一種H₂O₂誘導的NIH-3T3細胞衰老模型的制作方法

專利名稱：一種H₂O₂誘導的NIH-3T3細胞衰老模型的制作方法
技術領域：
本發明屬于研究抗衰老研究領域如何獲得一種簡單、快速的生物模型，以此來檢驗抗衰老藥物的療效。
背景技術：
隨著社會的發展，人類壽命普遍延長，高齡老人明顯增多，人口老齡化問題日益嚴重，已經成為當今世界普遍關注的焦點。因此如何檢測抗衰老藥物的療效，是一個迫切需要解決的現實問題
發明內容

本發明所要解決的技術問題是獲得一種簡單、快速的生物模型，以此來檢驗抗衰老藥物的療效。為解決以上問題，本發明采取如下的技術方案
將NIH-3T3細胞接種在含10%胎牛血清的MEM，在溫度37°C、飽和濕度的培養箱中培養；從20代開始，細胞隨機分3組后細胞培養，3-4天換液I次，細胞達到融合時，用0. 025%胰酶后1:4傳代，細胞至30代時隨機收獲部分細胞；將H2O2用DMEM完全培養液按不同濃度梯度稀釋后，加入細胞中，形成0，300，600，1000，1500，2000 u M濃度梯度，培養2小時后，棄去。用PBS或DMEM洗三遍，加入DMEM完全培養液繼續培養；在連續培養到第十天，用胰酶消化6孔板中細胞，取其中5000個細胞接種到24孔板中培養24小時，用細胞衰老P -半乳糖苷酶染色試劑盒染色細胞，在高倍顯微鏡下觀察，染上藍色的細胞即是衰老細胞。小鼠胚胎成纖維細胞(NIH-3T3 )細胞株是目前國際上公認于體外研究細胞復制衰老的模型。復制衰老是指體外連續培養的細胞在完成有限次數的細胞分裂后，喪失合成DNA及分裂的能力，最后導致細胞不能進行增殖，但仍能維持細胞的基本代謝程的一種現象。本發明采取過氧化氫通過氧化應激的方法來誘導細胞衰老，建立NIH-3T3細胞衰老模型。與已有的報道相比，本發明具有簡單、快速、試劑成本低廉的有益特點。。
具體實施方式
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實施例I、材料與方法
1.1空白血清制備取清潔級SD大鼠(240g左右)10只，麻醉腹主動脈采血，4°C過夜,3000轉/ min離心10分鐘,小心分離血清,于56°C下30 min滅活,經0. 22 y m濾膜濾過除菌，_20°C保存。I. 2細胞培養及分組NIH-3T3細胞(胚胎成纖維細胞)由美國ATCC細胞庫提供。細胞接種在含10%胎牛血清(美國Invitrogen公司)的MEM (美國Invitrogen)培養,在溫度37°C、飽和濕度的培養箱中培養。從20代開始，細胞隨機分成3組年輕組(20代細胞)、空白對照組(空白血清+ H2O2處理)、模型組(H2O2處理)。然后細胞培養，3-4天換液I次，細胞達到融合時，用0. 025%胰酶后1:4傳代，細胞至30代時隨機收獲部分細胞作各項實驗。1.3 H2O2刺激細胞將H2O2用DMEM完全培養液按不同濃度梯度稀釋后，加入細胞中，形成0,300,600,1000,1500，2000 u M濃度梯度，培養2小時后，棄去。用PBS或DMEM洗三遍，加入DMEM完全培養液繼續培養。I. 4在連續培養到第十天，用胰酶消化6孔板中細胞，取其中5000個細胞接種到24孔板中培養24小時，用碧云天公司的細胞衰老P -半乳糖苷酶染色試劑盒染色細胞。
I. 5在高倍顯微鏡下觀察染色細胞，染上藍色的細胞即是衰老細胞。I. 6計數數出400個細胞及其中含有的衰老細胞，即可得出該H2O2濃度作用下的細胞衰老比例。2、結果
2.I細胞的形態變化年輕組細胞的細胞體呈梭形或不規則三角形，胞質向外伸出2-3個長短不同的突起，中央有卵圓形核，核仁清晰可見。空白對照組細胞體呈長梭形或不規則三角形，胞質向外伸出2-3個長短不同的突起，細胞體積較年輕組增大，部分細胞胞漿內的顆粒增多。模型組的細胞形態不規則，絕大多數的細胞體積明顯增大，胞體變平，核漿比例縮小，胞漿內的顆粒豐富。2.2 ￠-半乳糖苷酶細胞化學染色P -半乳糖苷酶染色陰性細胞的細胞核復染為紅色，而陽性細胞的胞漿染為青綠色。年輕組￠-半乳糖苷酶染色陽性細胞數的百分比為2. 00± I. 00%，空白對照組￠-半乳糖苷酶染色陽性細胞數的百分比為2. 624±0. 208%,模型組￠-半乳糖苷酶染色陽性細胞數最多，其百分比為75. 00±2. 64%。模型組的￠-半乳糖苷酶染色陽性細胞數比年輕組、空白對照組高(P〈0. 01)。從表5-1可以看出，不同濃度H2O2刺激下，細胞增殖隨濃度遞增而呈梯度抑制。表5-1 NIH-3T3細胞受不同濃度H2O2刺激下細胞增殖情況
濃度 0SOnM 1150 pH I 300 IfiOO p,M IlOOO p,M
g 孔______
^_ I 74 I 39 1.38 0.89 0 66 0 53
I^—L42—— ...................................................ili—m —5:ii............................................................IIi........................................................Esi~
3—2.00 I 41 ~ 1.26 . 0.87 0 61 0 50 兩i....................................................— 172 I 40 1.31 0.88 0.62 0J3~
由此可以看出，用H2O2處理NIH-3T3細胞而制成的細胞衰老模型是成功的。3、討論
小鼠胚胎成纖維細胞(NIH-3T3)是目前國際上公認的用于體外研究細胞復制衰老的模型，體外培養時，在經歷一段快速增殖期和一定次數的群體倍增后，會進入增殖活力下降期，最后成為一個不能對生長因子作出增殖反應的衰老細胞群。過氧化氫是一種氧化劑，它作用后的細胞群與衰老對照組的細胞有相似的形態學改變，細胞體積增大、胞體變平，次級溶酶體增多，同時伴有Gl期細胞比例增加和P -半乳糖苷酶染色陽性細胞百分比增加，提示H2O2能在相對較短的時間內有效地誘導細胞衰老。本實施例研究結果顯示H2O2作用3次后NIH-3T3細胞體積增大、形態不規則，胞體變平，細胞顆粒明顯增加；電鏡下次級溶酶體增多，線粒體腫脹，部分細胞出現異染色質增多；GI期細胞比例增加和￠-半乳糖苷酶染色陽性細胞的百分比增加。由此可見，通過H2O2誘導的細胞氧化應激損傷可以成功地建立體外細胞衰老模型。有研究表明H2O2誘導細胞衰老的機制是通過氧化應激作用使端粒長度加速縮短，從而使端粒長度更快達到一定臨界長度，細胞不可逆地阻滯于Gl期，從而失去增殖活力導致衰老。
4、小結
本實驗用H2O2作用3次后觀察到NIH-3T3細胞體積增大、形態不規則，胞體變平，細胞顆粒明顯增加；￠-半乳糖苷酶染色陽性細胞的百分比增加。因此，用H2O2可以可靠、便捷地建立體外細胞衰老模型。
權利要求
1.一種H2O2誘導的NIH-3T3細胞衰老模型，其制備方法為將NIH-3T3細胞接種在含10%胎牛血清的MEM，在溫度37°C、飽和濕度的培養箱中培養；從20代開始，細胞隨機分3組后細胞培養，3-4天換液I次，細胞達到融合時，用0. 025%胰酶后1:4傳代，細胞至30代時隨機收獲部分細胞；將H2O2用DMEM完全培養液按不同濃度梯度稀釋后，加入細胞中，形成0，300，600，1000，1500，2000 ii M濃度梯度，培養2小時后，棄去；用PBS或DMEM洗三遍，加入DMEM完全培養液繼續培養；在連續培養到第十天，用胰酶消化6孔板中細胞，取其中5000個細胞接種到24孔板中培養24小時，用細胞衰老3 -半乳糖苷酶染色試劑盒染色細胞，在高倍顯微鏡下觀察，染上藍色的細胞即是衰老細胞，得細胞衰老模型。
全文摘要
一種H2O2誘導的NIH-3T3細胞衰老模型。本發明屬于研究獲得簡單、快速的動物模型來檢驗抗衰老藥物的療效。采取如下的技術方案將NIH-3T3細胞接種在含10%胎牛血清的MEM，在溫度37℃、飽和濕度的培養箱中培養；從20代開始，細胞隨機分3組后細胞培養，3-4天換液1次，細胞達到融合時，用0.025%胰酶后1:4傳代，細胞至30代時隨機收獲部分細胞；將H2O2用DMEM完全培養液按不同濃度梯度稀釋后，加入細胞中，形成濃度梯度，培養2小時后，棄去。用PBS或DMEM洗三遍，加入DMEM完全培養液繼續培養；在連續培養到第十天，用胰酶消化6孔板中細胞，取其中5000個細胞接種到24孔板中培養24小時得抗衰老動物模型。
文檔編號C12N5/073GK102747030SQ201210242060
公開日2012年10月24日 申請日期2010年12月24日 優先權日2010年12月24日
發明者黃厚才 申請人:江蘇省中醫藥研究院