專利名稱：一種施羅氏弧菌的環介導等溫擴增檢測引物、檢測試劑盒和檢測方法
技術領域：
本發明屬于微生物檢測領域，具體涉及一種基于環介導等溫擴增(loop-mediatedisothermal ampification,LAMP)技術原理而開發的施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)的環介導等溫擴增檢測引物、檢測試劑盒和檢測方法。
背景技術：
施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)是一種海洋弧菌,能夠侵染珊瑚，引起珊瑚的細菌性白化。目前，施羅氏弧菌的檢測方法主要是傳統的微生物分類鑒定方法及依賴于PCR技術的檢測方法。傳統的微生物分類和鑒定方法主要足以微生物的形態學和生理生化等特性作為判斷依據，雖然結果可信度高，但是繁瑣且費時。聚合酶鏈式反應(PCR)靈敏度高，可達98% 100%，但是特異性較差，而且需要PCR擴增儀、凝膠電泳儀等相關貴重設備，不利于基層實驗站及現場快速檢測。 環介導等溫擴增(loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)技術是Notomi等于2000午報道的一種新型等溫核酸擴增方法，該法針對靶基因的6個區域設計4條特異引物，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)，在恒溫條件(65°C左右)孵育約60min，即可完成核酸擴增反應，產生肉眼可見的反應副產物一白色焦磷酸鎂沉淀。通過逆轉錄酶，還可進行RT-LAMP而完成針對RNA的擴增。該技術具有不需要PCR儀、肉眼可判斷結果及反應時間短等優點。擴增結果也可用結合雙鏈DNA的熒光染料SYBRGreen I染色，在紫外燈或日光下通過肉眼進行判定，如果含有擴增產物，反應混合物變綠；反之，則保持SYBR Green I的橙色不變。目前LAMP技術已有成功用于其他病原體檢測的報道。
發明內容
本發明的目的是提供一種檢測能力強、檢測限高、檢測時間短、特異性高、對儀器設備要求簡單的施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)的環介導等溫擴增(LAMP)檢測引物、檢測試劑盒和檢測方法。本發明利用環介導等溫擴增技術，以施羅氏弧菌的toxR基因(Genebank登錄號為EU727208. I)為靶基因設計特異性引物，進行環介導等溫擴增反應，并優化反應條件，在環介導等溫擴增檢測過程中加入陽性對照質控品和陰性對照質控品，最后通過電泳分析或SYBR Green I熒光染色顯色法檢測陽性對照質控品的擴增產物、陰性對照質控品的擴增產物和目標樣品組的擴增產物，從而判斷目標樣品是否含有施羅氏弧菌，達到簡單、經濟、快捷和靈敏的效果，從而實現了本發明的目的。本發明的施羅氏弧菌的環介導等溫擴增檢測引物，其特征在于，所述的檢測引物如下所示前外引物F3 :5、-CAAACGGTTGGCGGTGTC-3,；(如 SEQ ID NO. I 所示)
后外引物B3 :5、-CCGCAAGATGCTGAAGGATC-3、；(如 SEQ ID NO. 2 所示)前內引物FIP:5、-CTGCAAGAGCCAAACTCTGCGTCTTITGGAGCTGGTGGGAT-3、；(如SEQ IDNO. 3所示)后內引物BIP :5、-GCTTCTGATGAAGCGACAGGCAGTAAAGACGGTGCCTAAGCG-3、；(如 SEQID NO. 4 所示)。本發明的施羅氏弧菌的環介導等溫擴增檢測試劑盒，包括環介導等溫擴增反應液、BstDNA聚合酶、陽性對照質控品、陰性對照質控品和檢測引物，其特征在于，所述的檢測引物包括前外引物F3 :5、-CAAACGGTTGGCGGTGTC-3,；(如 SEQ ID NO. I 所示)后外引物B3 :5、-CCGCAAGATGCTGAAGGATC-3、；(如 SEQ ID NO. 2 所示)前內引物FIP:5、-CTGCAAGAGCCAAACTCTGCGTCTTITGGAGCTGGTGGGAT-3、；(如SEQ IDNO. 3所示)后內引物BIP :5、-GCTTCTGATGAAGCGACAGGCAGTAAAGACGGTGCCTAAGCG-3、；(如 SEQIDN0. 4 所示)。所述的陽性對照質控品優選為含有施羅氏弧菌的toxR基因(Genebank登錄號為EU727208. I)的質粒DNA，可以通過人工的方法構建，如PCR的方法從施羅氏弧菌的基因組DNA擴增得到toxR基因。所述的陰性對照質控品為不同于施羅氏弧菌的toxR基因(Genebank登錄號為EU727208. I)的DNA序列即可。本發明的陽性對照質控品和陰性對照質控品是衡量實驗檢測結果是否有效的重要標志。在每批實驗中，必須引入一個Vibrio shilonii的陽性對照質控品的檢測，以保證反應體系不會出現假陰性反應；同樣的，在每批實驗中，必須引入一個陰性對照質控品的檢測，以保證反應體系不會出現假陽性結果。本發明的非診斷目的的施羅氏弧菌的環介導等溫擴增檢測方法，其特征在于，包括以下步驟(I)對樣品進行增菌培養，提取增菌液中菌體的基因組DNA作為模板；(2)使用上述施羅氏弧菌的環介導等溫擴增檢測引物，與環介導等溫擴增反應液、BstDNA聚合酶和樣品菌體的基因組DNA混合形成擴增反應體系，進行環介導等溫擴增反應，以陽性對照質控品和陰性對照質控品分別作為陽性對照和陰性對照；(3)擴增反應完成后，通過與陽性對照和陰性對照進行對比，判斷樣品擴增反應體系中是否擴增得到擴增產物，來判斷樣品中是否含有施羅氏弧菌。所述的通過與陽性對照和陰性對照進行對比，判斷樣品擴增反應體系中是否擴增得到擴增產物，來判斷樣品中是否含有施羅氏弧菌具體優選為通過電泳分析或SYBR GreenI熒光染色顯色法同時檢測陽性對照、陰性對照和樣品擴增反應體系的擴增產物，根據是否有梯狀電泳條帶或反應體系的顏色來判斷樣品中是否有施羅氏弧菌。
SYBR Green I染色若反應混合物變綠，說明含有擴增產物，樣品中含有施羅氏弧菌(Vibrio shilonii);反之,反應混合物保持SYBR Green I的橙色不變,則樣品中不含有施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)。瓊脂糖凝膠電泳檢測若樣品擴增反應體系的擴增產物的電泳條帶呈現特異性的梯狀條帶，說明反應混合物中含有目的產物，樣品中含有施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)；若無梯狀條帶產生，說明樣品中不含有施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)。所述步驟(2)的擴增反應體系優選為8mmol/LMgS04>I. Ommol/L dNTPs、0. 8mol/Lbetaine (甜菜堿)、1. 2 u mol/L 前內引物 FIP、L 2 u mol/L 后內引物 BIP、0. 2 u mol/L 前外引物 F3、0. 2iimol/L 后外引物 B3、4X104U/L Bst DNA 聚合酶、I XThermoPol buffer、適量的模板DNA和水。所述步驟(2)的進行環介導等溫擴增反應，其反應參數優選為65°C溫育I小時，然后80°C滅活lOmin，最后10°C保存。所述的陽性對照質控品優選為含有施羅氏弧菌的toxR基因(Genebank登錄號為EU727208. I)的質粒DNA，可以通過人工的方法構建，如PCR的方法從施羅氏弧菌的基因組DNA擴增得到toxR基因。所述的陰性對照質控品為不同于施羅氏弧菌的toxR基因(Genebank登錄號為 EU727208. I)的DNA序列即可。本發明一方面是填補在施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)環介導等溫擴增(LAMP)檢測技術方面的空白，使施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)檢測技術達到國際先進水平，檢測能力大幅提高，施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)的環介導等溫擴增(LAMP)檢測方法的檢測限高于傳統檢測方法100 200倍；另一方面本發明的施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)的環介導等溫擴增(LAMP)檢測方法具有儀器設備要求簡單(只需要簡單結構的恒溫箱)、檢測時間短(0. 5^1. 0小時)、特異性高(針對靶基因的8/6個區域設計6/4種特異引物)等特點，彌補了經典聚合酶鏈式反應(PCR)擴增技術對儀器設備要求高(如PCR擴增儀、瓊脂凝膠電泳系統等)、技術較為復雜等諸多弊端，具有檢測能力強、檢測時間短、對儀器設備要求簡單的優點，具有廣闊的應用前景。
圖I是實施例3中的樣品、陽性對照質控品和陰性對照質控品的環介導等溫擴增反應后的擴增產物的電泳圖，其中M marker ;1、2為陽性對照；3、4為陰性對照；5為樣品；圖2是實施例3中的樣品、陽性對照質控品和陰性對照質控品的環介導等溫擴增反應后的擴增產物經熒光染色后的結果圖，其中1、2、3為陽性對照的三個重復，4、5是樣品的兩個重復，6、7、8為陰性對照的三個重復。
具體實施例方式以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。實施例I :引物的設計和合成按照環介導等溫擴增引物的設計原則，利用Genebank數據庫查找施羅氏弧菌中適用環介導等溫擴增的基因序列，選定toxR基因(Genebank登錄號為EU727208. I)為靶基因，針對施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)的toxR基因設計環介導等溫擴增引物。按照LAMP引物設計原則，利用Genebank數據庫查找Vibrio shilonii的LAMP基因序列,選取其特異性序列，利用PrimerExplorer IV軟件進行進一步分析,針對施羅氏弧菌的祀基因設計一套引物。
由此設計的施羅氏弧菌的環介導等溫擴增檢測引物為前外引物F3 :5、-CAAACGGTTGGCGGTGTC-3、；后外引物B3 :5、-CCGCAAGATGCTGAAGGATC-3、；前內引物 FIP : 5、-CTGCAAGAGCCAAACTCTGCGTCTTTTGGAGCTGGTGGGAT-3、；后內引物BIP :5、-GCTTCTGATGAAGCGACAGGCAGTAAAGACGGTGCCTAAGCG-3、。實施例2:核酸提取從37°C搖床培養10小時的施羅氏弧菌菌懸液中吸取菌液lmL，12000r/min離心5min,去上清,在沉淀中加入100 u L無菌水,混勻后，于100°C水浴IOmin,再冰浴2min,12000r/min離心5min，上清液即為施羅氏弧菌基因組DNA，將其作為DNA模板用于環介導等溫擴增反應。實施例3 :環介導等溫擴增反應樣品的環介導等溫擴增反應體系，反應體系25 ii L，包括實施例2的DNA模板2 u L, I XThermoPol緩沖液(反應體系終濃度),8mmol/L MgSO4(反應體系終濃度)，I. Ommol/LdNTPs(反應體系終濃度)，0. 8mol/L betaine(反應體系終濃度)，I. 2u mol/L前內引物FIP(反應體系終濃度)，I. 2 u mol/L后內引物BIP (反應體系終濃度)，0. 2 u mol/L前外引物F3(反應體系終濃度)，0. 2 u mol/L后外引物B3 (反應體系終濃度)，IUBstDNA聚合酶，用滅菌去尚子水補齊至25 u L0陽性對照質控品的環介導等溫擴增反應體系，反應體系25 UL，包括人工構建的含有施羅氏弧菌toxR基因的質粒DNA2ii L，I X ThermoPol緩沖液(反應體系終濃度)，8mmoI/LMgSO4 (反應體系終濃度)，I. Ommol/L dNTPs (反應體系終濃度),0. 8mol/L betaine(反應體系終濃度)，I. 2 u mol/L前內引物FIP (反應體系終濃度)，I. 2 u mol/L后內引物BIP(反應體系終濃度)，0. 2 ii mol/L前外引物F3 (反應體系終濃度),0. 2 y mol/L后外引物B3(反應體系終濃度)，IU Bst DNA聚合酶，用滅菌去離子水補齊至25 iiL。所述的人工構建的含有施羅氏弧菌toxR基因的質粒DNA的制備方法為以pUC19質粒作為載體，根據Genebank中的基因序列人工合成toxR基因片度作為目的DNA片段，以E. coliDH5a作為感受態細胞。將pUC19質粒以Hind III酶切后，與目的DNA片段在T4連接酶的催化下連接，轉化E. coli DH5a感受態細胞，經氨芐青霉素平板篩選出陽性克隆，以堿裂解法提取重組質粒,經酶切電泳和PCR電泳檢測質粒構建的正確性。陰性對照質控品的環介導等溫擴增反應體系，反應體系25y L，包括陰性對照質控品(以大腸桿菌(E. coli)基因組DNA作為陰性對照質控品)2 u L，IXThermoPol緩沖液(反應體系終濃度)，8mmol/L MgSO4 (反應體系終濃度)，I. Ommol/L dNTPs (反應體系終濃度)，0. 8mol/Lbetaine (反應體系終濃度)，I. 2u mol/L前內引物FIP (反應體系終濃度)，
I.2 ii mol/L后內引物BIP (反應體系終濃度)，0. 2iimol/L前外引物F3 (反應體系終濃度)，0. 2 u mol/L后外引物B3 (反應體系終濃度)，IUBstDNA聚合酶，用滅菌去離子水補齊至25 u L0分別將上述三種環介導等溫擴增反應體系混合均勻后，放入恒溫水浴箱，設定反應條件65°C,60min ;80°C，lOmin，終止反應;10°C保存。環介導等溫擴增反應完成后取5 ii L上述三種擴增反應體系的擴增產物，于2%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，如圖I所示，電泳分析檢測結果顯示樣品的環介導等溫擴增反應體系和陽性對照質控品的環介導等溫擴增反應體系的電泳條帶呈現特異性的梯狀條帶，而陰性對照質控品的環介導等溫擴增反應體系無特異性的條帶，說明樣品的DNA模板含有施羅氏弧菌的特異性toxR基因，則說明樣品中含有施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)。分別取I ii L SYBR Green I熒光染料，與反應完成后的上述三種擴增體系混勻，觀察反應體系是否顏色發生變化。如圖2所示，SYBR Green I熒光染色顯色法檢測結果顯示樣品的環介導等溫擴增反應體系和陽性對照質控品的環介導等溫擴增反應體系變成綠色，而陰性對照質控品的環介導等溫擴增反應體系仍為橙色，說明樣品的DNA模板含有施羅氏弧菌的特異性toxR基因，則說明樣品中含有施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)。綜上所述，利用本發明的檢測引物及檢測方法，可以簡單、經濟、快捷、靈敏地檢測 出施羅氏弧菌，且檢測結果準確可靠。
權利要求
1.一種施羅氏弧菌的環介導等溫擴增檢測引物，其特征在于，所述的檢測引物如下所示 前外引物 F3 :5、-CAAACGGITGGCGGTGTC-3、； 后外引物 B3 :5、-CCGCAAGATGCTGAAGGATC-3、；前內引物 FIP 5, -CTGCAAGAGCCAAACTCTGCGTCTTTTGGAGCTGGTGGGAT-3,；后內引物 BIP :5、-GCTTCTGATGAAGCGACAGGCAGTAAAGACGGTGCCTAAGCG-3、。
2.一種施羅氏弧菌的環介導等溫擴增檢測試劑盒，包括環介導等溫擴增反應液、BstDNA聚合酶、陽性對照質控品、陰性對照質控品和檢測引物，其特征在于，所述的檢測引物包括 前外引物 F3 :5、-CAAACGGITGGCGGTGTC-3、； 后外引物 B3 :5、-CCGCAAGATGCTGAAGGATC-3、；前內引物 FIP 5, -CTGCAAGAGCCAAACTCTGCGTCTTTTGGAGCTGGTGGGAT-3,；后內引物 BIP :5、-GCTTCTGATGAAGCGACAGGCAGTAAAGACGGTGCCTAAGCG-3、。
3.根據權利要求2所述的施羅氏弧菌的環介導等溫擴增檢測試劑盒，其特征在于，所述的陽性對照質控品為含有施羅氏弧菌的toxR基因的質粒DNA。
4.根據權利要求2所述的施羅氏弧菌的環介導等溫擴增檢測試劑盒，其特征在于，所述的陰性對照質控品為不同于施羅氏弧菌的toxR基因的DNA序列。
5.一種非診斷目的的施羅氏弧菌的環介導等溫擴增檢測方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)對樣品進行增菌培養，提取增菌液中菌體的基因組DNA作為模板； (2)使用權利要求I所述的施羅氏弧菌的環介導等溫擴增檢測引物，與環介導等溫擴增反應液、Bst DNA聚合酶和樣品菌體的基因組DNA混合形成擴增反應體系，進行環介導等溫擴增反應，以陽性對照質控品和陰性對照質控品分別作為陽性對照和陰性對照； (3)擴增反應完成后，通過與陽性對照和陰性對照進行對比，判斷樣品擴增反應體系中是否擴增得到擴增產物，來判斷樣品中是否含有施羅氏弧菌。
6.根據權利要求5所述的非診斷目的的施羅氏弧菌的環介導等溫擴增檢測方法，其特征在于，通過與陽性對照和陰性對照進行對比，判斷樣品擴增反應體系中是否擴增得到擴增產物，來判斷樣品中是否含有施羅氏弧菌具體為通過電泳分析或SYBR Green I熒光染色顯色法同時檢測陽性對照、陰性對照和樣品擴增反應體系的擴增產物，根據是否有梯狀電泳條帶或反應體系的顏色來判斷樣品中是否有施羅氏弧菌。
7.根據權利要求5所述的非診斷目的的施羅氏弧菌的環介導等溫擴增檢測方法，其特征在于，所述步驟(2)的擴增反應體系為8mmol/L MgSO4、I. OmmoI/L dNTPs、0. 8mol/Lbetaine、I. 2 u mol/L 前內引物 FIP、I. 2u mol/L 后內引物 BIP、0. 2 u mol/L 前外引物 F3、0. 2iimol/L后外引物B3、4X104U/LBst DNA聚合酶、I X ThermoPol buffer、適量的模板DNA和水。
8.根據權利要求5所述的非診斷目的的施羅氏弧菌的環介導等溫擴增檢測方法，其特征在于，所述步驟(2)的進行環介導等溫擴增反應，其反應參數為65°C溫育I小時，然后80°C滅活lOmin，最后10°C保存。
9.根據權利要求5所述的非診斷目的的施羅氏弧菌的環介導等溫擴增檢測方法，其特征在于，所述的陽性對照質控品為含有施羅氏弧菌的toxR基因的質粒DNA。
10.根據權利要求5所述的非診斷目的的施羅氏弧菌的環介導等溫擴增檢測方法，其特征在于，所述的陰性對照質控品為不同于施羅氏弧菌的toxR基因的DNA序列。
全文摘要
本發明公開了一種施羅氏弧菌的環介導等溫擴增檢測引物、檢測試劑盒和檢測方法。檢測引物為前外引物F35'-CAAACGGTTGGCGGTGTC-3'；后外引物B35'-CCGCAAGATGCTGAAGGATC-3'；前內引物FIP5'-CTGCAAGAGCCAAACTCTGCGTCTTTTGGAGCTGGTGGGAT-3'；后內引物BIP5'-GCTTCTGATGAAGCGACAGGCAGTAAAGACGGTGCCTAAGCG-3'。使施羅氏弧菌檢測技術達到國際先進水平，檢測能力大幅提高，施羅氏弧菌的環介導等溫擴增檢測方法的檢測限高于傳統檢測方法100~200倍；另一方面本發明的施羅氏弧菌的環介導等溫擴增檢測方法具有儀器設備要求簡單、檢測時間短(0.5~1.0小時)、特異性高(針對靶基因的8/6個區域設計6/4種特異引物)等特點，彌補了經典PCR擴增技術對儀器設備要求高、技術較為復雜等諸多弊端，具有檢測能力強、檢測時間短、對儀器設備要求簡單的優點，具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12N15/11GK102719551SQ201210240479
公開日2012年10月10日 申請日期2012年7月11日 優先權日2012年7月11日
發明者任春華, 劉助紅, 胡超群, 陳償, 高磊 申請人:中國科學院南海海洋研究所