專利名稱：一種嗜熱鏈球菌增菌培養基及其制備方法
技術領域：
本發明屬于益生菌培養技術領域，涉及ー種嗜熱鏈球菌增菌培養基及其制備方法。
背景技術：
近幾年我國乳品エ業發展速度較快，酸奶及發酵乳飲料的發展居乳制品產業之首。平均年增長速度達15%以上，而且在今后很長一段時間內仍會保持這ー增長速度。同時隨著社會的發展和人們生活水平的提高，對酸奶發酵劑的品質有了更高的要求。 傳統發酵劑一般需要對菌種進行擴大培養，周期長、接種量大、操作繁瑣、菌種容易污染、退化或變異，質量不易控制，而且發酵劑活菌數低等(IO7-IO8CfuAiL)。而直投式乳酸菌發酵劑不需對菌種活化、擴大繁殖過程而直接應用于生產。其主要優點是活菌含量高、接種量小、生產成本較低、保藏期長、攜帯方便，可直接用于發酵制品的生產，減少擴大培養的復雜操作エ序，從而簡化產品的生產エ藝。有利于保持產品質量的穩定，防止菌種的退化、變異和污染。因此，直投式乳酸菌發酵劑滿足了生產的迫切需要，成為乳酸菌發酵劑研究的主要方向，具有非常好的經濟價值和不可估量的應用前景。靳亞平等對培養嗜熱鏈球菌的7種基礎培養基進行篩選，確定為乳酸菌培養基。然后優化培養條件起始PH值為6. 8，發酵溫度為42V。得出最佳乳酸菌培養基葡萄糖IOg,酵母膏 7. 5g,蛋白胨 7. 5g, KH2P042g,番茄汁 IOOmL,吐溫-800. 5mL,蒸餾水 900mL, 2%乳清。田洪濤等研究了在MRS基礎培養基中添加不同營養物質對嗜熱鏈球菌生長的影響，最后增殖培養基的最佳配比為在MRS培養基中添加0. 3%玉米漿、7. 5%番茄汁、5. 0%啤酒液、1.0%乳糖；試驗菌株在増殖培養基中經37°C培養24h。呂嘉櫪等研究了嗜熱鏈球菌在脫脂乳培養基中，添加生長因子后的增菌效果。實驗結果表明，6%黃豆芽汁，6. 7%胡蘿卜汁，2%香菇汁，2. 5%醪糟，20%信陽毛尖茶汁，5%啤酒，5%麥芽汁均可作為嗜熱鏈球菌的單因子最佳促生長劑。李用芳等試驗了嗜熱鏈球菌在幾種不同的基礎培養基的生長情況，結果表明嗜熱鏈球菌的最佳生長培養基為番茄汁培養基I和牛乳瓊脂培養基，番茄汁瓊脂培養基I配方為葡萄糖10g，酵母膏10g，番茄汁400ml，鹽液A5ml，鹽液B5ml，蒸餾水600ml，瓊脂20g，pH6. 0.牛乳瓊脂培養基①脫脂奶粉100g，蒸餾水1000ml，0. IOOMPa滅菌IOmin0②瓊脂25-30g,水50ml，酵母膏2. 5g，蒸餾水300ml，0. IOOMPa滅菌20min。①和②分開滅菌后混勻倒平板。李瑩等研究了蔬菜汁培養基的組成(蔬菜汁、碳源、氮源)對嗜熱鏈球菌生長的影響，優化了蔬菜汁培養基的組成。結果表明用于嗜熱鏈球菌生長的最優的蔬菜汁組分為番茄汁10%、豆漿2%、乳糖2%。專利CN1844353A公布了一種廉價的嗜熱鏈球菌菊芋汁增菌培養基，它是以菊芋汁作為主要培養基成分。益生元(Prebiotics)是指那些“人體不消化或難消化的成份(如低聚糖由2-10個單糖組成的糖類，由于其聚合度低，所以稱作低聚糖)，這些成份可選擇性的刺激結腸生理活性益生菌的活性，從而產生對宿主的健康效應”。具有益生元功能的物質主要是ー些非消化性低聚糖，如低聚異麥芽糖、低聚果糖、低聚半乳糖，低聚木糖，大豆低聚糖，水蘇糖，棉籽糖，菊糖，甘露低聚糖，低聚殼聚糖等。低聚木糖又稱木寡糖，是由2-7個木糖分子以￠-1, 4糖苷鍵結合而成的功能性聚合糖。促進益生菌增殖的同時產生多種有機酸。降低腸道PH值，抑制有害菌生長，使益生菌在腸道大量増殖。低聚異麥芽糖(Isomaltose)是由兩個葡萄糖分子以a -I, 6糖苷鍵連接起來的雙糖聚合而成，能有效的促進人體內有益細菌-雙歧桿菌的生長繁殖，而且其耐熱、耐酸性極佳。大豆低聚糖(SoybeanOligosaccharide)是大豆中可溶性糖的總稱,主要成分是水蘇糖、棉子糖和鹿糖等。大豆低聚糖能促進人體腸道內固有的有益細菌一雙歧桿菌的増殖、改善人體免疫力、延緩衰老等，是近年來受到重視的功能性低聚糖，它可廣泛用于保健食品和化妝品中。
發明內容
本發明解決的問題在于提供ー種嗜熱鏈球菌增菌培養基及其制備方法，該培養基是ー種適合嗜熱鏈球菌大量生長的增殖培養基，可應用于高效濃縮型直投式發酵劑的エ業化大規模生產。 本發明是通過以下技術方案來實現ー種嗜熱鏈球菌增菌培養基,包括葡萄糖0. 8 I. 2g,酵母膏0. 5 I. Og,大豆蛋白胨0. 5 I. Og,番爺汁8 12mL,低聚木糖0. 2 0. 4g,低聚異麥芽糖0. 2 0. 4g,大豆低聚糖 0. 2 0. 4g,水 88 92mL, KH2PO4O. I 0. 2g 和吐溫 800. 01 0. 05mL, pH 值 7. 0
7.2。所述的番茄汁是將番茄洗浄后，熱燙軟化、去皮破碎，然后加水打漿，煮沸后冷卻，過濾，得到番茄汁。所述的大豆低聚糖是將脫脂大豆粉的こ醇提取液用酸沉淀去除蛋白，得到大豆低聚糖提取液，再經過脫色、脫鹽處理后得到大豆低聚糖。ー種嗜熱鏈球菌增菌培養基的制備方法，包括以下步驟I)番茄汁的制備取新鮮番茄用清水洗浄，經過熱燙軟化、去皮破碎，加水打漿，然后煮沸10 30min,冷卻后過濾,得到番爺汁；2 )大豆低聚糖的提取大豆粉經石油醚脫脂后得到脫脂大豆粉，然后將脫脂大豆粉用體積分數60 80%こ醇，在90 100°C索式提取器中提取150 200min，分離得到提取液后用飽和醋酸鉛溶液沉淀蛋白；沉淀完全后，調pH值至中性，加入草酸除去過量的鉛離子，過濾除去沉淀，濾液用NaOH調至中性，得到大豆低聚糖提取液；在大豆低聚糖提取液中加入活性炭于45 60°C脫色20 40min，分離得到脫色液后再上樣于離子交換樹脂進行脫鹽處理，洗脫后收集得到大豆低聚糖；3)低聚糖濃溶液的制備將低聚木糖、大豆低聚糖和低聚異麥芽糖分別配制成質量分數為I 5%的溶液，過濾；4)嗜熱鏈球菌增菌培養基的制備將葡萄糖，酵母膏，大豆蛋白胨，KH2PO4，吐溫80混合溶于水中，用NaOH溶液調pH至7. O 7. 2，然后經118°C，15min滅菌，最后再加入過濾的番茄汁和低聚糖溶液；上述各組份的配比為葡萄糖0. 8 I. 2g，酵母膏0. 5 I. Og,大豆蛋白胨0. 5
I.Og,番爺汁8 12mL,低聚木糖0. 2 0. 4g,低聚異麥芽糖0. 2 0. 4g,大豆低聚糖0. 2 0. 4g,水 88 92mL, KH2PO4O. I 0. 2g 和吐溫 800. 01 0. 05mL。所述的番茄汁的過濾為先經過雙層紗布過濾，再經12rC、20min高溫滅菌的0. 2微米的膜過濾。所述的大豆低聚糖的提取為大豆粉經石油醚脫脂、除去石油醚后，得到脫脂大豆粉； 然后用體積分數60 80%こ醇，按脫脂大豆粉こ醇=Ig : 8 IOmL的料液比，在90°C索式提取器中提取150 200min，重復提取兩次，合并提取液后用pH為4 5的飽和醋酸鉛溶液沉淀蛋白；沉淀完全后，調pH值至中性，加入草酸除去過量的鉛離子，過濾除去沉淀；濾液用0. 5mol/LNa0H調至中性，得到大豆低聚糖提取液；在大豆低聚糖提取液中加入固形物質量I. 5 2%的活性炭于45°C脫色30min，脫色液再以35m3/(m3 h)的速度流過50 60°C的732型陽離子交換樹脂或717型陰離子交換樹脂進行脫鹽處理，將脫鹽后的提取液濃縮后干燥得到大豆低聚糖。所述的低聚木糖分子式為(C5HltlO5)n, n為2_7，分子量為300-1051。低聚異麥芽糖分子式為(C5HltlO5)n, n為2-10分子量為300-2000。與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果本發明提供的嗜熱鏈球菌增菌培養基，在常用的基礎培養基上添加了番茄汁和低聚糖(包括低聚木糖、大豆低聚糖和低聚異麥芽糖)，以達到增菌的效果；而且這些成分來源方便，價格低廉，制作簡單，且能夠起到明顯的增菌效果嗜熱鏈球菌經活化后，以5%的接種量接入該增菌培養基中，42°C培養llh，活菌數高達(5. 9-7. 6) X108Cfu/mL以上，與相同處理的實驗室常用的、價格昂貴的M17培養基的活菌數(3. 2-3. 7) X 108Cfu/mL相比，活菌數得到了提高，增菌效果顯著。本發明提供的ー種嗜熱鏈球菌增菌培養基，由于其來源方便、價格低廉、增菌效果明顯，是ー種適合嗜熱鏈球菌大量生長的增殖培養基，可應用于高效濃縮型直投式發酵劑的エ業化大規模生產。
具體實施例方式下面結合具體的實施例對本發明做進ー步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。實施例I嗜熱鏈球菌增菌培養基組成葡萄糖0. 8g,酵母膏0. 5g,大豆蛋白胨0. 5g,番爺汁8mL，低聚木糖(C5H10O5)nO. 2g，低聚異麥芽糖(C5H10O5)nO. 2g，大豆低聚糖0. 2g，水92mL，KH2PO4O. 2g,吐溫 800. 05mL, pH 值 7. O。嗜熱鏈球菌增菌培養基的制備I)番茄汁的制備取新鮮番茄500g用清水洗浄，經過熱燙軟化、去皮破碎，加500mL水打漿，然后煮沸20min，冷卻后，用雙層紗布過濾，再經121°C，20min高溫滅菌的0. 2微米的膜過濾。2)大豆低聚糖的提取市售大豆粉，經石油醚脫脂、除去溶劑后，得到脫脂大豆粉，然后用80%こ醇，按I 10的料液比，在90°C提取165min，重復提取兩次，用飽和醋酸鉛溶液沉淀蛋白(pH為4-5)，沉淀完全后，調pH值至中性，加入草酸除去過量的鉛離子，過濾除去沉淀。濾液用0. 5mol/LNa0H調至中性，得到大豆低聚糖的提取液。在提取液中加入I. 5%的活性炭(相對固形物)于45°C脫色30min，脫色液再以35mV(m3 h)的速度流過50_60°C的732型陽離子交換樹脂和717型陰離子交換樹脂進行脫鹽處理，最后得到產品大豆低聚糖。3)低聚糖濃溶液的制備將低聚木糖、大豆低聚糖和低聚異麥芽糖分別配制成1%的濃溶液，然后經121°C， 20min高溫滅菌的0. 2微米的膜過濾。4)嗜熱鏈球菌增菌培養基的制備將葡萄糖，酵母膏，大豆蛋白胨，KH2PO4,吐溫80混合溶于水中，用ImoL/L NaOH溶液調PH至7. 0，然后經118°C，15min滅菌，最后再加入經膜過濾的番茄汁和低聚糖溶液。將嗜熱鏈球菌經過液體M17培養基活化后，以5%的接種量接入本實施例所得的增菌培養基中，42°C培養llh，活菌數可達5. 9X 108cfu/mL，較之對照M17培養基的活菌數3. 25 X 108cfu/mL相比得到了提高。實施例2嗜熱鏈球菌增菌培養基組成葡萄糖I. Og,酵母膏0. 8g,大豆蛋白胨0. 8g,番爺汁10mL，低聚木糖(C5HltlO5)nO. 2g，低聚異麥芽糖(C5HltlO5)nO. 2g，大豆低聚糖0. 2g，水90mL，KH2PO4O. 2g,吐溫 800. 05mL, pH 值 7. I。嗜熱鏈球菌增菌培養基的制備I)番茄汁的制備取新鮮番茄用清水洗浄，經過熱燙軟化、去皮破碎，加水打漿，然后煮沸24min，冷卻后過濾，得到番茄汁；2)大豆低聚糖的提取大豆粉經石油醚脫脂后得到脫脂大豆粉，然后將脫脂大豆粉用體積分數70%乙醇，在95°C索式提取器中提取180min，分離得到提取液后用飽和醋酸鉛溶液沉淀蛋白；沉淀完全后，調pH值至中性，加入草酸除去過量的鉛離子，過濾除去沉淀，濾液用NaOH調至中性，得到大豆低聚糖提取液；在大豆低聚糖提取液中加入活性炭于50°C脫色40min，分離得到脫色液后再上樣于60°C的732型陽離子交換樹脂和717型陰離子交換樹脂進行脫鹽處理，洗脫后收集得到大豆低聚糖；3)低聚糖濃溶液的制備將低聚木糖、大豆低聚糖和低聚異麥芽糖分別配制成質量分數為2%的溶液，過濾；4)嗜熱鏈球菌增菌培養基的制備將葡萄糖，酵母膏，大豆蛋白胨，KH2PO4，吐溫80混合溶于水中，用NaOH溶液調pH至7. 1，然后經118°C，15min滅菌，最后再加入過濾的番茄汁和低聚糖溶液；
將嗜熱鏈球菌經過液體M17培養基活化后，以5%的接種量接入本實施例所得的增菌培養基中，42°C培養llh，活菌數可達6. 6X 108cfu/mL，相比對照M17培養基的活菌數3. 44X 108cfu/mL相比得到了提高。實施例3嗜熱鏈球菌增菌培養基組成葡萄糖I. 0g，酵母膏0. Sg，大豆蛋白胨l.Og，番茄汁IOmL,低聚木糖0. 4g，低聚異麥芽糖0. 4g，大豆低聚糖0. 4g，水90mL, KH2PO4O. 2g，吐溫800. 05mL, pH 值 7. O。嗜熱鏈球菌增菌培養基的制備I)番茄汁的制備
取新鮮番茄用清水洗浄，經過熱燙軟化、去皮破碎，加水打漿，然后煮沸28min，冷卻后過濾，得到番茄汁；2)大豆低聚糖的提取大豆粉經石油醚脫脂后得到脫脂大豆粉，然后將脫脂大豆粉用體積分數75%乙醇，在98°C索式提取器中提取170min，分離得到提取液后用飽和醋酸鉛溶液沉淀蛋白；沉淀完全后，調pH值至中性，加入草酸除去過量的鉛離子，過濾除去沉淀，濾液用NaOH調至中性，得到大豆低聚糖提取液；在大豆低聚糖提取液中加入活性炭于55°C脫色35min，分離得到脫色液后再上樣于732型陽離子交換樹脂和717型陰離子交換樹脂進行脫鹽處理，洗脫后收集得到大豆低聚糖；3)低聚糖濃溶液的制備將低聚木糖、大豆低聚糖和低聚異麥芽糖分別配制成質量分數為3%的溶液，過濾；4)嗜熱鏈球菌增菌培養基的制備將葡萄糖，酵母膏，大豆蛋白胨，KH2PO4，吐溫80混合溶于水中，用NaOH溶液調pH至7. 0，然后經118°C，15min滅菌，最后再加入過濾的番茄汁和低聚糖溶液；將嗜熱鏈球菌經過液體M17培養基活化后，以5%的接種量接入本實施例所得的增菌培養基中，42°C培養llh，活菌數可達7. IX 108cfu/mL，相比對照M17培養基的活菌數3. 58 X 108cfu/mL相比得到了提高。實施例4嗜熱鏈球菌增菌培養基組成葡萄糖1.2g，酵母膏I. 0g，大豆蛋白胨l.Og，番茄汁12mL,低聚木糖0. 4g，低聚異麥芽糖0. 4g，大豆低聚糖0. 4g，水88mL, KH2PO4O. 2g，吐溫800. 05mL, pH 值 7. O。嗜熱鏈球菌增菌培養基的制備I)番茄汁的制備取新鮮番茄用清水洗浄，經過熱燙軟化、去皮破碎，加水打漿，然后煮沸30min，冷卻后過濾，得到番茄汁；2)大豆低聚糖的提取大豆粉經石油醚脫脂后得到脫脂大豆粉，然后將脫脂大豆粉用體積分數65%こ醇，在100°C索式提取器中提取160min，分離得到提取液后用飽和醋酸鉛溶液沉淀蛋白；
沉淀完全后，調pH值至中性，加入草酸除去過量的鉛離子，過濾除去沉淀，濾液用NaOH調至中性，得到大豆低聚糖提取液；在大豆低聚糖提取液中加入活性炭于60°C脫色25min，分離得到脫色液后再上樣于732型陽離子交換樹脂和717型陰離子交換樹脂進行脫鹽處理，收集得到大豆低聚糖；3)低聚糖濃溶液的制備將低聚木糖、大豆低聚糖和低聚異麥芽糖分別配制成質量分數為5%的溶液，過濾；4)嗜熱鏈球菌增菌培養基的制備
將葡萄糖，酵母膏，大豆蛋白胨，KH2PO4，吐溫80混合溶于水中，用NaOH溶液調pH至7. 2，然后經118°C，15min滅菌，最后再加入過濾的番茄汁和低聚糖溶液；將嗜熱鏈球菌經過液體M17培養基活化后，以5%的接種量接入本實施例所得的增菌培養基中，42 °C培養IIh，活菌數可達7. 6X IO8Cfu/mL，比對照M17培養基的活菌數3. 7 X 108cfu/mL相比得到了提高。
權利要求
1.一種嗜熱鏈球菌增菌培養基，其特征在于，包括葡萄糖O. 8 I. 2g，酵母膏O. 5 I. Og,大豆蛋白胨O. 5 I. Og,番爺汁8 12mL，低聚木糖O. 2 O. 4g，低聚異麥芽糖O. 2 0.4g,大豆低聚糖 O. 2 O. 4g,水 88 92mL, KH2PO4O. I O. 2g 和吐溫 800. 01 O. 05mL,pH 值 7. O 7. 2。
2.如權利要求I所述的嗜熱鏈球菌增菌培養基，其特征在于，所述的番茄汁是將番茄洗凈后，熱燙軟化、去皮破碎，然后加水打漿，煮沸后冷卻，過濾，得到番茄汁。
3.如權利要求I所述的嗜熱鏈球菌增菌培養基，其特征在于，所述的大豆低聚糖是將脫脂大豆粉的乙醇提取液用酸沉淀去除蛋白，得到大豆低聚糖提取液，再經過脫色、脫鹽處理后得到大豆低聚糖。
4.一種嗜熱鏈球菌增菌培養基的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 O番茄汁的制備 取新鮮番茄用清水洗凈，經過熱燙軟化、去皮破碎，加水打漿，然后煮沸10 30min，冷卻后過濾，得到番茄汁； 2)大豆低聚糖的提取 大豆粉經石油醚脫脂后得到脫脂大豆粉，然后將脫脂大豆粉用體積分數60 80%乙醇，在90 100°C索式提取器中提取150 200min，分離得到提取液后用飽和醋酸鉛溶液沉淀蛋白； 沉淀完全后，調PH值至中性，加入草酸除去過量的鉛離子，過濾除去沉淀，濾液用NaOH調至中性，得到大豆低聚糖提取液； 在大豆低聚糖提取液中加入活性炭于45 60°C脫色20 40min，分離得到脫色液后再上樣于離子交換樹脂進行脫鹽處理，洗脫后收集得到大豆低聚糖； 3)低聚糖濃溶液的制備 將低聚木糖、大豆低聚糖和低聚異麥芽糖分別配制成質量分數為I 5%的溶液，過濾； 4)嗜熱鏈球菌增菌培養基的制備 將葡萄糖，酵母膏，大豆蛋白胨，KH2PO4,吐溫80混合溶于水中，用NaOH溶液調pH至7.O 7. 2，然后經118°C，15min滅菌，最后再加入過濾的番茄汁和低聚糖溶液； 上述各組份的配比為葡萄糖O. 8 I. 2g，酵母膏O. 5 I. 0g，大豆蛋白胨O. 5 1.Og,番爺汁8 12mL,低聚木糖O. 2 O. 4g,低聚異麥芽糖O. 2 O. 4g,大豆低聚糖O. 2 O.4g,水 88 92mL, KH2PO4O. I O. 2g 和吐溫 800. 01 O. 05mL。
5.如權利要求4所述的嗜熱鏈球菌增菌培養基的制備方法，其特征在于，所述的番茄汁的過濾為先經過雙層紗布過濾，再經121°C、20min高溫滅菌的O. 2微米的膜過濾。
6.如權利要求4所述的嗜熱鏈球菌增菌培養基的制備方法，其特征在于，所述的大豆低聚糖的提取為 大豆粉經石油醚脫脂、除去石油醚后，得到脫脂大豆粉； 然后用體積分數60 80%乙醇，按脫脂大豆粉乙醇=Ig : 8 IOmL的料液比，在90 100°C索式提取器中提取150 200min，重復提取兩次，合并提取液后用pH為4 5的飽和醋酸鉛溶液沉淀蛋白； 沉淀完全后，調PH值至中性，加入草酸除去過量的鉛離子，過濾除去沉淀；濾液用O.5mol/LNaOH調至中性，得到大豆低聚糖提取液； 在大豆低聚糖提取液中加入固形物質量I. 5 2%的活性炭于45°C脫色30min，脫色液再以35m3/(m3 · h)的速度流過50 60°C的732型陽離子交換樹脂和717型陰離子交換樹脂進行脫鹽處理，將脫鹽后的提取液濃縮后干燥得到大豆低聚糖。
7.如權利要求4所述的嗜熱鏈球菌增菌培養基的制備方法，其特征在于，所述的低聚木糖分子式為(C5HltlO5)n，n為2 7，分子量為300 1051 ;低聚異麥芽糖分子式為(C5HltlO5)η，η為2 10分子量為300 2000。
全文摘要
本發明公開了一種嗜熱鏈球菌增菌培養基及其制備方法，包括葡萄糖0.8～1.2g，酵母膏0.5～1.0g，大豆蛋白胨0.5～1.0g，番茄汁8～12mL，低聚木糖0.2～0.4g，低聚異麥芽糖0.2～0.4g，大豆低聚糖0.2～0.4g，水88～92mL，KH2PO40.1～0.2g和吐溫800.01～0.05mL，pH值7.0～7.2。在常用的基礎培養基上添加了番茄汁和低聚糖(包括低聚木糖、大豆低聚糖和低聚異麥芽糖)，以達到增菌的效果；而且這些成分來源方便，價格低廉，制作簡單，且能夠起到明顯的增菌效果。
文檔編號C12N1/20GK102766590SQ201210235638
公開日2012年11月7日 申請日期2012年7月9日 優先權日2012年7月9日
發明者李串娜, 王勇, 舒國偉, 陳合 申請人:陜西科技大學