專利名稱：一種微生物產γ-谷氨基甲酰胺合成酶催化合成L-茶氨酸的方法
技術領域：
本發明涉及一種近玫色鎖擲孢酵母(Sporidiobolus pararoseus)T_C2,尤其涉及利用該微生物發酵生產的Y -谷氨基甲酰胺合成酶來催化合成L-茶氨酸的方法。
背景技術：
L-茶氨酸(L-Theanine)是茶樹中特有的非蛋白質游離氨基酸，它是茶葉中主要的品質與功能成分之一，因其具有安神鎮靜、免疫調節等多種生理作用而廣泛應用于食品、藥品及飼料添加劑等領域，并于2002年被美國健康食品行業評為最具潛力的天然產物之L-茶氨酸的天然來源途徑極少，茶樹體內的L-茶氨酸是以谷氨酸和乙胺為底物，在茶氨酸合成酶的作用下形成的，它與茶樹氮代謝有密切關聯。目前其制備主要包括從茶葉中直接分離純化、化學合成和生物合成等幾種方法(I)分離純化由于茶葉中還存在其他較高濃度的可溶性物質，如咖啡因和茶多酚等，那么針對現階段的研究，最為關鍵的難點在于如何分離純化得到高純度L-茶氨酸。(2)化學合成茶氨酸化學合成提供了一種簡單、方便、廉價的生產方法。但是化學合成會產生較多副產物，而且得到的產物是L-構型與D-構型的消旋體，同時反應時間較長、污染大，經濟效益不夠理想。(3)生物合成從產品加工成本、產品安全性以及產品質量等方面考慮，生物合成是制備L-茶氨酸的發展趨勢。目前，國內外L-茶氨酸生物合成主要包括茶樹細胞懸浮培養、茶樹愈傷組織培養、及微生物酶促合成等方法。現在國外L-茶氨酸生物合成主要采用微生物酶促合成法生產。合成L-茶氨酸的微生物酶的研究主要集中于谷氨酰胺酶、谷氨酰胺合成酶、Y-谷氨酰基轉肽酶和Y-谷氨基甲酰胺合成酶四種。上述四種微生物酶均具有Y-谷氨酰基轉移功能，即在適宜條件下皆能將谷氨酰基轉移給乙胺而合成L-茶氨酸，但合成機制有所不同。其中，谷氨酰胺轉肽酶合成途徑須以谷氨酰胺和乙胺為底物，而其他三種則可以谷氨酸和乙胺為底物，偶聯酵母發酵作為ATP產生系統，就能合成L-茶氨酸。由于谷氨酰胺市價過高，且相比谷氨酰胺酶和谷氨酰胺合成酶，Y -谷氨基甲酰胺合成酶對乙胺具有較高的親和力，反應中不產生副產物谷氨酰胺，使得其成為L-茶氨酸酶促合成的主要研究方向。由此可見，就目前L-茶氨酸的市場關注度和需求量而言，尋找一種能夠生產合成L-茶氨酸的微生物Y-谷氨基甲酰胺合成酶，并建立Y-谷氨基甲酰胺合成酶催化合成L-茶氨酸的方法對其產業的未來發展具有重要的理論意義和實踐價值。然而，因受到研究方法與技術手段的限制，對Y-谷氨基甲酰胺合成酶的酶源篩選、培養與固定化及其酶促合成L-茶氨酸等關鍵技術難點，國內外目前尚未取得突破性進展。因此，開展微生物產Y -谷氨基甲酰胺合成酶催化合成L-茶氨酸的研究已成為當前L-茶氨酸制備的熱點問題。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對上述現有技術的不足，提供一種近玫色鎖擲孢酵母(Sporidiobolus pararoseus) T-C2,同時還提供利用該近玫色鎖擲孢酵母(Sporidiobolus pararoseus)T_C2發酵生產的Y -谷氨基甲酰胺合成酶催化合成L-茶氨酸的方法。本發明的近玫色鎖擲抱酵母(Sporidio bolus pararoseus)T_C2,已于2012年6月13日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCN0 :M2012232，保藏地址中國，武漢，武漢大學。本發明菌株近玫色鎖擲孢酵母T-C2，菌落呈玫粉色，形態呈卵圓形凸起，不透明，表面光滑，邊緣平整，菌體粘稠，易挑起，菌體多呈橢圓形或球桿狀有鎖狀聯合，年幼的菌落中可生出茁芽；經生化檢測發現，糖發酵、硝酸鹽還原和類淀粉物質的生成試驗均呈陰性，脲酶試驗呈陽性；經分子生物學鑒定，獲得555 bp序列，BLAST比對分析表明，該菌株與近玫色鎖擲抱酵母(Sporidiobolus pararoseus)最為接近。參照《真菌鑒定手冊》、中國真菌志及酵母菌各屬檢索表，按J · Lodder酵母分類學鑒定進行分析，由檢索表將其歸為近玫色鎖擲孢酵母(Sporidiobolus pararoseus)。將本發明的菌株T-C2接種于富集培養基中發酵，可得到Y-谷氨基甲酰胺合成酶發酵液，發酵條件為接種量為5-10%，溫度為28-30°C，轉速為120-180r/min，振蕩培養2-4天。該富集培養基的組成為0. 25%甲胺鹽酸鹽、0. 25 %甲醇、0. 2 % NaCUO. I % KC1、
0.03 % MgS04.7H20、0· 005 % KH2PO4、0· 005 % K2HPO4 UXlO ' 7 % VB12 及 O. 03 % 酵母粉，ρΗ7· 0-7. 4。本發明還提供由上述發酵液得到純化的Y-谷氨基甲酰胺合成酶的方法，是將上述發酵液于4°C、12000 r/min離心15-20min,棄去上清,用10 mmol/L pH 6. O的磷酸鹽緩沖液浸洗兩次后，再于4°C、12000 r/min離心15_20min，棄去上清，然后將得到的細胞重懸于少量緩沖液中，緩沖液沒住細胞即可，再于冰上用20 kHZ的超聲波進行細胞破碎2-3min,得到粗酶液；將粗酶液調節pH值為8_9，在30°C條件下加入30-35%飽和度的硫酸銨進行鹽析，用蛋白沉淀重溶液重溶至原始體積，超濾脫鹽后進行SephadexG-75柱層析得到純化的Y-谷氨基甲酰胺合成酶。本發明同時還提供利用上述方法得到的純化的Y-谷氨基甲酰胺合成酶合成L-茶氨酸的方法，該方法是將上述純化得到的Y -谷氨基甲酰胺合成酶按每升L-茶氨酸合成體系加0. 01-0. 02mL Y -谷氨基甲酰胺合成酶的比例加入到裝有L-茶氨酸合成體系的試管中反應，在30-35°C、pH值為8-9的條件下反應10_12h后，將試管浸入沸水中終止反應，冷卻至室溫后，離心取上清，得到L-茶氨酸。其中，上述L-茶氨酸合成體系的組成為30 mmol /I,谷氛酸、150 mmol /I,乙胺鹽酸鹽、15 mmol /T, ATP>30 mmol/L MgCl2、ρΗ7· 75 的100 mmol/L 咪唑緩沖液、及 0. lmg/mL CTAB。本發明從篩選生產合成L-茶氨酸的微生物Y-谷氨基甲酰胺合成酶酶源入手，利用篩選出的微生物菌株生產Y -谷氨基甲酰胺合成酶，將其加入經優化的酶促合成L-茶氨酸體系中生產L-茶氨酸，并根據其酶促合成L-茶氨酸的產量判定酶活力高低，得到最佳的生產Y-谷氨基甲酰胺合成酶方法。本發明得到的近玫色鎖擲孢酵母培養條件簡單，無需嚴格控制生長環境，且酵母偶聯ATP發酵反應已有較為成熟的研究基礎，具有良好的開發前景。而利用微生物自身活動產生的具有體外茶氨酸合成酶活性的生物酶，在人工控制的特殊條件下，只要給予適當的底物、能量及適宜的外界條件，進行發酵生產，就可以得到安全、無污染、無毒副作用的L-茶氨酸。本發明成果可應用于后續的L-茶氨酸生產中，在綠色、無污染的基礎上提高產量，實現了安全、簡便、高效、經濟化生產，為今后開展L-茶氨酸大規模微生物酶促發酵生產提供了理論和實踐依據。
具體實施例方式下述實施例中的培養基組成如下，培養基組成如無特別說明，皆為常規配制。篩選培養基0.25% 甲胺鹽酸鹽、O . 25% 甲醇、O. 2 % NaCl、O. I % KC1、0. 03 %MgS04.7H20、0· 005% ΚΗ2Ρ04、0· 005% K2HPO4、及 I X 10 ' 7 % VB12, ρΗ7· 0-7. 4 ；純化培養基同篩選培養基，另加20g/L瓊脂；富集培養基同篩選培養基，另加O. 03%酵母粉；磷酸鉀緩沖液pH 6. 0，含10%甘油、lmmol/L MgCl2、及lmmol/L 2-巰基乙醇；實施例I本發明菌株的制備(I)菌種馴化從湖南省茶葉研究所高橋實驗茶場生長狀況良好的茶樹根際15-25cm處土壤中取樣，將IOg新鮮土樣裝入含有90mL無菌水的三角瓶中,用玻璃珠打散,置于恒溫搖床中，25°C、150 r/min振蕩lh，制成土壤懸液，靜置。按2%體積比將土壤懸液上清加入篩選培養基中，30°C、150 r/min振蕩培養5-14天后，將渾濁的培養基(0D610值大于O. I)轉到新鮮的篩選培養基中，再培養至渾濁，這個過程反復3-5次，即得到馴化菌液。(2)菌株分離純化將馴化菌液用無菌水依次逐級稀釋至lO'lO'lO'lO'lO'lO—6六個稀釋度，分別涂布于平板上，并做平行樣，30°C恒溫培養3-7天。選取菌落生長疏密適當的倍數(10_4或10_5)，挑選單菌落于純化培養基上進行劃線分離。30°C培養3-7天后，菌落被初步純化，重復一次，3-7天后分離出本發明菌株，斜面劃線保存。實施例2 Y -谷氨基甲酰胺合成酶的制備取上述得到的斜面菌株，挑取一環置于40mL富集培養基中，30°C、150r/min振蕩培養3天，檢測OD值大于0. I即可。再將富集培養液4°C、12000r/min離心18min，棄去上清，用10 mmol/L pH 6. O的磷酸鹽緩沖液浸洗兩次后,再于4°C、12000r/min離心18min,棄上清，然后將得到的細胞重懸于少量緩沖液中(沒住細胞即可)，再于冰上進行超聲細胞破碎(20 kHZ，2-3 min)，制成粗酶液。將粗酶液調節pH值為8，在30°C條件下加入30%飽和度的硫酸銨進行鹽析，用蛋白沉淀重溶液重溶至原始體積，超濾脫鹽后進行SephadexG-75柱層析即可。將得到的上述產物采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法，采用5%濃縮膠、12%分離膠，以低分子量標準蛋白(ll_72ku)對照，測定產物的酶蛋白分子量為17-26ku之間，可確定純化得到的產物即為Y-谷氨基甲酰胺合成酶。實施例3 Y -谷氨基甲酰胺合成酶催化合成L-茶氨酸將純化的Y -谷氨基甲酰胺合成酶按每升L-茶氨酸合成體系加0. 02mL Y -谷氨基甲酰胺合成酶的比例加入到裝有L-茶氨酸合成體系的試管中反應，在30°C、pH值為8的條件下反應12h后將試管浸入沸水中終止反應,冷卻至室溫后，12000r/min離心5 min,取上清，得到L-茶氨酸，-20°C保存。其中，L-茶氨酸合成體系為30 mmol/L谷氨酸、150 mmol/L乙胺鹽酸鹽、15mmol/L ATP,30 mmol/L MgCl2UOO mmol/L 咪唑緩沖液(pH7. 75)、及 0. lmg/mL CTAB。實施例4 Y-谷氨基甲酰胺合成酶酶活力檢測使用HPLC高效液相色譜對產物進行檢測，通過檢測得到的L-茶氨酸產量來衡量相對酶活力高低。HPLC高效液相色譜檢測條件日本島津高效液相色譜儀，離子對色譜法。色譜柱KromasilTMC18(5 μ m, 200 mmX 4. 6 mm);流動相 A :0. 1% 憐酸水溶液(添加 10 mol/L SDS);流動相B :乙腈；流速為lml/min ;檢測器光電二極管陣列檢測器，檢測波長為200nm ;柱溫32°C ;進樣量為10 μ L。經HPLC檢測L-茶氨酸合成產量為16. 90mmol/L,與現有微生物酶促合成L-茶氨 酸技術相比較，結果如下表I:表I L-茶氨酸產量對比表
權利要求
1.一種產Y-谷氨基甲酰胺合成酶的菌株，該菌株為近玫色鎖擲孢酵母(Sporidiobolus pararoseus) T-C2,已于2012年6月13日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO M2012232o
2.權利要求I所述的菌株在制備Y-谷氨基甲酰胺合成酶中的應用。
3.一種發酵法制備Y-谷氨基甲酰胺合成酶發酵液的方法，其特征在于發酵所用菌株為權利要求I所述的菌株，發酵所用培養基為富集培養基，發酵條件為接種量為5-10%，溫度為28-30°C，轉速為120-180r/min，振蕩培養2-4天。
4.如權利要求3所述的發酵法制備Y-谷氨基甲酰胺合成酶發酵液的方法，其特征在于所述富集培養基的組成為0. 25%甲胺鹽酸鹽、O. 25 %甲醇、O. 2 % NaCUO. I % KCl、O. 03 % MgS04*7H20、0. 005 % KH2PO4、O. 005 % K2HPO4 UXlO ' 7 % VB12 及 O. 03 % 酵母粉，ρΗ7· 0-7. 4。
5.如權利要求3或4所述方法得到的Y-谷氨基甲酰胺合成酶發酵液。
6.由權利要求5所述的發酵液制得的Y-谷氨基甲酰胺合成酶粗酶液。
7.如權利要求6所述的Y-谷氨基甲酰胺合成酶粗酶液，其特征在于該粗酶液是將發酵液于4°C、12000 r/min離心15_20min,棄去上清,用10 mmol/L pH 6.0的磷酸鹽緩沖液浸洗兩次后，再于4°C、12000 r/min離心15_20min，棄去上清，然后將得到的細胞重懸于少量緩沖液中，緩沖液沒住細胞即可，再于冰上用20 kHZ的超聲波進行細胞破碎2-3min，即可。
8.利用權利要求6或7所述的Y-谷氨基甲酰胺合成酶粗酶液純化得到Y-谷氨基甲酰胺合成酶的方法，其特征在于該方法是將所述粗酶液調節PH值為8-9，在30°C條件下加入30-35%飽和度的硫酸銨進行鹽析，用蛋白沉淀重溶液重溶至原始體積，再超濾脫鹽后，采用SephadexG-75柱層析得到。
9.利用權利要求8所述的純化的Y-谷氨基甲酰胺合成酶合成L-茶氨酸的方法，其特征在于該方法是將上述純化得到的Y-谷氨基甲酰胺合成酶按每升L-茶氨酸合成體系加O. 01-0. 02mL Y-谷氨基甲酰胺合成酶的比例加入到裝有L-茶氨酸合成體系的試管中反應，在30-35°C、pH值為8-9的條件下反應10_12h后，將試管浸入沸水中終止反應，冷卻至室溫后，12000 r/min離心4-6min,取上清,得到L-茶氨酸。
10.如權利要求9所述的合成L-茶氨酸的方法，其特征在于所述L-茶氨酸合成體系為30 mmol /I,谷氛酸、150 mmol /I,乙胺鹽酸鹽、15 mmol /T, ATP>30 mmol/L MgCl2、pH7. 75的 100 mmol/L 咪唑緩沖液、及 0. lmg/mL CTAB。
全文摘要
一種微生物產γ-谷氨基甲酰胺合成酶催化合成L-茶氨酸的方法，是從茶樹根際土壤篩選得到γ-谷氨基甲酰胺合成酶酶源菌株近玫色鎖擲孢酵母(Sporidiobolus pararoseus)T-C2，保藏編號為CCTCC NOM2012232，以獲得純化的γ-谷氨基甲酰胺合成酶，并應用該酶進行酶促合成L-茶氨酸，從而得到了具有高酶活力的γ-谷氨基甲酰胺合成酶生產合成L-茶氨酸的方法，其合成效率遠高于現有微生物酶酶促合成L-茶氨酸技術，實現了安全、簡便、高效、經濟化生產，為后續開展L-茶氨酸大規模微生物酶促發酵生產提供了理論和實踐依據。
文檔編號C12P13/04GK102719367SQ201210235889
公開日2012年10月10日 申請日期2012年7月10日 優先權日2012年7月10日
發明者張玥, 肖文軍, 龔志華 申請人:湖南農業大學