專利名稱：檢測艾滋病相關(guān)支原體的引物、探針組合及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及用于檢測艾滋病相關(guān)支原體的熒光定量PCR弓I物和探針及試劑盒。艾滋病相關(guān)支原體分別為穿透支原體(Mycoplasma penetrans)、發(fā)酵支原體(Mycoplasma fermentans)和梨支原體(Mycoplasma pirum)。
背景技術(shù)：
艾滋病相關(guān)支原體通常指穿透支原體(Mycoplasma penetrans)、發(fā)酵支原體(Mycoplasma fermentans)和梨支原體(Mycoplasma pirum)。這三種支原體在HIV感染及·AIDS的發(fā)展過程中起著輔助因子或者促進因子的作用，與艾滋病的發(fā)病具有顯著的相關(guān)性，因此稱為艾滋病相關(guān)支原體(參考文獻Montagnier L, Blanchard A. Mycoplasmas asco-factors in infection due to the human immunodeficiency virus[J]. Clin infectDis, 1993，17:5309.)。如果診斷出艾滋病患者帶有穿透支原體、發(fā)酵支原體和梨支原體，在現(xiàn)有的治療方案上進行針對性治療，就能夠減少感染機會，也就可以在一定程度上延長患者的生命。目前國內(nèi)臨床對于上述3種支原體的診斷技術(shù)十分有限，造成部分攜帶艾滋病相關(guān)支原體的患者不能及時有效診斷和治療，加重了艾滋病病毒對機體免疫抑制，增大了機會感染其他病原，嚴重威脅艾滋病患者生命。及時有效診斷艾滋病感染者是否感染上述3種艾滋病相關(guān)支原體對于艾滋病的輔助治療十分有效，但常規(guī)的病原體分離培養(yǎng)方法較難實施。這是因為艾滋病相關(guān)支原體的生長速度緩慢，分離培養(yǎng)困難，既增加了診斷成本，又延誤了確診時機，因此臨床上不使用分離培養(yǎng)作為檢測手段。目前，國內(nèi)外尚無成熟的艾滋病相關(guān)支原體血清學(xué)檢測試劑盒。盡管臨床對艾滋病相關(guān)支原體在艾滋病發(fā)展進程中的作用及其臨床檢測技術(shù)越來越重視，但是目前已報道的PCR檢測技術(shù)主要為普通PCR技術(shù)。國內(nèi)對于艾滋病相關(guān)支原體檢測主要依靠PCR方法(參考文獻糜祖煌，趙季文，秦玲.淋病患者AIDS相關(guān)支原體的分離培養(yǎng)與核酸檢測[J].中國人獸共患病雜志，2003，19 (3) :79-81.賈成梅，施素潔，羊海濤，等.從艾滋病患者和HIV感染者中分離2株支原體[J].中國人獸共患病雜志，2003, 19(6) :77-79. )。PCR檢測靈敏度一般，且對于3種支原體分別進行檢測和電泳判讀結(jié)果耗時費力，極大的增加了臨床檢測工作量和檢測成本，降低了檢測效率。因此，急需建立一種快速、靈敏、特異的檢測技術(shù)來提高臨床對艾滋病相關(guān)支原體的檢測能力。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于一種能同時檢測3種檢測艾滋病相關(guān)支原體的試劑盒和診斷試劑，以克服上述不足。本發(fā)明首先提供一種用于同時檢測艾滋病相關(guān)支原體的三重?zé)晒釶CR引物組合，所述艾滋病相關(guān)支原體分別為穿透支原體(Mycoplasma penetrans)、發(fā)酵支原體(Mycoplasma fermentans)和梨支原體(Mycoplasma pirum)。
本發(fā)明通過對NCBI數(shù)據(jù)庫中報道的穿透支原體的ftsZ基因、發(fā)酵支原體的ftsZ基因和梨支原體的rpoB基因中保守區(qū)域使用Beacon Desinger7軟件設(shè)計探針和引物。探針類型均為TaqMan探針，其中穿透支原體探針5’標記熒光基團FAM，3’標記淬滅基團BHQl ；發(fā)酵支原體探針5’標記熒光基團HEX，3’標記淬滅基團BHQl ;梨支原體探針5’標記熒光基團R0X，3’標記淬滅基團BHQ2。進一步地，本發(fā)明提供的引物組合中，檢測穿透支原體的引物序列為Mpen-F:ACGTGAGTTAACCATGTA (SEQ ID NO. I)Mpen-R:GGTTCGTCTTCTATCTAATAG (SEQ ID NO. 2)；檢測發(fā)酵支原體的引物序列為Mfer-F:TGCTGTTTCAATGTCATC (SEQ ID NO. 3)·Mfer-R:AGACCGAGCTATTAAAGC (SEQ ID NO. 4)；檢測梨支原體的引物序列為Mpi-F:CGTGATTTCTTTAATACTCATC (SEQ ID NO. 5)Mpi-R:CACGAATATCCAAGTTAGG (SEQ ID NO. 6)。本發(fā)明提供了與上述引物組合配合使用的熒光探針組合，其中與穿透支原體的引物配合使用的探針核苷酸序列為Mpen-P:FAM-TTACCAGCACCACCAATACCAATAAT-BHQ1 (SEQ ID NO. 7)與發(fā)酵支原體的引物配合使用的探針核苷酸序列為Mfer-P:HEX-TTGATGATGCTTTAATGACTCCACTTT-BHQ1 (SEQ ID NO. 8)與穿透支原體的引物配合使用的探針核苷酸序列為Mpi-P:R0X-CCAGGTCCCATTGCTGAAATTCT-BHQ2 (SEQ ID NO. 9)。本發(fā)明還提供了上述引物組合和熒光探針組合在制備艾滋病相關(guān)支原體的檢測試劑盒或診斷試劑中的應(yīng)用。具體地，上述應(yīng)用是將Platium quantitative PCR super Mix UDG12. 5 U I, 50mMMgCl2 2. Ou I ；Platium TaqO. 25 u I ；dNTP 混合溶液 l.Oul ；Mfer-F 和 Mfer-R 各 0. 8 y I ;Mfer-PO. 4 u I ;Mpen_F 和 Mpen-R 各 0. 5 y I ；Mpen-P0. 2 u I ;Mpi_F 和 Mpi-F 各 0. 3 y I ;Mpi-PO. I u 1，無核酸酶水0. 35 ill ;待測樣品DNA模板5. 0 構(gòu)成25 u I的檢測反應(yīng)體系；上述引物和探針濃度均為25 u M0具體地，上述應(yīng)用中，試劑盒的工作條件為95°C預(yù)變性3min，I個循環(huán)；95°C變性15s，57°C -60°C退火15s，40個循環(huán)；然后終止反應(yīng)。優(yōu)選地，試劑盒的工作條件中退火溫度為59°C。本發(fā)明提供一種艾滋病相關(guān)支原體的診斷試劑，含有SEQ ID NO. 1-6所示的引物組合和SEQ ID NO. 7-9所示的突光探針組合；所述艾滋病相關(guān)支原體為穿透支原體(Mycoplasma penetrans)、發(fā)酵支原體(Mycoplasma fermentans)和梨支原體(Mycoplasmapirum)。本發(fā)明還提供一種艾滋病相關(guān)支原體的檢測試劑盒，含有SEQ ID NO. 1-6所示的引物組合和SEQ ID NO. 7-9所示的突光探針組合；所述艾滋病相關(guān)支原體為穿透支原體(Mycoplasma penetrans)、發(fā)酵支原體(Mycoplasma fermentans)和梨支原體(Mycoplasmapirum)。
本發(fā)明提供的試劑盒，還包括熒光定量反應(yīng)液，陰性模板和陽性模板，所述陰性模板為無核酸酶水，所述陽性模板為艾滋病相關(guān)支原體穿透支原體、發(fā)酵支原體和梨支原體基因組DNA。進一步地，所述的試劑盒中，其25 ill的檢測反應(yīng)體系的具體配置為=Platiumquantitative PCR super Mix UDG12. 5 U I,50mM MgCl2 2.0 U I ；Platium TaqO. 25 U I ；dNTP 混合溶液 I. 0 ii I ；Mfer-F 和 Mfer-R 各 0. 8 y I ；Mfer-P0. 4 u I ;Mpen_F 和 Mpen-R 各
0.5u I ；Mpen-P0. 2 u I ;Mpi_F 和 Mpi-F 各 0. 3 y I ；Mpi-P0. I u I，無核酸酶水 0. 35 u I ;待測樣品DNA模板5. 0 ill ;上述引物和探針濃度均為25 u M。
進一步地，所述試劑盒的工作條件為95°C預(yù)變性3min，I個循環(huán)；95°C變性15s，57°C -60°C退火 15s，40 個循環(huán)。本發(fā)明提供的同時檢測3種艾滋病相關(guān)支原體的試劑盒是以三重?zé)晒釶CR方法為基礎(chǔ)進行檢測的，包括以樣品總DNA為模板，利用本發(fā)明提供的引物和探針進行實時熒光定量PCR，同時設(shè)立陰性對照和陽性對照，根據(jù)擴增曲線的Ct值判定結(jié)果。本發(fā)明試劑盒每次檢測標本時必須設(shè)立NEG對照(陰性對照)和POS對照(陽性對照)，兩種對照對于結(jié)果判讀起決定性作用有效擴增NEG(―)和 POS ( + )無效擴增NEG ( + )和POS ( + )提示體系污染無效擴增NEG (—)和POS (—)提示體系錯誤或者試劑失效。在對照有效擴增的情況下，樣品檢測結(jié)果可信，否則試驗需要重復(fù)；在檢測中兩種對照為有效擴增時，樣本結(jié)果判斷標準如下Ct值小于等于36的標本為陽性結(jié)果；Ct值大于38的標本為陰性結(jié)果；Ct值在36-38之間的標本需要重復(fù)，重復(fù)試驗如Ct值依然低于38判定為陽性擴增，超過38判定為陰性擴增。本發(fā)明試劑盒采用的實時熒光定量PCR的反應(yīng)程序為95°C預(yù)變性3min，I個循環(huán)；95°C變性 15s，57。。-60°C退火 15s, 40 個循環(huán)。本發(fā)明在實施例5對試劑盒的檢測靈敏度進行了比較實驗發(fā)現(xiàn)本發(fā)明試劑盒檢測的靈敏度與普通PCR檢測方法檢測靈敏度高10-100倍。本發(fā)明針對三種艾滋病相關(guān)支原體的基因中保守區(qū)域設(shè)計多重特異性探針和引物。通過實驗室條件優(yōu)化，建立了單個反應(yīng)可同時檢測這三種病原的簡便、準確、快速的方法以及以該方法為基礎(chǔ)構(gòu)建的靈敏度高、特異性強的檢測試劑盒，簡化了現(xiàn)有檢測三種病原支原體2/3以上的檢測工作量，并縮短檢測時間I小時左右。本發(fā)明提供的檢測三種艾滋病相關(guān)支原體的試劑盒對于穿透支原體的檢測靈敏度為IO3拷貝，高于普通PCR 10倍；發(fā)酵支原體的檢測靈敏度為IO3拷貝，高于普通PCR 10倍；梨支原體的檢測靈敏度為IO2拷貝，高于普通PCR 100倍。且本發(fā)明試劑盒對臨床常見21種病原體以及人類染色體均無非特異擴增，顯示出良好的特異度。
圖I為穿透支原體單重?zé)晒釶CR退火溫度優(yōu)化結(jié)果圖，其中59 °C為最優(yōu)退火溫度。
圖2為發(fā)酵支原體單重?zé)晒釶CR退火溫度優(yōu)化結(jié)果圖，其中59°C為最優(yōu)退火溫度。圖3為梨支原體單重?zé)晒釶CR退火溫度優(yōu)化結(jié)果圖，其中57°C為最優(yōu)退火溫度。圖4為穿透支原體熒光PCR檢測體系的對數(shù)標準曲線。圖5為發(fā)酵支原體熒光PCR檢測體系 的對數(shù)標準曲線。圖6為梨支原體熒光PCR檢測體系的對數(shù)標準曲線。圖7為本發(fā)明三重?zé)晒舛縋CR檢測方法對三種艾滋病相關(guān)支原體的檢測靈敏度評價結(jié)果圖，其中圖7a為穿透支原體靈敏度結(jié)果，圖7b為發(fā)酵支原體靈敏度結(jié)果，圖7c為梨支原體靈敏度結(jié)果。其中I :108拷貝陽性質(zhì)粒，2 :107拷貝陽性質(zhì)粒，3 :106拷貝陽性質(zhì)粒，4 :105拷貝陽性質(zhì)粒，5 :104拷貝陽性質(zhì)粒，6 :103拷貝陽性質(zhì)粒，7 :102拷貝陽性質(zhì)粒，8 10拷貝陽性質(zhì)粒，9:陰性對照。圖8為普通PCR方法對三種支原體檢測靈敏度結(jié)果，其中圖8a為穿透支原體結(jié)果，圖8b為發(fā)酵支原體結(jié)果，圖8c為梨支原體結(jié)果；其中M Marker, I :陰性對照,2 108拷貝陽性質(zhì)粒，3 :107拷貝陽性質(zhì)粒，4:106拷貝陽性質(zhì)粒，5 :105拷貝陽性質(zhì)粒，6 :104拷貝陽性質(zhì)粒，7 :103拷貝陽性質(zhì)粒，8 :102拷貝陽性質(zhì)粒，9 :10拷貝陽性質(zhì)粒。圖9為本發(fā)明對艾滋病相關(guān)支原體混合感染模擬標本檢測結(jié)果圖，其中圖9a為穿透支原體和發(fā)酵支原體雙重感染檢測結(jié)果，圖9b為穿透支原體和梨支原體雙重感染檢測結(jié)果，圖9c為發(fā)酵支原體和梨支原體雙重感染檢測結(jié)果，圖9d為穿透支原體、發(fā)酵支原體和梨支原體三重混合感染檢測結(jié)果；其中I :穿透支原體，2 :發(fā)酵支原體，3 :梨支原體，4 陰性對照。
具體實施例方式以下實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實施例I三重?zé)晒釶CR引物和探針的設(shè)計通過對NCBI數(shù)據(jù)庫中報道的穿透支原體的ftsZ基因、發(fā)酵支原體的ftsZ基因和梨支原體的rpoB基因中保守區(qū)域使用Beacon Desinger7軟件設(shè)計探針和引物。探針類型均為TaqMan探針，其中穿透支原體探針5’標記熒光基團FAM，3’標記淬滅基團BHQl ;發(fā)酵支原體探針5’標記熒光基團HEX，3’標記淬滅基團BHQl ;梨支原體探針5’標記熒光基團R0X，3’標記淬滅基團BHQ2。檢測穿透支原體的引物序列為Mpen-F:ACGTGAGTTAACCATGTA (SEQ ID NO. I)Mpen-R:GGTTCGTCTTCTATCTAATAG (SEQ ID NO. 2)；檢測發(fā)酵支原體的引物序列為Mfer-F:TGCTGTTTCAATGTCATC (SEQ ID NO. 3)Mfer-R:AGACCGAGCTATTAAAGC (SEQ ID NO. 4)；檢測梨支原體的引物序列為Mpi-F:CGTGATTTCTTTAATACTCATC (SEQ ID NO. 5)
Mpi-R:CACGAATATCCAAGTTAGG (SEQ ID NO. 6)。本發(fā)明提供了與上述引物組合配合使用的熒光探針組合，其中與穿透支原體的引物配合使用的探針核苷酸序列為Mpen-P:FAM-TTACCAGCACCACCAATACCAATAAT-BHQ1 (SEQ ID NO. 7)與發(fā)酵支原體的引物配合使用的探針核苷酸序列為Mfer-P:HEX-TTGGATGATGCTTTAATGACTCCACTTT-BHQI (SEQ ID NO. 8)與穿透支原體的引物配合使用的探針核苷酸序列為Mpi-P:R0X-CCAGGTCCCATTGCTGAAATTCT-BHQ2 (SEQ ID NO. 9)。
··
實施例2三重?zé)晒舛縋CR退火溫度的優(yōu)化本發(fā)明分別對穿透支原體(Mycoplasma penetrans) ATCC55252、發(fā)酵支原體(Mycoplasma fermentans) ATCC19989 和梨支原體(Mycoplasma pirum) ATCC25960 進行單重?zé)晒釶CR檢測(圖I 3)，并改變退火溫度，選擇最優(yōu)化的多重體系退火溫度。檢測發(fā)現(xiàn)，穿透支原體和發(fā)酵支原體最優(yōu)反應(yīng)退火溫度為59°C，梨支原體的最優(yōu)退火溫度為57°C，在此溫度下體系擴增效果最好。綜合考慮上述因素將三重?zé)晒舛縋CR體系檢測的退火溫度范圍設(shè)定為57°C 60°C。實施例3三重?zé)晒舛縋CR擴增體系和擴增條件實時熒光定量PCR擴增體系為
Mfer-F25f..iM 0.8ul
Mfer-R25^.iM 0.8ul
Mfer-P ( HEX )25^.iM 0.4ul
Mpen-F25f..iM 0.5ul
Mpen-R25{iiVl 0.5ul
Mpen-P ( FAM )25{iiV! 0.2u.I
Mpi-F25{.lM 0.3ul
Mpi-R25{.lM 0.3u.I
Mpi-P ( ROX )25)iiM 0.1^1
Platium quantitative PCR super , 7 ^ ,
Mix UDG41
MgCl250mM 2.0[,il
權(quán)利要求
1.一種用于同時檢測艾滋病相關(guān)支原體的三重?zé)晒釶CR引物組合，所述艾滋病相關(guān)支原體為穿透支原體(Mycoplasma penetrans)、發(fā)酵支原體(Mycoplasma fermentans)和梨支原體(Mycoplasma pirum)。
2.如權(quán)利要求I所述的引物組合，其中檢測穿透支原體的引物序列為Mpen-F:ACGTGAGTTAACCATGTAMpen-R:GGTTCGTCTTCTATCTAATAG ； 檢測發(fā)酵支原體的引物序列為Mfer-F:TGCTGTTTCAATGTCATCMfer-R:AGACCGAGCTATTAAAGC ； 檢測梨支原體的引物序列為Mpi-F:CGTGATTTCTTTAATACTCATCMpi-R:CACGAATATCCAAGTTAGG。
3.與權(quán)利要求2所述引物組合配合使用的熒光探針組合，其特征在于，與穿透支原體的引物配合使用的探針核苷酸序列為Mpen-P:FAM-TTACCAGCACCACCAATACCAATAAT-BHQ1與發(fā)酵支原體的引物配合使用的探針核苷酸序列為Mfer-P:HEX-TTGATGATGCTTTAATGACTCCACTTT-BHQ1與穿透支原體的引物配合使用的探針核苷酸序列為Mpi-P:R0X-CCAGGTCCCATTGCTGAAATTCT-BHQ2。
4.權(quán)利要求2所述的引物組合和權(quán)利要求3所述的熒光探針組合在制備艾滋病相關(guān)支原體的檢測試劑盒或診斷試劑中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于,將Platiumquantitative PCR super MixUDG12. 5u l,50mM MgCl22. 0 u I ；Platium TaqO. 25 u I ；dNTP 混合溶液 l.Oul ；Mfer-F 和Mfer-R 各 0. 8 y I ；Mfer-P0. 4 u I ;Mpen_F 和 Mpen-R 各 0. 5 y I ；Mpen-P0. 2 u I ;Mpi_F 和Mpi-F各0.3 ill ；Mpi-P0. lul，無核酸酶水0. 35 u I ;待測樣品DNA模板5. 0 構(gòu)成25 yl的檢測反應(yīng)體系；上述引物和探針濃度均為25 PM。
6.如權(quán)利要求4或5所述的應(yīng)用，其特征在于，試劑盒工作條件為95°C3min，I個循環(huán)；950C 15s，57°C -60°C 15s, 40個循環(huán)；然后終止反應(yīng)。
7.一種艾滋病相關(guān)支原體的診斷試劑，其特征在于，含有權(quán)利要求2所述的引物組合和權(quán)利要求3所述的突光探針組合；所述艾滋病相關(guān)支原體為穿透支原體(Mycoplasmapenetrans)、發(fā)酵支原體(Mycoplasma fermentans)和梨支原體(Mycoplasma pirum)。
8.一種艾滋病相關(guān)支原體的檢測試劑盒，其特征在于，含有權(quán)利要求2所述的引物組合和權(quán)利要求3所述的突光探針組合；所述艾滋病相關(guān)支原體為穿透支原體(Mycoplasmapenetrans)、發(fā)酵支原體(Mycoplasma fermentans)和梨支原體(Mycoplasma pirum)。
9.如權(quán)利要求8所述的檢測試劑盒，其特征在于，其25Ul的檢測反應(yīng)體系的具體配置為Platium quantitative PCR super Mix UDG12. 5 u I, 50mM MgCl22. Oul ；PlatiumTaqO. 25 u I ；dNTP 混合溶液 I. 0 yl ;Mfer_F 和 Mfer-R 各 0. 8 y I ；Mfer-P0. 4 u I ;Mpen_F和 Mpen-R 各 0. 5 y I ；Mpen-P0. 2 u I ;Mpi_F 和 Mpi-F 各 0. 3 y I ；Mpi-P0. I yl，無核酸水.0.35 u I ;待測樣品DNA模板5. 0 ill ;上述引物和探針濃度均為25 u M。
10.如權(quán)利要求8或9所述的檢測試劑盒，其特征在于，其工作條件為95°C 3min，I個循環(huán)；95°C 15s，57°C -60°C 15s,40 個循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明通過對艾滋病相關(guān)支原體(穿透支原體、發(fā)酵支原體和梨支原體)基因序列分析和比對，提供了適于同時檢測這3種艾滋病相關(guān)支原體的三重?zé)晒釶CR檢測的引物和探針，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1-9所示，本發(fā)明還提供了對艾滋病相關(guān)支原體進行檢測的方法和檢測試劑盒。本發(fā)明的檢測試劑盒及檢測試劑具有檢測準確，靈敏度高、特異性強，簡便快速的優(yōu)點，具有良好的檢測能力。
文檔編號C12N15/11GK102787165SQ20121024508
公開日2012年11月21日 申請日期2012年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月13日
發(fā)明者何利華, 孟凡亮, 張建中, 張慧芳, 王艷冬, 肖迪, 趙飛 申請人:中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所