱病臨床癥狀的病人血清，按rk39dipstick或rk39ELISA使用說明書檢測血清rk39抗體，黑熱病抗體陽性的患者，在治療用藥前采取骨髓。2.采集動物骨髓、脾臟標本
用rk39dipstick或rk39ELISA檢測動物血清rk39抗體陽性的動物,體型較大的如家犬等，采取骨髓；小型嚙齒類動物，亦可采取股骨骨髓或脾臟標本，取骨髓或脾臟0. Ig,在凹孔載玻片上研碎，加0. 2ml上述實施例所得利什曼原蟲液體培養基，研磨成混懸液。3.采集白蛉標本
鎢絲燈誘捕白蛉，鑒定分類后，解剖取胃內容物，加0. Iml上述實施例所得利什曼原蟲液體培養基，研磨成混懸液。三培養和觀察方法
將疑似黑熱病病人骨髓、動物脾臟、白蛉胃內容物混懸液0. 01ml，分別加到裝有上述調節好的pH7. 2利什曼原蟲液體培養基的毛細玻管或培養瓶中，封口后25°C培養。從接種后第2天開始，每天用倒置顯微鏡200倍鏡下觀察，發現有鞭毛體游動，便可以確定有前鞭毛體生長；連續觀察到第15天，仍未觀察到前鞭毛體，按利什曼原蟲培養陰性處理。上述調節好的pH6. 4利什曼原蟲液體培養基用于培養利杜體，把有前鞭毛體生長的培養液接種到上述調節好的PTO. 4利什曼原蟲液體培養基中，3天后取培養液涂片，瑞氏染色或姬姆薩氏染色，油鏡觀察生長情況。四利什曼原蟲擴大培養和保種
觀測到有前鞭毛體生長的第8天，取部分有前鞭毛體的培養液，用2倍量上述調節好的利什曼原蟲液體培養基稀釋，擴大培養。已成功純化培養的利什曼原蟲，用上述調節好的利什曼原蟲液體培養基稀釋到每毫升10萬個利什曼原蟲，18°C _22°C試管內可以保存40天，上述方法可傳代保存利什曼原蟲。
權利要求
1.一種利什曼原蟲液體培養基，其特征在于該利什曼原蟲液體培養基含有NaCl8.5g、KCl 0. 4g、NaHCO3 I. 6g、KH2PO3 0. 2g、CaCl2 0. 2g、葡萄糖 5. 0g、L-谷氨酰胺 0. lg、Hepes 4. 5g、RPMI-1640 10. 4g、小牛血清200 ml、去離子水1700ml、青霉素100萬單位、鏈霉素100萬單位、兔溶血液100 ml ;該利什曼原蟲液體培養基按下述步驟得到第一步,依次將上述所需要量的NaCl、KCl、NaHC03、KH2P03、CaCl2、葡萄糖和L-谷氨酰胺溶解混勻于上述所需要量的去離子水中，用0. IMol/L的NaOH溶液調節pH至7. 2，加入上述所需要量的Hepes, RPMI-1640和小牛血清混勻；第二步，將充氣管插入到液體下部，用充氣管充注CO2氣體到液體中，直至液體顏色由淡紅色變為亮黃色，此時CO2氣體在液體中達到飽和；第三步，加入上述所需要量的兔溶血液、青霉素和鏈霉素充分混勻；第四步，將充分混勻后的液體放在除菌過濾器中用壓力為0. 4公斤/cm2的CO2氣體壓濾除菌后得到利什曼原蟲液體培養基，然后將利什曼原蟲液體培養基分裝到滅菌塑料瓶或玻璃瓶中，密閉，-20°C保存。
2.根據權利要求I所述的利什曼原蟲液體培養基，其特征在于所述兔溶血液按下述步驟得到第一步，選I. 3Kg至I. 5Kg的雌兔，無菌采血，玻珠法脫纖維，按脫纖維之后血量體積的2倍加去離子水，在溫度為-5°C至5°C之間反復凍溶至血紅細胞破裂，然后在離心機中4000g離心20分鐘，棄沉淀，上清液即為兔溶血液。
3.—種利什曼原蟲液體培養基的制備方法，其特征在于按下述步驟進行該利什曼原蟲液體培養基含有 NaCl 8. 5g、KCl 0. 4g、NaHCO3 I. 6g、KH2PO3 0. 2g、CaCl2 0. 2g、葡萄糖 5. 0g、L-谷氨酰胺 0. lg、Hepes 4. 5g、RPMI-1640 10. 4g、小牛血清 200 ml、去離子水1700ml、青霉素100萬單位、鏈霉素100萬單位、兔溶血液100 ml ;該利什曼原蟲液體培養基按下述步驟進行第一步，依次將上述所需要量的NaCl、KC1、NaHC03、KH2P03、CaCl2、葡萄糖和L-谷氨酰胺溶解混勻于上述所需要量的去離子水中，用0. IMol/L的NaOH溶液調節pH至7. 2，加入上述所需要量的H印es、RPMI-1640和小牛血清混勻；第二步，將充氣管插入到液體下部，用充氣管充注CO2氣體到液體中，直至液體顏色由淡紅色變為亮黃色，此時CO2氣體在液體中達到飽和；第三步，加入上述所需要量的兔溶血液、青霉素和鏈霉素充分混勻；第四步，將充分混勻后的液體放在除菌過濾器中用壓力為0. 4公斤/cm2的CO2氣體壓濾除菌后得到利什曼原蟲液體培養基，然后將利什曼原蟲液體培養基分裝到滅菌塑料瓶或玻璃瓶中，密閉，_20°C保存。
4.根據權利要求3所述的利什曼原蟲液體培養基的制備方法，其特征在于所述兔溶血液按下述步驟得到第一步，選I. 3Kg至I. 5Kg的雌兔，無菌采血，玻珠法脫纖維，按脫纖維之后血量體積的2倍加去離子水，在溫度為-5°C至5°C之間反復凍溶至血紅細胞破裂，然后在離心機中4000g離心20分鐘，棄沉淀，上清液即為兔溶血液。
全文摘要
本發明涉及黑熱病疫情監測和黑熱病診斷的液體培養基技術領域，是一種利什曼原蟲液體培養基及其制備方法;本發明通過利什曼原蟲液體培養基培養疑似黑熱病病人的骨髓和腫大的動物脾臟，培養并分離利什曼原蟲，與傳統3N培養基比較，培養和分離荒漠型黑熱病利什曼原蟲的分離率，由不到1%提高到10%以上；出結果快，培養觀察出結果時間由15天縮短到5天；保存方便，有效期由30天延長到2年。為黑熱病臨床診斷、流行病調查和利什曼原蟲抗藥性研究提供依據。
文檔編號C12N1/10GK102746989SQ20121025094
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月19日 優先權日2012年7月19日
發明者廖力夫, 徐兵, 徐藝玫, 燕順生 申請人:新疆維吾爾自治區實驗動物研究中心