專利名稱：TrMAK蛋白在調(diào)節(jié)纖維素酶產(chǎn)量中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種TrMAK蛋白在調(diào)節(jié)纖維素酶產(chǎn)量中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著全球能源和環(huán)境危機(jī)的日益惡化，尋找新的可再生能源已成為當(dāng)前社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)問題，纖維素生物質(zhì)作為植物吸收太陽能并通過光合作用形成的產(chǎn)物，是地球上最為豐富的、最可行的可再生新能源物質(zhì)。但如何將生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成現(xiàn)代工業(yè)可利用的能源物質(zhì)卻存在諸多問題，其中最關(guān)鍵問題就是實(shí)現(xiàn)天然生物質(zhì)的高效降解。纖維素酶是自然界中存在最廣泛、最有效的生物質(zhì)降解酶，在木質(zhì)纖維素資源轉(zhuǎn)化過程起著關(guān)鍵性作用，其產(chǎn)量、活性的高低直接關(guān)系著新的生物質(zhì)能源的開發(fā)、利用。
絲狀真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)是主要的纖維素酶生產(chǎn)菌株,全球大約90%以上纖維素酶產(chǎn)品是通過木霉發(fā)酵生成的。五十年來，人們通過優(yōu)化培養(yǎng)條件、基因突變和菌株誘變等方法使里氏木霉生產(chǎn)纖維素酶的能力獲得大幅提高。但是，生產(chǎn)纖維素酶成本高、產(chǎn)量低仍是制約生物質(zhì)能源不能規(guī)模化的瓶頸。通過傳統(tǒng)方法進(jìn)一步提高纖維素酶產(chǎn)量已經(jīng)非常困難。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種TrMAK蛋白在調(diào)節(jié)纖維素酶產(chǎn)量中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種構(gòu)建工程菌的方法，包括如下步驟抑制木霉中TrMAK基因的表達(dá)，得到工程菌；所述TrMAK基因編碼如下(a)或(b)所述的TrMAK蛋白(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與木霉中的纖維素酶合成相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。所述TrMAK基因?yàn)槿缦翴)至4)中任一所述的DNA分子I)序列表的序列2所示的DNA分子；2)序列表的序列3所示的DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；4)與I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。所述嚴(yán)格條件為在O. I XSSPE (或O. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。所述“抑制木霉中TrMAK基因的表達(dá)”的實(shí)現(xiàn)方法如下通過同源重組敲除木霉中的所述TrMAK基因。所述“通過同源重組敲除木霉中的所述TrMAK基因”的實(shí)現(xiàn)方法如下將含有DNA片段甲的重組質(zhì)粒導(dǎo)入所述木霉中；所述DNA片段甲自上游至下游依次包括所述TrMAK基因的上游同源臂和所述TrMAK基因的下游同源臂。所述DNA片段甲中，在所述上游同源臂和所述下游同源臂之間還具有篩選標(biāo)記基因。所述篩選標(biāo)記基因具體可為pyr4基因；所述pyr4基因?yàn)榫幋a序列表的序列5所示的pyr4蛋白的基因。所述pyr4基因具體可如序列表的序列4自5’末端第1380至2525位核苷酸所示。所述DNA片段甲具體可依次包括所述上游同源臂、所述pyr4基因的表達(dá)盒和所述下游同源臂。所述上游同源臂具體可如序列表的序列4自5’末端第7至1006位核苷酸所示。所述下游同源臂具體可如序列表的序列4自5’末端第2937至3936位核苷酸所示。所述pyr4基因的表達(dá)盒具體可如序列表的序列4自5’末端第1013至2930位核苷酸所示。所述DNA片段甲具體可為序列表的序列4自5’末端第7至3936位核苷酸所示的雙鏈DNA分子。
所述含有DNA片段甲的重組質(zhì)粒具體可為將所述DNA片段甲導(dǎo)入質(zhì)粒pBluescript SK(+)的多克隆位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒。所述木霉可為里氏木霉，具體可為TU6 Δ tku70菌株、TU6菌株或QM9414菌株。以上任一所述方法得到的工程菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明還保護(hù)一種生產(chǎn)纖維素酶的方法，包括如下步驟發(fā)酵所述工程菌，得到纖維素酶。所述發(fā)酵的具體條件為，將所述工程菌接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，28°C，200rpm震蕩培養(yǎng)48-144 小時(shí)。本發(fā)明還保護(hù)抑制所述TrMAK基因表達(dá)的物質(zhì)在促進(jìn)木霉生產(chǎn)纖維素酶中的應(yīng)用。所述抑制所述TrMAK基因表達(dá)的物質(zhì)為含有以上任一所述DNA片段甲的重組質(zhì)粒。所述抑制所述TrMAK基因表達(dá)的物質(zhì)具體可為將所述DNA片段甲導(dǎo)入質(zhì)粒pBluescript SK(+)的多克隆位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒。所述木霉可為里氏木霉，具體可為TU6 Δ tku70菌株、TU6菌株或QM9414菌株。本發(fā)明還保護(hù)所述TrMAK蛋白在調(diào)節(jié)木霉中的纖維素酶合成中的應(yīng)用。所述木霉可為里氏木霉，具體可為TU6 Δ tku70菌株、TU6菌株或QM9414菌株。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，敲除TrMAK基因后，木霉生產(chǎn)纖維素酶的能力顯著增加。本發(fā)明對(duì)于纖維素酶的生產(chǎn)具有重大價(jià)值，對(duì)于解決能源危機(jī)和環(huán)境危機(jī)具有潛在影響。
圖I為實(shí)施例I中的PCR鑒定電泳圖。圖2為實(shí)施例3中粗酶液SDS-PAGE分析電泳圖。圖3為實(shí)施例3中粗酶液的纖維素酶酶活。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。里氏木霉(Trichoderma reesei)QM9414菌株美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(簡(jiǎn)稱ATCC,網(wǎng)址 WWW. atcc. org/)，ATCC 編號(hào)為 26921。里氏木霉(Trichoderma reesei) TU6菌株是由QM9414菌株衍生的,pyr4基因功能喪失的、尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷菌株，ATCC編號(hào)為MYA-256。
微晶纖維素(AvicelKPH_101):購自fluka公司，產(chǎn)品目錄號(hào)11365。質(zhì)粒pBluescript SK(+):購自 Stratagene 公司，產(chǎn)品目錄號(hào) 212205。里氏木霉(Trichoderma reesei) TU6 Λ tku70菌株是由TU6菌株衍生的，敲除介導(dǎo)非同源重組的tku70基因得到的菌株，公眾可從中國(guó)科學(xué)院微生物研究所獲得；提及 TU6 Δ tku70 菌株(又稱 T. reesi KU70)的文獻(xiàn)Zhang Guangtao, Lukas Hartl, AndreSchuster, Stefan Polak, Monika Schmoll, Tianhong Wang, Verena Seidl, BernhardSeiboth.Gene targeting in a nonhomologous end joining deficient Hypocreajecorina. Journal of biotechnology, 2009, 139(2):146-151.。土豆培養(yǎng)基(PDA固體培養(yǎng)基):將20g去皮馬鈴薯切碎，加入90mL /K，煮沸30min，雙層紗布過濾并收集濾液，加入2g葡萄糖和I. 8g瓊脂粉，用水定容至lOOmL。MM液體培養(yǎng)基(pH 為 5.2+0. I) =(NH4)2SO4 O. 5g/100mL、KH2PO4 L 5g/100mL、 MgSO4 O. 06g/100mL、CaCl2 O. 06g/100mL、FeSO4 · 7H20 0. 0005g/100mL, MnSO4 · H2O0. 00016g/100mL、ZnSO4 · 7H20 0. 00014g/100mL、CoCl2 0. 0002g/100mL，其余為水。MM固體培養(yǎng)基在MM液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，每升添加20g瓊脂粉。LB培養(yǎng)基(自然pH値):lg/100mL蛋白胨、lg/100mL氯化鈉、O. 5g/100mL酵母提取物，其余為水。DNS試劑50g 3，5_ 二硝基水楊酸溶于4L水中，不斷攪拌，緩緩加入80g氫氧化鈉，使之完全溶解，繼續(xù)攪拌，將1500g酒石酸鉀鈉分?jǐn)?shù)次加入,并小心加熱,溶液最高溫度不超過45°C,冷卻至室溫后定容至5L,如果溶液不澄清,用Whatmanl號(hào)濾紙過濾,然后棕色瓶室溫貯藏。TrMAK蛋白(又稱trmak蛋白)如序列表的序列I所示，由763個(gè)氨基酸殘基組成，理論分子量83. 67kDa,等電點(diǎn)(PI )9. 588。TrMAK蛋白的編碼基因(又稱TrMAK基因或trmak基因)的開放閱讀框如序列表的序列2所示，其全長(zhǎng)cDNA如序列表的序列3所示。實(shí)施例I、重組菌甲的制備一、重組質(zhì)粒的構(gòu)建I、trmak基因上游同源臂(Ptrmak,約Ikb)的獲得以TU6 Δ tku70菌株的基因組DNA為模板，用upF和upR組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。upF 5，-CCCAAGCTTAAGAAGGAAAAAAACAAGACGGAAG-3，(下劃線標(biāo)注 HindIII 酶切識(shí)別序列)；upR :5’ -CGGAATTCGCTGCCGGCCGGTAGAGTTCACGAC-3> (下劃線標(biāo)注 EcoRI 酶切識(shí)別序列)。PCR擴(kuò)增采用的Taq酶為高保真fastpfu (購自全是金公司)。PCR 擴(kuò)增程序95°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 30s、60°C退火 40s、72°C延 lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°C擴(kuò)展延伸3min。2、trmak基因下游同源臂(Ttrmak ,約I kb )的獲得以TU6 Δ tku70菌株的基因組DNA為模板，用downF和downR組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。downF :5’ -CGGGATCCAGGAGAGGGAGAAGAACGACCTTAA-3，(下劃線標(biāo)注 BamHI 酶切識(shí)別序列)；downR 5，~ATAAGAATGCGGCCGCCACCACTGCACCAAACCTCCAACTC~3，(下劃線標(biāo)注 NotI酶切識(shí)別序列)。PCR擴(kuò)增采用的Taq酶為高保真fastpfu (購自全是金公司)。PCR擴(kuò)增程序同步驟I。3、pyr4基因表達(dá)盒(約2kb)的獲得以QM9414菌株的基因組DNA為模板，用Fpyr4和Rpyr4組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。Fpvr4:5，-CGGAATTCCTCACCCCCAAAGTCGCAATATCG-3，(下劃線標(biāo)注 EcoRI 酶切識(shí)別序列)； Rpyr4:5，-CGGGATCCCAACTGCATCCAAACCATCCTACC-3，(下劃線標(biāo)注 BamHI 酶切識(shí)別序列)。PCR擴(kuò)增采用的Taq酶為高保真fastpfu (購自全是金公司)。PCR擴(kuò)增程序同步驟I。4、用限制性內(nèi)切酶HindIII和EcoRI雙酶切步驟I的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。5、用限制性內(nèi)切酶BamHI和NotI雙酶切步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。6、用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI雙酶切步驟3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。7、用限制性內(nèi)切酶HindIII和NotI雙酶切質(zhì)粒pBluescript SK⑴，回收載體骨架(約 296 Ibp )。8、將步驟4的酶切產(chǎn)物、步驟6的酶切產(chǎn)物、步驟5的酶切產(chǎn)物和步驟7的酶切產(chǎn)物連接，得到重組質(zhì)粒pSK-Ptrmak-pyr4-Ttrmak (trmak基因敲除載體)。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒pSK-Ptrmak-pyr4-Ttrmak進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下在質(zhì)粒pBluescript SK (+)的HindIII和NotI酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列4自5’末端第7至3936位核苷酸所示的雙鏈DNA分子。序列表的序列4中，自5’末端第I至6位核苷酸為HindIII酶切識(shí)別序列，第7至1006位核苷酸為trmak基因上游同源臂，第1007至1012位核苷酸為EcoRI酶切識(shí)別序列，第1013至2930位核苷酸為pyr4基因表達(dá)盒(其中，第1013至1379位核苷酸為啟動(dòng)子、第1380至2525位核苷酸為pyr4基因、第2526至2930位核苷酸為終止子)，第2931至2936位核苷酸為BamHI酶切識(shí)別序列，第2937至3936位核苷酸為trmak基因下游同源臂，第3937至3944位核苷酸為NotI酶切識(shí)別序列。二、重組菌甲的獲得I、Tu6 Λ tku70菌株原生質(zhì)體制備(I)取Tu6 Λ tku70菌株的孢子，用適量無菌水洗滌孢子并制成孢子懸液，用200目篩子過濾除去殘余的菌絲，將過濾后的孢子懸液接種至裝有IOOmL麗液體培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，28°C培養(yǎng)至菌絲伸展(13h-14h)。(2)將步驟(I)得到的培養(yǎng)體系經(jīng)200目篩子過濾，收集菌體，用無菌水洗滌2-3次，然后用1.2M MgSO4水溶液洗滌一次。(3)將步驟(2)得到的菌體加入裝有15mL裂解液的三角瓶中(裂解液是含有150mg的裂解酶和15mg纖維素酶的I. 2M MgSO4水溶液)，30°C、80rpm振蕩反應(yīng)I. 5h，顯微鏡下觀察原生質(zhì)體產(chǎn)生的情況,反應(yīng)Ih后每隔IOmin取樣觀察一次。(4)步驟(3)中，當(dāng)原生質(zhì)體大量產(chǎn)生并且仍有大量菌絲存在時(shí)，加等體積O. 6M山梨醇水溶液終止反應(yīng)，經(jīng)200目篩子過濾除去殘余的菌絲，室溫3000rpm離心lOmin，收集原生質(zhì)體沉淀。(5)將步驟(4)的原生質(zhì)體沉淀用I. OM山梨醇水溶液重懸，室溫3000rpm離心IOmin,收集原生質(zhì)體沉淀。(6)將步驟(5)的原生質(zhì)體沉淀用I. OM山梨醇水溶液重懸，室溫3000rpm離心IOmin,收集原生質(zhì)體沉淀并懸浮于200 μ L I. OM山梨醇水溶液中，血球板計(jì)數(shù)器觀察并 計(jì)數(shù)(IO8個(gè)原生質(zhì)體/mL)。2、重組菌甲的獲得50%PEG4000 溶液含有 50g/100g PEG4000、50mM CaCl2 的 IOmM Tris-HCL (ρΗ8· O)緩沖液。(I)將重組質(zhì)粒pSK-Ptrmak-pyr4_Ttrmak加入步驟一制備的原生質(zhì)體中，輕輕混勻，再加入50 μ L 50%PEG4000溶液，再次混勻，冰上放置30min。(2)在步驟(I)的培養(yǎng)體系中加入lmL50%PEG4000溶液，混勻，室溫放置20min。(3)在步驟(2)的培養(yǎng)體系中加入ImL I. OM山梨醇水溶液，混勻后分四次且每次與一支4ml融化的麗固體培養(yǎng)基(58°C以下)混和，立即鋪于含I. OM山梨醇的麗固體培養(yǎng)基平板上，30°C培養(yǎng)4-7d。(4)待轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出后，將其轉(zhuǎn)移至PDA平板上，28°C培養(yǎng)3_5天(有孢子生成)，用無菌水將平板上的孢子洗下來制備成孢子懸液，做梯度稀釋后，將其涂布在含O. 1% (體積比)Triton-XlOO的麗固體培養(yǎng)基平板上分單孢，待菌絲長(zhǎng)出后，抽提基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定。PCR鑒定所用的引物如下pyrmF:5’ -TCATAGAATGCAGCTGTATTTAGGC-3’ ；dodoR 5’ -AACTCTGAGTTAGCTGTTAAACTGG-3’。pyrmF對(duì)應(yīng)pyr4表達(dá)盒中的序列，dodoR對(duì)應(yīng)Tu6 Λ tku70菌株基因組DNA中trmak基因下游同源臂外側(cè)，可以擴(kuò)增得到約1500bp片段的菌株為重組菌甲。鑒定結(jié)果見圖I，其中M為Ikb DNA ladder marker, I和2為重組菌甲，3為Tu6 Δ tku70 菌株。實(shí)施例2、重組菌乙的獲得將質(zhì)粒pBluescript SK (+)代替重組質(zhì)粒 pSK-Ptrmak-pyr4_Ttrmak 進(jìn)行實(shí)施例I的步驟二的操作，得到重組菌乙。實(shí)施例3、重組菌的發(fā)酵和粗酶液的纖維素酶活性鑒定將實(shí)施例I獲得的重組菌甲、實(shí)施例2獲得的重組菌乙或出發(fā)菌(TU6 Δ tku70菌株)分別進(jìn)行如下步驟一、重組菌的發(fā)酵I、將菌株轉(zhuǎn)至PDA固體培養(yǎng)基平板上產(chǎn)孢，然后用無菌水洗滌孢子并用無菌水制成高濃度的孢子懸液4X 107-5X IO7個(gè)孢子/mL。
2、將O. 5mL孢子懸液接種于250mL三角瓶中的50mL含2g/100mL葡萄糖的MM液體培養(yǎng)基中，28°C，200rpm預(yù)培養(yǎng)48h，四層紗布過濾并收集菌體。3、稱取1.8克菌體(濕重)于5011^發(fā)酵培養(yǎng)基中，281，200印111震蕩培養(yǎng)，分別于振蕩培養(yǎng)48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)、120小時(shí)和144小時(shí)后取樣。發(fā)酵培養(yǎng)基(pH5. 2±0. I):含lg/1OOmL微晶纖維素的麗液體培養(yǎng)基。4、將步驟3取得的樣本12000r/min離心5min,收集上清液。將重組菌甲振蕩培養(yǎng)48小時(shí)取樣并進(jìn)行步驟4得到的上清液命名為重組菌甲粗酶液48/>w。將重組菌甲振蕩培養(yǎng)72小時(shí)取樣并進(jìn)行步驟4得到的上清液命名為重組菌甲粗酶液72/>w。將重組菌甲振蕩培養(yǎng)96小時(shí)取樣并進(jìn)行步驟4得到的上清液命名為重組菌甲粗酶液96/>_。將重組菌甲振蕩培養(yǎng)120小時(shí)取樣并進(jìn)行步驟4得到的上清液命名為重組菌甲粗酶液12M、w。將重組菌甲振蕩培養(yǎng)144小時(shí)取樣并進(jìn)行步驟4得到的上清液命名為重組菌甲粗酶液144/j、w。 將重組菌乙振蕩培養(yǎng)48小時(shí)取樣并進(jìn)行步驟4得到的上清液命名為重組菌乙粗酶液48/>w。將重組菌乙振蕩培養(yǎng)72小時(shí)取樣并進(jìn)行步驟4得到的上清液命名為重組菌乙粗酶液72/>w。將重組菌乙振蕩培養(yǎng)96小時(shí)取樣并進(jìn)行步驟4得到的上清液命名為重組菌乙粗酶液96/>_將重組菌乙振蕩培養(yǎng)120小時(shí)取樣并進(jìn)行步驟4得到的上清液命名為重組菌乙粗酶液12M、w。將重組菌乙振蕩培養(yǎng)144小時(shí)取樣并進(jìn)行步驟4得到的上清液命名為重組菌乙粗酶液144小時(shí)。將出發(fā)菌振蕩培養(yǎng)48小時(shí)取樣并進(jìn)行步驟4得到的上清液命名為出發(fā)菌粗酶液48,>w。將出發(fā)菌振蕩培養(yǎng)72小時(shí)取樣并進(jìn)行步驟4得到的上清液命名為出發(fā)菌粗酶液72/>w。將出發(fā)菌振蕩培養(yǎng)96小時(shí)取樣并進(jìn)行步驟4得到的上清液命名為出發(fā)菌粗酶液96/j、w。將出發(fā)菌振蕩培養(yǎng)120小時(shí)取樣并進(jìn)行步驟4得到的上清液命名為出發(fā)菌粗酶液12(|/>w。將出發(fā)菌振蕩培養(yǎng)144小時(shí)取樣并進(jìn)行步驟4得到的上清液命名為出發(fā)菌粗酶液144/j、w。二、SDS-PAGE 分析將步驟一得到的各個(gè)粗酶液進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果見圖2。圖2中，I至3代表出發(fā)菌，3至6代表重組菌甲，48小時(shí)、72小時(shí)和120小時(shí)都代表發(fā)酵時(shí)間。因?yàn)榇置敢簽榘l(fā)酵液上清，根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)和文獻(xiàn)記載，對(duì)于木霉來說，先以纖維素為底物進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)的條件下，分泌到胞外的蛋白基本上都是纖維素降解相關(guān)的酶，由圖2中可以觀察到，各個(gè)蛋白的表達(dá)量均隨發(fā)酵時(shí)間上升。三、粗酶液的纖維素酶活性鑒定將步驟一得到的各個(gè)粗酶液參照IUPAC標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行纖維素酶活性測(cè)定，具體方法如下(I)取100 μ I步驟一得到的上清液，加入IOmL含O. 05g/100mL苯甲酸鈉的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(O. 05M、pH4. 8)中，得到稀釋至101倍的酶液。(2)將Whatmanl號(hào)濾紙制成6cm長(zhǎng)、Icm寬的形狀(50mg左右),折成4折,呈M型。(3)分組處理實(shí)驗(yàn)組將步驟(2)的濾紙條置于試管底部，加入含0.05g/100mL苯甲酸鈉的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(O. 05Μ、ρΗ4· 8) I. 5mL, 50°C水浴60分鐘；然后加入O. 5mL步驟⑴得到的酶液，混合均勻，使管內(nèi)溶液浸沒濾紙，50°C水浴I小時(shí)，迅速冷卻；向試管中加入3mLDNS試劑，混合均勻，在沸水中煮lOmin，迅速冷卻，用蒸餾水定容至25mL。對(duì)照組將步驟(2)的濾紙條置于試管底部，加入含O. 05g/100mL苯甲酸鈉的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(O. 05M、pH4. 8) I. 5mL，50°C水浴60分鐘，使管內(nèi)溶液浸沒濾紙，50°C水浴I小時(shí)，迅速冷卻；向試管中加入3mL DNS試劑，然后加入O. 5mL步驟(I)得到的酶液，混合均勻，在沸水中煮IOmin,迅速冷卻,用蒸懼水定容至25mL。以對(duì)照組試管為參比，測(cè)定540nm的吸光度(A54tlnm)。在50°C、pH4. 8的條件下，每分鐘水解濾紙底物，產(chǎn)生Iumol還原糖(以葡萄糖計(jì))所需要的酶量定義為一個(gè)國(guó)際單位濾紙酶活(1FPU)。采用葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，制作A54tlnm和葡萄糖濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如下Y=O. 6692X-0. 0082，Y 代表葡萄糖濃度(umol/mL)，X 代表 A54tlnm 數(shù)值；R2=0. 9988。每毫升粗酶液酶活檢測(cè)結(jié)果見圖3。重組菌甲得到的粗酶液的纖維素酶活力顯著 高于出發(fā)菌得到的粗酶液。重組菌乙得到的粗酶液的纖維素酶活力與出發(fā)菌得到的粗酶液一致。結(jié)果表明，敲除TrMAK基因后，可以使木霉生產(chǎn)纖維素酶的能力顯著增加。
權(quán)利要求
1.一種構(gòu)建工程菌的方法，包括如下步驟抑制木霉中TrMAK基因的表達(dá)，得到工程菌；所述TrMAK基因編碼如下(a)或(b)所述的TrMAK蛋白 Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與木霉中的纖維素酶合成相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述TrMAK基因?yàn)槿缦翴)至4)中任一所述的DNA分子 1)序列表的序列2所不的DNA分子； 2)序列表的序列3所不的DNA分子； 3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子； 4)與I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。
3.如權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于所述“抑制木霉中TrMAK基因的表達(dá)”的實(shí)現(xiàn)方法如下通過同源重組敲除木霉中的所述TrMAK基因。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述“通過同源重組敲除木霉中的所述TrMAK基因”的實(shí)現(xiàn)方法如下將含有DNA片段甲的重組質(zhì)粒導(dǎo)入所述木霉中；所述DNA片段甲自上游至下游依次包括所述TrMAK基因的上游同源臂和所述TrMAK基因的下游同源臂。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述DNA片段甲中，在所述上游同源臂和所述下游同源臂之間還具有篩選標(biāo)記基因。
6.如權(quán)利要求I至5中任一所述的方法，其特征在于所述木霉為里氏木霉。
7.權(quán)利要求I至6中任一所述方法得到的工程菌。
8.—種生產(chǎn)纖維素酶的方法，包括如下步驟發(fā)酵權(quán)利要求7所述工程菌，得到纖維素酶。
9.抑制TrMAK基因表達(dá)的物質(zhì)在促進(jìn)木霉生產(chǎn)纖維素酶中的應(yīng)用；所述TrMAK基因編碼如下(a)或(b)所述的TrMAK蛋白 Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與木霉中的纖維素酶合成相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。
10.TrMAK蛋白在調(diào)節(jié)木霉中的纖維素酶合成中的應(yīng)用；所述TrMAK蛋白是如下(a)或(b) Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與木霉中的纖維素酶合成相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種TrMAK蛋白在調(diào)節(jié)纖維素酶產(chǎn)量中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種構(gòu)建工程菌的方法，包括如下步驟抑制木霉中TrMAK基因的表達(dá)，得到工程菌；所述TrMAK基因編碼如下(a)或(b)所述的TrMAK蛋白(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與木霉中的纖維素酶合成相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還保護(hù)所述TrMAK蛋白在調(diào)節(jié)木霉中的纖維素酶合成中的應(yīng)用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，敲除TrMAK基因后，木霉生產(chǎn)纖維素酶的能力顯著增加。本發(fā)明對(duì)于纖維素酶的生產(chǎn)具有重大價(jià)值，對(duì)于解決能源危機(jī)和環(huán)境危機(jī)具有潛在影響。
文檔編號(hào)C12N1/15GK102776131SQ201210247669
公開日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2012年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月17日
發(fā)明者董志揚(yáng), 陳秀珍, 陳飛 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所