專利名稱：一種轉基因香石竹Moonshade的品系特異性定性、定量PCR檢測方法
技術領域：
本發明屬于轉基因植物檢測技術領域，具體涉及一種轉基因香石竹Moonshade的品系特異性定性、定量PCR檢測方法。
背景技術：
隨著轉基因植物產業化水平不斷提高，其安全問題已經引起國際社會和各國政府的廣泛關注，并成為國家之間環境保護、國際貿易等合作的敏感議題，致使轉基因產品的安全性問題由學術觀點分歧，發展到環境問題、經濟問題甚至政治問題。為了加強對轉基因植 物的管理，世界各國紛紛制定了相應的法律法規。其中，轉基因產品標識制度已成為國際公約。澳大利亞和新西蘭從2001年7月開始對所有轉基因食物實施標識制度，閾值為每種成分的1%，即當某一種成分內的轉基因成分超過1%，則必須標識為轉基因食物。巴西、以色列等國也把轉基因成分閾值定為1%。韓國和日本分別為3%和5%。建立健全轉基因產品標識制度，轉基因產品的檢測技術是關鍵。目前世界上常用的轉基因檢測方法主要有兩種一種是基于核酸的檢測方法，一種是基于蛋白質的免疫學檢測方法。在轉基因植物及其加工產品的檢測過程中，以DNA檢測為基礎的核酸檢測方法已經成為最主要、最適用的轉基因植物及其加工產品的檢測方法。基于DNA分子為基礎的轉基因產品檢測方法經歷了四個發展階段，即(I)針對啟動子、終止子、標記基因的篩選檢測；(2)目的基因特異性檢測；(3)基因構建特異性檢測；(4)品系特異性(轉化事件)檢測。由于品系特異性檢測方法具有高度特異性，目前國際上對于轉基因產品檢測方法已逐步過渡到品系特異性基因片段的檢測方法。品系特異性檢測是通過分析外源插入載體與植物基因組的連接區序列實現的。由于每一個轉基因植物品系，都具有特異的外源插入載體與植物基因組的連接區序列，并且連接區序列是單拷貝的，所以品系特異性檢測方法具有非常高的特異性和準確性。基于上述優點，品系特異性檢測已經成為目前轉基因檢測研究的重點，并將為國際檢測標準和國際各檢測實驗室所采用。香石竹(Dianthus caryophyllus L.)又名康乃馨，為石竹科石竹屬多年生草本植物，是當代世界最主要的切花品種之一，其生產面積和銷售量居切花品種之首。澳大利亞Florigene公司和日本Suntory公司從雜交矮牽牛中克隆到二氫黃酮醇_4_還原酶基因(Dihydroflavonol-4-Reductase，DFR)和類黃酮-3 ' ,5'-羥基化酶基因(Flavonoid-3 ' , 5 ' -Hydroxylase, F3’ 5’ H),構建載體 pCGP1470 并通過農桿菌介導轉化花色為白色的香石竹品種，經篩選獲得了花色呈藍紫色的轉基因香石竹。月之霓裳(Moonshade)是其中I個主要品系。轉基因香石竹是在我國進行環境安全評價試驗的第一例觀賞植物，在轉基因植物環境安全研究領域具有重要意義。所以研究開發靈敏度高、特異性強的轉基因香石竹品系特異性檢測方法和標準，已成為一項重要而緊迫的任務。
發明內容
本發明所要解決的技術問題在于提供一種轉基因花色香石竹Moonshade的品系特異性定性、定量PCR檢測方法。本發明利用LM-PCR技術分離、測序分析得到了外源基因插入位點的左邊界旁鄰序列，并設計了一系列特異性引物和探針序列，建立了適用于轉基因香石竹Moonshade的品系特異性定性、定量PCR檢測方法，并驗證了該檢測方法的特異性和靈敏度。本發明的原理為根據已知的外源插入載體，設計2條同向且退火溫度較高的特異性引物 MP1/MP2 與試劑盒 “LA_PCR in vitro Cloning” (TaKaRa BiotechnologyCo.，Ltd. Japan)提供的引物C1/C2結合，進行LM-PCR反應，得到外源基因插入香石竹基因組DNA位點的旁鄰序列。據此設計特異性引物和探針，并優化PCR擴增條件，建立標準曲線，確定檢測的靈敏度，同時對混合樣品進行分析檢測，建立適合于轉基因香石竹Moonshade的品系特異性定性、定量PCR檢測方法。為了達到上述目的，本發明的技術方案如下 利用 Primer Express software version3. 0(Applied Biosystems, FosterCity, CA)設計特異性引物和熒光探針。特異性引物和探針的序列、擴增片段長度參見表I。引物和探針由上海英駿公司(Invitrogen Co. , Ltd, Shanghai )合成。其中，采用ans基因作為香石竹的內標準基因。特異性引物MP1/MP2和試劑盒引物C1/C2用于LM-PCR擴增。shadeClF/shadeClR用于品系特異性定性PCR擴增。shadeRlF/shadeRIR和探針shade-Probe用于品系特異性定量PCR擴增。ANS-F1/ANS-R1用于內標準基因ans定性PCR擴增。ANS-F2/ANS-R2和ANS-Probe用于內標準基因ans定量PCR擴增。GenomeClF/GenomeClR用于香石竹基因組DNA定性PCR擴增。表I. PCR體系所用的特異性引物和探針
權利要求
1.一種轉基因香石竹Moonshade的品系特異性定性、定量PCR檢測方法，包括以下步驟 1)轉基因香石竹Moonshade基因組DNA的提取； 2)轉基因香石竹Moonshade外源基因插入位點的左邊界旁鄰序列的分離和確認利用LM-PCR方法分離得到包括如SEQ ID Nol所示的194bp未知序列和130bp的外源插入載體序列；根據該未知序列設計引物GenomeClF/GenomeClR進行PCR擴增,PCR擴增結果證明如SEQ ID Nol所示的序列為香石竹基因組序列，即轉基因香石竹Moonshade外源基因插入位點的左邊界旁鄰序列如SEQ ID Nol所示； 3)轉基因香石竹Moonshade的定性PCR檢測采用Moonshade品系特異性定性引物對shadeClF/shadeClR 進行定性 PCR 擴增； 4)轉基因香石竹Moonshade的定量PCR檢測由轉基因香石竹Moonshade基因組DNA作為標準品，采用Moonshade品系特異性定量引物對shadeRlF/shadeRIR和探針shade-Probe進行定量PCR擴增，同時，采用內標準基因ans特異性定量引物對ANS-F2/ANS-R2序列和探針ANS-Probe進行內標準基因定量PCR，并建立品系特異性定量標準曲線和內標準基因ans的定量標準曲線；再利用相對定量法對樣品進行定量檢測； 其中，引物GenomeClF/GenomeClR，其序列分別如SEQ ID No2和SEQ ID No3所示；引物對 shadeClF/shadeClR序列分別如 SEQ ID No4 和 SEQ ID No5 所示；定量引物對 shadeRlF/shadeRIR 和探針 shade-Probe 序列分別如 SEQ ID No6、SEQ ID No7 和 SEQ ID No8 所示；內標準基因ans特異性定量引物對ANS-F2/ANS-R2序列和探針ANS-Probe序列如SEQ IDNo9、SEQ ID NolO 和 SEQ ID Noll 所示。
2.根據權利要求I所述的品系特異性定性、定量PCR檢測方法，其特征在于，所述LM-PCR方法的擴增反應體系為第I輪擴增反應總體積30iiL，3iiLlXPCR緩沖液，3u L2mM dNTPs，I y LlO y M引物Cl，I y LlO y M引物MP1，0. 3 y L5U LA-Taq DNA聚合酶，2 y LMoonshade DNA, 19. 7 u L 雙蒸水；第2 輪反應:總體積 30 u L,3u L I XPCR 緩沖液，3 u L 2mMdNTPs, I u L 10iiM$*MP2，liiL10iiM$*C2，0.3iiL5U Taq DNA 聚合酶，19. 7 y L 雙蒸7faP2iiL(25ng/iiL)第一輪PCR產物;其中，引物Cl的序列如SEQ ID Nol2所示，引物MPl的序列如SEQ ID Nol3所示，引物C2的序列如SEQ ID Nol4所示，引物MP2的序列如SEQID Nol5 所示。
3.根據權利要求I所述的品系特異性定性、定量PCR檢測方法，其特征在于，所述定性PCR檢測的反應體系為總體積25 ii L，5 ii L Moonshade DNA, 2. 5 u LlX PCR緩沖液，2. 5 ii L2mM dNTPs, 12. 7u L 雙蒸水，IOuM 定性引物對 shadeClF/shadeClR 各 I y L 和0. 3 u L5U Taq DNA 聚合酶；反應程序94°C,5min ；94°C, 30s, 58°C, 30s, 72°C, 30s, 35 個循環；72°C，7min。
4.根據權利要求I所述的品系特異性定性、定量PCR檢測方法，其特征在于，所述定量PCR檢測的反應體系為總體積25u L,2. 5u LI XPCR緩沖液，2. 5 u L2mM dNTPs, 5 u L25mMMgCl2, IOuM 定量引物對 shadeRlF/shadeRIR # 0. 5 u L, I. 0 u LlO u M 探針 shade-Probe,0. 25 u L5U Taq DNA 聚合酶，5 y L DNA 和 7. 75 y L 雙蒸水；反應程序50°C，2min ;95°C，IOmin ；95°C，30s, 60°C，45s，72°C，45S，45個循環，在60°C，45s的退火階段收集熒光信號。
5.根據權利要求I所述的品系特異性定性、定量PCR檢測方法，其特征在于，所述內標準基因定量PCR的反應條件為反應體系總體積25 ii L，2. 5 ii LI XPCR緩沖液，2. 5 u L2mMdNTPs，5iiL25mM MgCl2，10iiM 弓 I 物對 ANS-F2/ANS-R2 各 0. 5 y L，0. 5 y LlO y M 探針ANS-Probe, 0. 3 u L5U Taq DNA 聚合酶，5 y L DNA和 8. 2 y L雙蒸水；反應程序50°C，2min ;.95°C，IOmin ；95°C，30s, 60°C，45s，72 V，45S，45 個循環，在 60°C，45s 的退火階段收集熒光信號。
全文摘要
本發明公開了一種轉基因香石竹Moonshade的品系特異性定性、定量PCR檢測方法，包括以下步驟1)轉基因香石竹Moonshade基因組DNA的提取；2)轉基因香石竹Moonshade外源基因插入位點的左邊界旁鄰序列的分離和確認；3)轉基因香石竹Moonshade定性PCR檢測；4)轉基因香石竹Moonshade定量PCR檢測。本發明建立了適用于轉基因香石竹Moonshade的品系特異性定性、定量PCR檢測方法，并驗證了該檢測方法的特異性和靈敏度，為轉基因香石竹的進口檢測、監管及環境安全評價提供重要依據。
文檔編號C12Q1/68GK102719552SQ20121024481
公開日2012年10月10日 申請日期2012年7月16日 優先權日2012年7月16日
發明者唐雪明, 李鵬, 潘愛虎, 白藍, 賈軍偉 申請人:上海市農業科學院