專利名稱：一種檢測水體中弧菌的多重熒光pcr試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發明涉及弧菌的檢測，具體涉及一種檢測水體中弧菌的多重熒光PCR試劑盒及檢測方法。
背景技術：
目前致病性弧菌傳統的檢測方法還是通過微生物培養進行分離鑒定，尚不夠完善，其需經過多個篩選步驟，需要多種培養基，耗時較長；另有利用弧菌的單克隆抗體檢測的方法，該方法要求挑取單一的菌落大量增菌后利用免疫學方法鑒定，特異性較高，但兩種方法檢測所需時間均較長。在分子生物學檢測方 面，FDA標準仍是以檢測一種致病性弧菌為目的設計PCR程序。國內的檢測試劑設計PCR檢測方法時也只是能夠同時檢測3種弧菌，而且關注的都是01型和0139型霍亂弧菌與副溶血弧菌，檢測樣品也主要是針對食品當中的弧菌的檢測。但是除了常見的霍亂弧菌和副溶血弧菌外，許多國家已開始關注其他致病性弧菌以及弧菌在環境水體中的存在。例如，有害的水生生物和病原體通過船舶壓艙水進入新環境已被世界環保基金(GEF)確定為全球海洋面臨的重大威脅之一。《國際衛生條例(2005)》將國際航行船舶壓艙水作為口岸的重要監管對象，作為檢驗檢疫部門承擔著對壓艙水攜帶病原生物的監管職責，其中壓艙水中就包括霍亂弧菌、副溶血弧菌及其它致病性弧菌的存在。四重熒光PCR技術原理是基于單色熒光PCR技術，是指在同一個熒光PCR擴增試驗中同時擴增四個目的基因，探針為多種熒光標記比如FAM、VIC、JOE、NED、HEX等，每種熒光標記的探針在PCR擴增過程中所產生的熒光信號不同。由于該方法引入了特異性擴增引物和熒光探針，使得檢測的靈敏度和特異性得到很大程度的增強，從而避免了其他檢測方法特異性不高且容易漏檢的問題。由于在水體中存有多種弧菌，因此，有必要研究一種方法，可有效富集水體中的細菌數量并可同時檢測多個致病性弧菌。這樣，可以在加快檢測速度的同時大幅提高檢出率，減少工作量和檢測成本，以適應衛生檢驗的新的形式需求，與國際方法接軌。
發明內容
本發明提供了一種水體中致病性弧菌的四重熒光PCR檢測試劑盒及檢測方法，具有有效富集水體中的細菌數量，無需前增菌過程，并可同時檢測創傷弧菌、溶藻弧菌、擬態弧菌及河弧菌等4種致病性弧菌的優點，可以在加快檢測速度的同時大幅提高檢出率，減少工作量和檢測成本。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為一種檢測水體中弧菌的多重熒光PCR試劑盒，該試劑盒是在創傷弧菌、溶藻弧菌、擬態弧菌及河弧菌核酸序列分析的基礎上，選取保守基因序列設計出一對特異性引物，利用PCR技術結合細菌富集方法對創傷弧菌、溶藻弧菌、擬態弧菌及河弧菌進行快速檢測；此技術無需前增菌步驟，大大縮短了操作時間，同時減少了污染，具有潛在的應用價值。具體的說，該試劑盒包括濃度為5U/ul的TaqDNA聚合酶、多重熒光PCR反應母液、細菌富集試劑、DNA提取試劑。其中多重熒光PCR反應母液含有多重IOX熒光PCR反應緩沖液、創傷弧菌引物、創傷弧菌探針、溶藻弧菌引物、溶操弧菌探針、擬態弧菌引物、擬態弧菌探針、河弧菌引物、河弧菌探針、牛血清白蛋白；多重IOX熒光PCR反應緩沖液含有三羥甲基氨基甲烷鹽酸、氯化鉀、甘油、四種單核苷酸單體、氯化鎂；細菌富集試劑含有PEG8000、氯化鈉；DNA提取試劑含有三羥甲基氨基甲烷鹽酸、氯化鉀、乙二胺四乙酸、NP40。具體細菌富集試劑配制PEG8000和氯化鈉溶于純水配成PEG8000質量百分濃度為20%、氯化鈉終濃度為200mM的細菌富集試劑，冰箱4 oC保存。DNA提取試劑含有終濃度20mM的三羥甲基氨基甲烷鹽酸、終濃度的IOOmM氯化鉀、終濃度2. 5mM的乙二胺四乙酸、質量百分終濃度1%的NP40，余量為超純水，冰箱4 oC保存。多重10XPCR反應緩沖液含有終濃度IOOmM的三羥甲基氨基甲烷鹽酸，終濃度500mM的氯化鉀，質量百分終濃度50%的甘油，終濃度各為O. 2mM的dATP、dGTP、dTTP和dGTP (四種單核苷酸單體)，終濃度2mM的氯化鎂，余量為超純水；多重熒光PCR反應母液按下述體積比配制多重10XPCR反應緩沖液 2. 5ul，濃度 20mg/ml 牛血清白蛋白 O. 5ul，引物 VV Pf、VVPr、VAPf、VAPr、VMPf、VMPr 各
O.2ul，引物 VFPf、VFPr 各 O. 3ul，探針 VVPb、VAPb、VMPb、VFPb 各 O. 4ul，無 RNA 酶 DEPC 水18. 3ul，配制混合后于冰箱-20°C保存。還可以有陽性對照品和陰性對照品，陽性對照品為連接有創傷弧菌、溶藻弧菌、擬態弧菌及河弧菌引物的基因保守序列的PUCm-T克隆載體；陰性對照品為無DNA酶的DEPC水。上述引物和探針是依據創傷弧菌WhA基因保守序列設計引物、探針
VVPf: GTTAACGGCTGGAGCTGTC，
VVPr: ACGGTCAAACAACGATCGGA,
VVPb: ROX-CGGCAAACTTGGTTCCAACTGCCG-DABCYL,
依據溶藻弧菌collagenase基因保守序列設計引物、探針
VAPf: GTGGAACGAGCAATTTGTGC,
VAPr: CCCGACCATACATTTCATACTGT,
VAPb: HEX-CCGGGACAACAGAACTCGCGTTACCCGG-DABCYL,
依據擬態弧菌toxR基因保守序列設計引物、探針
VMPf: AGGAAACTGGAATCGATTTTTCC,
VMPr: GCTAACGGAATCAACATCGC,
VMPb: FAM-CGGGGATCAACAAAATCAGCCGAGTCCCCG-DABCYL ；
依據河弧菌toxR基因保守序列設計引物、探針
VFPf: GCCGTATCCTCTTCAGAACTT,
VFPr: GACGGCAACCAACAGAATCAA,
VFPb: CY5-CGGCGCAGTTATTACTCAGACGTCGCCG-DABCYL。利用該試劑盒檢測水體中弧菌的方法，由下述步驟組成
a、細菌富集在無菌條件下，取待檢水樣與上述細菌富集試劑按100 1的比例充分混合，繼而13000rpm離心20分鐘，然后棄去上清，并加入O. 5ml的質量百分濃度O. 5%的無菌生理鹽水將沉淀物充分打散得到細菌富集液；b、核酸DNA提取取50ul細菌富集液及50ul DNA提取試劑于I. 5ml離心管中，振蕩混勻后，96-100°C水浴lOmin，13000rpm離心5min，取上清液作為DNA模板，-20°C環境下儲存備用；
c、25ul反應體系配制取2ulDNA模板或陽性對照或陰性對照至PCR管中，加入22.6ul多重熒光PCR反應母液和O. 4ul Taq DNA聚合酶(5U/ul)，進行多重熒光PCR擴增；
d、多重熒光PCR反應在四色熒光定量PCR儀上進行，探針檢測模式設置為ROX、HEX、FAM及CY5通道，分別用于檢測創傷弧菌、溶藻弧菌、擬態弧菌及河弧菌；反應條件940C預變性3min;94°C變性15s，55°C退火40s，72°C延伸15s，40次循環。設置完成后，保存文件，運行程序；
e、檢測結果判斷出現S形擴增曲線，Ct值小于37為陽性，沒有出現S形擴增曲線，或者有擴增曲線但不呈S形、閾值超過40為陰性，出現S形擴增曲線，但Ct值大于37，小于40為可疑，對可疑結果，應重復實驗，如果重復實驗仍出現S形擴增曲線 ，陰性對照沒有污染，可判斷為陽性。本發明采用了創新的細菌富集試劑技術、DNA提取試劑技術、特異性熒光探針雜交PCR檢測技術以及多重PCR技術，樣本無需增菌培養，在保持高敏感性的前提下盡量減少假陽性干擾，且一次能檢測4種弧菌。本發明的有益效果主要體現在無需樣本前增菌，細菌的檢測敏感性高、特異性好，降低了常規PCR擴增的假陽性率；可實現同時對創傷弧菌、溶藻弧菌、擬態弧菌及河弧菌的快速、準確、特異檢測。
具體實施例方式以下結合實施例對本發明作進一步詳細描述。實施例I
一種檢測水體中致病性弧菌的多重熒光PCR試劑盒，該試劑盒由多重熒光PCR反應母液、細菌富集試劑(含有質量百分終濃度20%的PEG8000、終濃度200mM的氯化鈉)、DNA提取試劑(內含終濃度20mM的三羥甲基氨基甲烷鹽酸、終濃度的IOOmM氯化鉀、終濃度2. 5mM的乙二胺四乙酸、質量百分終濃度1%的NP40)、濃度為5U/ul的Taq DNA聚合酶組成，其中多重熒光PCR反應母液按下述體積比配制多重IOX熒光PCR反應緩沖液(內含終濃度IOOmM的三羥甲基氨基甲烷鹽酸，終濃度500mM的氯化鉀，質量百分終濃度50%的甘油，終濃度各為O. 2mM的dATP、dGTP、dTTP和dGTP，終濃度2mM的氯化鎂)2. 5ul，濃度20mg/ml牛血清白蛋白 O. 5ul，引物 VVPf、VVPr, VAPf、VAPr、VMPf、VMPr 各 O. 2ul，引物 VFPf、VFPr 各 O. 3ul,探針VVPb、VAPb、VMPb、VFPb各O. 4ul，無RNA酶DEPC水18. 3ul。還可以有陽性對照品連接有創傷弧菌、溶藻弧菌、擬態弧菌及河弧菌引物的基因保守序列的PUCm-T克隆載體；陰性對照品無DNA酶的DEPC水。上述引物及探針針對溶藻弧菌、擬態弧菌、河弧菌、創傷弧菌核酸序列進行生物信息學分析，應用Clustalw等軟件分析序列的同源性，設計并篩選本發明的各引物和探針序列，由上海英駿公司合成。實施例2
I、選取如下病原微生物，實驗組溶藻弧菌、擬態弧菌、河弧菌、創傷弧菌；對照組01群霍亂弧菌、0139群霍亂弧菌、副溶血弧菌、志賀氏菌和沙門氏菌，上述病原菌株均自環境樣本分離培養保存溶藻弧菌、擬態弧菌、河弧菌、創傷弧菌、Ol群霍亂弧菌、0139群霍亂弧菌、副溶血弧菌、志賀氏菌及沙門氏菌由本研究院周冬根等同志，在2011年3月左右于寧波市內各水體中采集、分離培養，聯系電話為0574-87169626。2、模擬環境樣本制備分別將O. 5ml的濃度均為I X 105CFU/ml的溶藻弧菌、擬態弧菌、河弧菌、創傷弧菌、01群霍亂弧菌、0139群霍亂弧菌、副溶血弧菌、志賀氏菌及沙門氏菌與500ml的飲用水充分混合，制成濃度均為103CFU/ml的模擬環境樣本。3、細菌富集在無菌條件下，取5份采集自船舶壓艙水的待檢水樣50ml與O. 5ml細菌富集試劑充分混合，繼而13000rpm離心20分鐘，然后棄去上清，并加入O. 5ml的O. 5%的無菌生理鹽水將沉淀物充分打散；
4、核酸DNA提取取50ul各模擬環 境樣本和各份細菌富集液分別與50ulDNA提取試劑加入I. 5ml離心管中，振蕩混勻后，96-100°C水浴lOmin, 13000rpm離心5min,取上清液作為DNA模板，_20°C環境下儲存備用；
5、25ul反應體系配制取2ulDNA模板或陽性對照或陰性對照至PCR管中，加入22.6ul多重熒光PCR反應母液和O. 4ul Taq DNA聚合酶(5U/ul)，進行多重熒光PCR擴增；
6、多重熒光PCR反應在四色熒光定量PCR儀(市售)上進行，探針檢測模式設置為Reporter Dye: ROX、HEX、FAM及CY5通道，分別用于檢測創傷弧菌、溶藻弧菌、擬態弧菌及河弧菌；反應條件94°C預變性3min;94°C變性15s，55°C退火40s (檢測熒光)，72°C延伸15s，40次循環。設置完成后，保存文件，運行程序；
7、檢測結果判斷方法出現S形擴增曲線，Ct值小于37為陽性，沒有出現S形擴增曲線，或者有擴增曲線但不呈S形、閾值超過40為陰性，出現S形擴增曲線，但Ct值大于37，小于40為可疑，對可疑結果，應重復實驗，如果重復實驗仍出現S形擴增曲線，陰性對照沒有污染，可判斷為陽性，結果實驗組溶藻弧菌、擬態弧菌、河弧菌及創傷弧菌檢測均為陽性，而對照組中的01群霍亂弧菌、0139群霍亂弧菌、副溶血弧菌、志賀氏菌及沙門氏菌均為陰性，特異性高，用陽性對照品倍比稀釋后檢測靈敏度達到lOOOcopies/ml。待檢水樣結果4份樣本檢測結果為HEX通道呈S形擴增曲線，Ct值在19-23之間，為溶藻弧菌感染；1份樣本檢測結果為ROX通道呈S形擴增曲線，Ct值為37. 4，重復檢測仍出現S形擴增曲線，陰性對照沒有污染，為陽性創傷弧菌感染。實施例3
3份待檢飲用水水樣與實施例2中步驟3、4、5、6、7相同方式檢測，結果I份待檢飲用水水樣CY5通道呈S形擴增曲線，Ct值在32，有河弧菌感染。
權利要求
1.一種檢測水體中弧菌的多重熒光PCR試劑盒，包括濃度為5U/ul的Taq DNA聚合酶、多重熒光PCR反應母液和DNA提取試劑，其特征在于還包括細菌富集試劑，所述細菌富集試劑含有質量百分終濃度20%的PEG8000和終濃度200mM的氯化鈉，所述DNA提取試劑含有終濃度20mM的三羥甲基氨基甲烷鹽酸、終濃度的IOOmM氯化鉀、終濃度2. 5mM的こニ胺四こ酸、質量百分終濃度1%的NP40，所述多重熒光PCR反應母液按體積比多重10XPCR反應緩沖液2. 5ul，濃度20mg/ml牛血清白蛋白O. 5ul，引物VVPf、VVPr、VAPf、VAPr、VMPf、VMPr 各 O. 2ul，引物 VFPf、VFPr 各 O. 3ul,探針 VVPb、VAPb, VMPb, VFPb 各 O. 4ul,無 RNA酶DEPC水18. 3ul組成，所述多重10XPCR反應緩沖液含有終濃度IOOmM的三羥甲基氨基甲烷鹽酸，終濃度500mM的氯化鉀，質量百分終濃度50%的甘油，終濃度各為O. 2mM的dATP、dGTP、dTTP和dGTP，終濃度2mM的氯化鎂，引物VVPf的核苷酸序列為GTTAACGGCTGGAGCTGTC,引物VVPr的核苷酸序列為ACGGTCAAAC AACGATCGGA,探針VVPb的核苷酸序列為 ROX-CGGCAAACTT GGTTCCAACT GCCG-DABCYL,引物 VAPf 的核苷酸序列為 GTGGAACGAGCAATTTGTGC,引物 VAPr 的核苷酸序列為 CCCGACCATA CATTTCATAC TGT，探針 VAPb 的核苷酸序列為 HEX-CCGGGACAAC AGAACTCGCG TTACCCGG-DABCYL,弓丨物 VMPf 的核苷酸序列為AGGAAACTGG AATCGATTTT TCC，引物 VMPr 的核苷酸序列為 GCTAACGGAA TCAACATCGC，探針VMPb 的核苷酸序列為 FAM-CGGGGATCAA CAAAATCAGC CGAGTCCCCG-DABCYL，引物 VFPf 的核苷酸序列為 GCCGTATCCT CTTCAGAACT T，引物 VFPr 的核苷酸序列為 GACGGCAACC AACAGAATCAA，探針 VFPb 的核苷酸序列為 CY5-CGGCGCAGTT ATTACTCAGA CGTCGCCG-DABCYL。
2.權利要求I所述的ー種檢測水體中弧菌的多重熒光PCR試劑盒檢測水體中弧菌的方法，其特征在于步驟如下 a、細菌富集在無菌條件下，取待檢水樣與所述細菌富集試劑按100 1的比例充分混合，13000rpm離心20分鐘，然后棄去上清，加入O. 5ml的質量百分濃度O. 5%的無菌生理鹽水將沉淀物充分打散得到細菌富集液； b、核酸DNA提取取50ul細菌富集液及50ul所述DNA提取試劑于I. 5ml離心管中，振蕩混勻后，96-100°C水浴lOmin，13000rpm離心5min，取上清液作為DNA模板，-20°C環境下儲存備用； c、25ul反應體系配制取2ul所述DNA模板至PCR管中，加入22.6ul多重熒光PCR反應母液和O. 4ul濃度5U/ul的Taq DNA聚合酶，進行多重熒光PCR擴增； d、多重熒光PCR反應在四色熒光定量PCR儀上進行，探針檢測模式設置為ROX、HEX、FAM及CY5通道，分別用于檢測創傷弧菌、溶藻弧菌、擬態弧菌及河弧菌；反應條件940C預變性3min;94°C變性15s，55°C退火40s，72°C延伸15s，40次循環，設置完成后，保存文件，運行程序； e、檢測結果判斷通道中出現S形擴增曲線，Ct值小于37為對應弧菌陽性，沒有出現S形擴增曲線，或者有擴增曲線但不呈S形、閾值超過40為陰性，出現S形擴增曲線，但Ct值大于37，小于40為對應弧菌可疑，對可疑結果，應重復實驗，如果重復實驗仍出現S形擴增曲線，陰性對照沒有污染，可判斷為對應弧菌陽性。
全文摘要
本發明公開了一種水體中致病性弧菌的四重熒光PCR檢測試劑盒及檢測方法，采用了創新的細菌富集試劑技術、DNA提取試劑技術、特異性熒光探針雜交PCR檢測技術以及多重PCR技術，樣本無需增菌培養，在保持高敏感性的前提下盡量減少假陽性干擾，且一次能檢測4種弧菌。本發明的有益效果主要體現在無需樣本前增菌，細菌的檢測敏感性高、特異性好，降低了常規PCR擴增的假陽性率；可實現同時對創傷弧菌、溶藻弧菌、擬態弧菌及河弧菌的快速、準確、特異檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102816840SQ20121024989
公開日2012年12月12日 申請日期2012年7月19日 優先權日2012年7月19日
發明者孫大為, 周冬根, 李紅, 龍再浩, 倪敏君, 張升, 楊天賜 申請人:寧波檢驗檢疫科學技術研究院