專利名稱：儀寧小麥抗小麥黃花葉病毒主效qtl的分子標記及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，公開了 ‘儀寧小麥’抗小麥黃花葉病毒主效QTL的分子標記及其應用。
背景技術：
普通小麥(Triticum aestivum L)有21對染色體,每對包含兩條一樣的染色體，這 21 條染色體分別為 1A、1B、1D、2A、2B、2D、3A、3B、3D、4A、4B、4D、5A、5B、5D、6A、6B、6D、7A、7B、7D，普通小麥通常用AABBDD表示(圖I)。每條染色體又包含長臂和短臂，分別用L和S表示，比如2D染色體包括長臂2DL和短臂2DS。
小麥作為世界性的重要糧食作物，在農業生產中具有舉足輕重的地位，但由真菌一禾谷多黏菌(Polymyxa graminis)(見參考文獻Inouye T(1969)Viral pathogenofthe wheat yellow mosaic disease. Nogaku Kenkyu53 :61-68)介導的小麥黃花葉病毒(Wheat yellow mosaic bymovirus, WYMV)引起的小麥黃花葉病(Wheat yellow mosaic,WYM)對小麥的生長發育及產量造成了嚴重危害，正日益成為危害我國和日本等亞洲國家小麥生產的最嚴重的病害之一(見參考文獻1、陶家鳳，秦家忠，肖際亨，沈言章，趙福臻，李天眷，謝貽遠，何代富，饒有后，黃顯華(1980)四川土傳小麥黃色花葉病的研究.植物病理學報10 5-25 ;2、于善謙，陳仲宜，徐來升，張若平，王鳴岐，羅瑞梧(1986)發生在我國的小麥黃花葉病毒病.植物保護學報13 =217-219 ;3、李大偉，韓成貴，邢怡明，田兆豐，于嘉林，蔡祝南，劉儀(1997)中國小麥黃花葉病毒(WYMV)分布的RT-PCR鑒定.植物病理學報27 303-307)。將抗性主效QTL/基因引入小麥栽培品種，培育和推廣抗病毒品種是目前生產上防治小麥黃花葉病最經濟有效的方法。普通小麥品種‘儀寧小麥’(公知公用，見參考文獻侯慶樹(1993)抗梭條花葉病小麥新品種一儀寧小麥.江蘇科技短訊9 (4) :7-10)具有耐旱、耐寒、耐肥、抗倒等性狀優良，抗病性較好，綜合性狀優良。南京農業大學細胞遺傳所對‘儀寧小麥’抗黃花葉病進行了鑒定，結果表明‘儀寧小麥’對小麥黃花葉病表現出高抗，‘鎮9523’表現高感。為了進一步研究‘儀寧小麥’對小麥黃花葉病的抗性遺傳機制和定位抗性QTL，南京農業大學細胞遺傳所以高抗小麥黃花葉病的‘儀寧小麥’作母本、高感小麥抗黃花葉病的‘鎮9523’(審定品種)作父本、構建了 F2:8重組自交系群體(Recombinant inbred line, RIL),并開展了利用該RIL群體進行抗性QTL定位以及與主效QTL緊密連鎖分子標記的篩選工作，以及進一步利用“RIL11 - 14X鎮9523”次級F2分離群體進行抗病主效QTL QYm. nau_2D. I精細定位的研究。
發明內容
本發明的目的在于提供來自普通小麥品種‘儀寧小麥’的抗小麥黃花葉病主效QTLQYm. nau-2D. I緊密連鎖分子標記2EST730。本發明的另一目的是提供該分子標記的引物對。
本發明的又一目的是提供該分子標記的應用。本發明的目的可通過如下技術方案實現‘儀寧小麥’中抗小麥黃花葉病主效QTL QYm. nau_2D. I的分子標記2EST730，該分子標記2EST730的上游引物2EST730F序列如SEQ ID NO. I所示，下游引物2EST730R序列如 SEQ ID NO. 2 所示。所述的分子標記2EST730與QYm. nau-2D. I之間的遺傳距離為O. 3cM。所述的分子標記2EST730的引物對，其上游引物2EST730F序列如SEQ ID NO. I所示，下游引物2EST730R序列如SEQ ID NO. 2所示。抗小麥黃花葉病主效QTL QYm. nau_2D. I的分子標記方法，包括以待鑒定材料的DNA作為模板，用權利要求3所述的分子標記2EST730的引物對進行PCR擴增；PCR產物進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，再用銀染法檢測；能擴增出約600bp特異條帶的植株 為含有抗小麥黃花葉病主效QTL QYm. nau-2D. I的植株。所述的抗小麥黃花葉病主效QTL QYm. nau_2D. I的分子標記方法,優選包括如下步驟(I)以待鑒定材料的DNA作為模板，用權利要求3所述的分子標記2EST730的引物對進行PCR擴增；PCR 試劑組成為I μ L DNA 模板(20_100ng)，I. O μ LlO X PCR buffer,0. 8μ LMgCl2(25mmol/L),0. 8μ L dNTP(2. 5mmol/L)，上、下游引物(10ymol/L)各 O. 2μ L，0. 15μ LTaq DNA polymerase(5U/μ L),5. 85 μ L ddH20 ；PCR程序為94°C預變性3分鐘；94°C變性30秒，55°C退火50秒，72°C延伸I分10秒，35個循環；72°C延伸10分鐘；10°C保存；PCR產物檢測PCR產物在丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺質量比39:1的非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，再用銀染法檢測；(2)標記引物鑒定QYm. nau-2D. I的結果為能擴增出約600bp特異條帶的植株為含有QYm. nau_2D. I的植株。所述的分子標記2EST730在分子標記輔助選擇育種中的應用。所述的分子標記2EST730在選育抗小麥黃花葉病小麥品種中的應用。有益效果I、本發明中公開的與‘儀寧小麥’中抗小麥黃花葉病主效QTL QYm. nau_2D. I緊密連鎖的分子標記的引物(2EST730F/2EST730R)是基于小麥EST序列設計而成，用來鑒定植株中是否含有QYm. nau-2D. 1，簡單易行、方便快捷、擴增穩定。2、標記引物2EST730F/2EST730R擴增的產物與QYm. nau_2D. I之間的遺傳距離為O. 3cM,與現有技術中公開的分子標記相比，本發明分子標記與QYm. nau_2D. I遺傳距尚更近，意味著利用分子標記輔助選擇QYm. nau-2D. I的準確性更高。
圖I :普通小麥染色體示2 :小麥抗黃花葉病單株抗性鑒定分級標準圖3 :標記引物2EST730F/2EST730R所對應的小麥EST (BE423370)序列及引物序列位置圖4 :利用F2次級群體對QYm. nau_2D. I進行精細定位圖5 :用“儀寧小麥X鎮9523”RIL群體雙親和部分抗、感家系的DNA作為模板，用本發明中的標記引物2EST730F/2EST730R進行PCR擴增，結果表明標記引物2EST730F/2EST730R在抗病親本‘儀寧小麥’(泳道I)和抗病家系(泳道3-7，10，11，13，15-17，19-22)中均擴增出約600bp的特異條帶，而在感病的親本和家系中均未擴增出相應的特異條帶。白色箭頭所示為特異條帶。注M. Marker ；1.儀寧小麥；18.鎮9523 ;3_17及19-22為部分抗、感家系；R.純
合抗病；S.純合感病圖6 :用“RIL11 — 14X鎮9523”次級F2分離群體雙親和抗、感池及部分抗、感單 株的DNA作為模板，用本發明中的標記引物2EST730F/2EST730R進行PCR擴增，結果表明標記引物2EST730F/2EST730R在抗病親本’RILl 1-14’(泳道21 )、純合抗病單株(泳道1，2，16)、雜合抗病單株(泳道11，19，20)中均擴增出約600bp的特異條帶，而標記引物在感病的親本和單株中均未擴增出相應的特異條帶。白色箭頭所示為特異條帶。注M.Marker ；21. RILll — 14 ；22.鎮 9523 ;1_20·部分抗、感單株；R.純合抗病；H.雜合抗病；S.純合感病。
具體實施例方式實施例I小麥抗黃花葉病的抗性鑒定標準分為0-5級(圖2)(參考文獻劉偉華，何震天，耿波，侯明生，張敏，聶桓等(2004)小麥對黃花葉病的抗性鑒定及典型品種的遺傳分析.植物病理學報34 =542-547) 0級為植株無癥狀；1級為植株矮縮不明顯，輕度花葉，一般不產生明顯的條紋壞死斑，葉片不黃化或少數黃化；2級為植株矮縮不明顯，輕度花葉，產生明顯的條紋壞死斑，葉片黃化明顯；3級為植株輕度矮縮，花葉明顯，條紋壞死斑占葉面積1/2左右，部分葉片黃化，少數枯死，分蘗黃化矮縮；4級為植株明顯矮縮，嚴重花葉，條紋斑占葉面積3/4左右，心葉細弱扭曲或呈縮頂狀，部分葉片和分蘗枯死；5級為植株嚴重矮縮，大部分葉片和分蘗或整株枯死。‘儀寧小麥’對小麥黃花葉病表現高抗，抗性水平為O級；‘鎮9523’則表現高感，抗級水平為5級。在三個環境中(2007在南京六合試驗點；2008_2009連續兩年在江蘇揚州試驗點)對“儀寧小麥X鎮9523”的RIL群體(重組自交系群體)進行了小麥黃花葉病抗性鑒定。選取涉及小麥21條染色體上的1336對引物(包括SSR、EST-SSR和STS)在抗病親本“儀寧小麥”與感病親本“鎮9523”之間進行引物多態性篩選，然后對179個表現多態的引物繼續在自交系群體(106個株系)中進行擴增，并用作圖軟件JoinMap4. O進行連鎖關系分析，構建分子標記遺傳圖譜，在此基礎上進一步使用IciMapping3. I軟件定位小麥黃花葉病抗性相關QTL。結果表明位于‘儀寧小麥’ 2DL染色體上的主效QTL QYm. nau_2D. I在三個環境中均被檢測到，可解釋76. 25-93. 19%的表型變異。從RIL群體中選擇一個農藝性狀與鎮9523相似的抗性家系‘RIL11 — 14’，利用該家系與鎮9523雜交構建了一個次級F2分離群體及其衍生的F2:3家系。對該F2群體及F2:3家系的遺傳分析表明‘RIL11 - 14’中的小麥黃花葉病抗性受顯性單基因控制，F2群體中純合抗病基因型(QYm. nau-2D//QYm. nau_2D)的單株有348株，雜合抗病基因型(QYm. nau-2D//qym. nau_2D)有714株，純合感病基因型(qym. nau-2D//qym. nau_2D)有349株,卡方測驗表明符合I 2 1的分離比。利用F2群體對QYm. nau-2D進行精細定位，采用MAPMAKER3. O軟件計算遺傳距離，其中標記2EST730與QYm. nau-2D. I緊密連鎖，遺傳距離為O. 3cM (圖4)。I、與QYm. nau_2D. I緊密連鎖分子標記引物的設計在上述分子標記連鎖圖譜構建和抗小麥黃花葉病主效QTL QYm. nau_2D. I發掘的研究中，分子標記2EST730與QYm. nau_2D. I緊密連鎖(圖4)，并且與QYm. nau_2D. I的遺傳距離為O. 3M。標記2EST730的引物是根據小麥第二同源群上的EST序列(BE423370X公知公用，見參考文獻Qi LL,Echalier B,Chao S,Lazo GR,Butler GE,Anderson OD et al (2004)A chromosome bin map of16, OOOexpressed sequence tag loci and distribution ofgenes among the three genomes of polyploid wheat. Geneticsl68 :701-712),米用在線引物設計軟件 Primer3V0. 4. O 設計而成(http //frodo. wi. mit. edu/primer3/)。
標記2EST730的引物2EST730F AAATCTCCCAAAAAGCTGAC (SEQ ID NO. I)；2EST730R GGGTCTAACATTGGAGAAGG (SEQ ID NO. 2)(圖 3)2、標記引物2EST730F/2EST730R在“儀寧小麥X鎮9523”RIL群體中的分子檢測利用標記引物2EST730F (SEQ ID NO. I) /2EST730R (SEQ ID NO. 2)在 RIL 群體的106個家系及其雙親中進行PCR擴增檢測。結果表明在高抗親本‘儀寧小麥’和78個家系中均擴增出約600bp的特異條帶，而在高感親本‘鎮9523’和剩下的28個家系中均未擴增出該特異條帶(圖5)。PCR 試劑組成為I μ L DNA 模板(20_100ng)，I. O μ LlO X PCR buffer, 0. 8 μ LMgCl2C 25mmol/L), 0. 8μ L dNTP(2. 5mmol/L)，上、下游引物(10ymol/L)各 O. 2μ L，0. 15μ LTaq DNA polymerase(5U/μ L),5. 85 μ L ddH20 ；PCR程序為94°C預變性3分鐘；94°C變性30秒，55°C退火50秒，72°C延伸I分10秒，35個循環；72°C延伸10分鐘；10°C保存。PCR產物在丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺質量比為39:1的非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，再用銀染法進行染色。3、標記引物2EST730F/2EST730R在F2分離群體中的分子檢測為了進一步評價QYm. nau_2D. I的抗病效應和精細定位該QTL，本實驗室結合分子標記分析和表型鑒定結果，又從RIL群體中選擇一個高抗家系‘RIL11 - 14’，并構建了“RIL11-14X鎮9523”次級F2分離群體(1368個單株)。遺傳分析表明，QYm. nau_2D. I在次級F2分離群體中呈顯性單基因遺傳。利用標記引物2EST730F/2EST730R在F2群體雙親及群體單株中進行PCR擴增檢測(條件和方法同上)。結果表明在1368個F2單株中，346株純合抗病單株均擴增出與高抗親本‘RIL11-14’ 一致的特異條帶(約600bp)，305株純合感病單株均擴增出與高感親本‘鎮9523’ 一致的特異條帶(約595bp)，而711株雜合抗病單株能同時擴增兩種特異條帶(圖6)。根據擴增結果和連鎖分析，結果表明標記2EST730與QYm.nau-2D. I之間的遺傳距離為0. 3cM (圖4)。次級F2分離群體和RIL群體的結果互相驗證，即QYm. nau-2D. I既是‘儀寧小麥’中抗小麥黃花葉病的主效QTL，又是高抗家系‘RIL11-14’中抗小麥黃花葉病基因，并且標記2EST730與QYm. nau_2D. I緊密連鎖。
權利要求
1.‘儀寧小麥’中抗小麥黃花葉病主效QTL QYm. nau_2D. I的分子標記2EST730，其特征在于該分子標記2EST730的上游引物2EST730F序列如SEQ ID NO. I所示，下游引物2EST730R 序列如 SEQ ID NO. 2 所示。
2.根據權利要求I所述‘儀寧小麥’中抗小麥黃花葉病主效QTLQYm. nau_2D. I分子標記2EST730，其特征在于所述的分子標記2EST730與QYm. nau_2D. I之間的遺傳距離為0.3cM0
3.權利要求I所述的分子標記2EST730的引物對，其特征在于上游引物2EST730F序列如SEQID NO. I所示，下游引物2EST730R序列如SEQ ID NO. 2所示。
4.抗小麥黃花葉病主效QTLQYm.nau-2D. I的分子標記方法，其特征在于包括以待鑒定材料的DNA作為模板，用權利要求3所述的分子標記2EST730的引物對進行PCR擴增；PCR產物進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，再用銀染法檢測；能擴增出約600bp特異條帶的植株為含有抗小麥黃花葉病主效QTL QYm.nau-2D. I的植株。
5.根據權利要求4所述的抗小麥黃花葉病主效QTLQYm.nau-2D. I的分子標記方法，其特征在于包括如下步驟 (1)以待鑒定材料的DNA作為模板，用權利要求3所述的分子標記2EST730的引物對進行PCR擴增； PCR 試劑組成為PCR 試劑組成為liiL DNA 模板，I. Oii LlO X PCR buffer，0. 8 y LMgCl2，0. LdNTP，上、下游引物各 0. L，0. 15ii L Taq DNA polymerase, 5. 85 u L ddH20 ； PCR程序為94°C預變性3分鐘；94°C變性30秒，55°C退火50秒，72°C延伸I分10秒，35個循環；72°C延伸10分鐘；10°C保存； PCR產物檢測PCR產物在丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺質量比39:1的非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，再用銀染法檢測； (2)標記引物鑒定QYm.nau-2D. I的結果為 能擴增出約600bp特異條帶的植株為含有QYm. nau-2D. I的植株。
6.權利要求I所述的分子標記2EST730在分子標記輔助選擇育種中的應用。
7.權利要求I所述的分子標記2EST730在選育抗小麥黃花葉病小麥品種中的應用。
全文摘要
本發明公開了與‘儀寧小麥’抗小麥黃花葉病毒主效QTL QYm.nau-2D.1的分子標記方法，屬于生物技術領域。首先公開了與QTL QYm.nau-2D.1緊密連鎖的分子標記2EST730，同時公開了該標記的引物2EST730F/2EST730R。在含有QTL QYm.nau-2D.1的材料中，標記引物2EST730F/2EST730R擴增出約600bp的產物與QYm.nau-2D.1緊密連鎖，遺傳距離為0.3cM。本發明公開的與QYm.nau-2D.1緊密連鎖分子標記，可用于小麥抗黃花葉病分子標記輔助選擇育種。
文檔編號C12Q1/68GK102807984SQ20121024684
公開日2012年12月5日 申請日期2012年7月17日 優先權日2012年7月17日
發明者王秀娥, 郭嬌, 吳真真, 朱曉彪, 王海燕, 曹愛忠, 肖進 申請人:南京農業大學