專利名稱：一種番茄灰霉菌毒素的提取和純化方法
技術領域：
本發明涉及農業生物技術領域，具體講是一種番茄灰霉菌毒素的提取和純化方法。
背景技術：
灰霉病是番茄設施栽培的重要病害之一，常造成減產30-40%， 甚至絕產。番茄灰霉菌(.Botrytis cinereaPers)對寄主的破壞作用極其復雜,其中灰霉病菌產生的非寄主專化性毒素在病原菌的侵染過程中起作用，是主要致病因素之一，它可以造成葉片變色、細胞崩潰、促進病菌的侵染和擴展。毒素作為一個致病或致毒因子來源，可作為一個選擇壓，以殺死敏感細胞，選出抗病細胞，離體條件下篩選抗病突變體，解決番茄抗灰霉病材料缺乏的問題。對灰霉菌毒素的提取與純化是進行毒素成分研究及利用主要致病毒素成分創制抗源材料的第一步。據文獻報道，目前一般采用有機溶劑萃取的方法，并多用氯仿進行萃取，而氯仿由于毒性大、麻醉性強，不利于操作者的安全。
發明內容
技術問題本發明的目的在于提供一種番茄灰霉菌毒素的提取和純化方法，該方法不僅簡單易行，容易操作，而且方便進一步的分析與純化，并可以用于抗番茄灰霉病突變體技術的研究。技術方案為實現上述目的，本發明采取以下技術方案
(1)病原菌分離、純化采集番茄病葉或病果，滅菌處理后，在葉片病健交接處剪取3mm的小塊接入PSA平板內或用接種針接觸果實霉層并在PSA平板上劃線，分離培養l-2d后挑取單菌絲，接入PSA平板，純化2-3次后，轉接于PSA斜面培養基中，4°C保存，
(2)病原菌活化灰霉菌株從斜面上培養基上接種于PSA平板，置于25°C左右環境中培養3天。(3)毒素提取用打孔器打取直徑5mm的菌碟,接入Czapek-Dox培養液中，培養14d或21d后，過濾，減壓濃縮，乙酸乙酯萃取，再進行減壓濃縮，用旋轉蒸發儀去除溶劑，所得棕褐色物質為粗毒素，用分析天平稱毒素質量，按一定濃度加少量丙酮溶解，即獲得毒素粗提液。(4)毒素純化用毛細管將毒素粗提液點樣于GF254薄層層析板上，以正己烷乙酸乙酯=(7:3)為展開劑，當展開劑前沿上升至距點樣基線約13 cm處時，取出薄層板自然揮發晾干，放在紫外254nm下觀察。收集相同Rf值的組分，用2_5ml的丙酮洗脫，離心，得到上清液。(5)生物測定采用離體葉片針刺法對上清液進行生物測定，5天后觀察番茄葉片的變化。(6)保存對可在葉片上產生類似于灰霉菌感染后的病斑的上清液，作為層析純毒素，4°C下保存備用。
有益效果本發明不僅提取技術簡單易行，成本低，周期短，而且提取涉及的儀器簡單，從番茄灰霉病菌中提取的毒素可以用于抗番茄灰霉病突變體的誘導，進而獲得抗灰霉病再生植株，為抗番爺灰霉病育種提供重要的基礎材料。
具體實施例方式 一種番茄灰霉菌毒素的提取和純化方法，具體步驟如下
(I)灰霉病菌分尚:
A =PSA培養基的配制
配方為馬鈴薯200g,葡萄糖20g,瓊脂20g,用蒸懼水定容至1000ml。B :病菌的分離
采集感染番爺灰霉菌iBotrytis cinerea )(張從宇，張巨全，胡能兵，張曉紅.番爺灰霉病菌寄主范圍及致病力分化研究，安徽技術師范學院學報，2003，17(3) :239 242。喬樹華，蔣紅云等.石榴皮萃取物對番茄灰霉病菌抑制作用及防病效果，植物保護，2010，,3(I) :148-150.)的發病初期、癥狀典型的番茄病葉(病斑自葉尖呈“V”字形向內擴展)或病果(果臍部呈灰白色并軟腐，病部長有大量灰色霉層)裝入自封袋中，每只自封袋裝一片葉或一個果實，置于冰盒中。病葉用無菌水清洗2-3次，浸入I %次氯酸鈉溶液中30s，取出后再浸入70%的乙醇溶液3-5min，然后再轉入無菌水中漂洗3次，在病健交接處剪取大約邊長為3mm的小塊接入PSA平板內，每平板內接4_5塊，并于25°C培養箱中培養；或用接種針接觸果實霉層并在PSA平板上劃線。(2)病原菌純化、保存
在分離培養l-2d后挑取單菌絲進行純化，將純化2-3次后的病原菌，直接用于毒素的提取或轉接于PSA斜面培養基中于4°C冰箱中保存。(3)病原菌活化
將于4°C冰箱中保存的灰霉菌株從斜面培養基上接種于PSA平板，置于25°C左右環境中培養3天。(4)毒素提取
A Czapek-Dox培養液的配制
其配方為葡萄糖 50. 0g，酵母浸出液 I. 0g, NaNO3 2. 0g, FeSO4 0. Olg, K2HPO4 0. 5g，MgSO4 7H20 0. 5g，用蒸餾水定容至 1000ml。B :毒素產生
在灰霉菌絲將要長滿PSA平板時，使用打孔器沿菌落邊緣依次打取直徑5_的菌碟，將打好的菌碟接入Czapek-Dox培養液中，16菌片/500ml培養液，25°C條件下黑暗培養21d，每天振蕩培養lh, 120r/min。C:減壓濃縮
用雙層紗布濾去菌絲，在50-60°C下進行減壓濃縮。D :毒素提取
將濃縮后的濾液加等體積的有機溶劑乙酸乙酯于分液漏斗中，充分振蕩10-15 min，靜置15min，移去下層溶液，上層溶液重復萃取2-3次，收集下層溶液，進行減壓濃縮，用旋轉蒸發儀去除溶劑，得到棕褐色物質，用分析天平稱質量，按lOOg/L的濃度加丙酮溶解，即獲得毒素粗提液。(5)提取液薄層層析 A :薄層層析板的制作
按硅膠GF254 :羧甲基纖維素鈉(CMC) :H2O=O. 4:0. 007:1的比例混合，先將CMC與H2O混合溶解均勻，再加入硅膠研磨，使之完全混勻。將配制好的漿料鋪在干燥潔凈的玻璃板(20cmX20cm)上,輕輕地左右搖晃,使其表面均勻平滑,厚度約1mm。涂布好的薄層板于室溫下在水平臺上晾干。晾干后，放在烘箱內加熱活化。硅膠板一般在烘箱中漸漸升溫，維持1050C -110°C活化 30min。
B:點樣
在距薄層板一端I. 5cm處用鉛筆輕輕劃一起始線，用0. 5mm毛細管將毒素粗提液點的起始線上，待丙酮揮發后在起始線上重復點樣2-3次，使點樣原點直徑為3mm。C:展開
待丙酮揮發后，將點好樣品的薄層板放入內襯濾紙的展開槽中，展開槽內預先已放置由正己烷和乙酸乙酯組成的展開劑(正己烷乙酸乙酯=7:3)，展開劑浸沒薄層板的一端約0. 5cm。薄層板與水平成45-60°角，蓋好槽蓋，讓薄層板在密閉的展開槽中進行展開。當展開劑前沿上升至距點樣基線約13 cm處時，取出層析板，立即用鉛筆在展開劑上端前沿處劃記號，置空氣中晾干。D :顯色
待板自然風干后，放在紫外254nm下觀察。(6)提取物洗脫
各個樣品間隔一定距離點在起始線上，每個樣品在起始線上的點樣點為原點。層析后計算各組分Rf值原點到組分斑點中心的距離(樣品中含有多種組分，各組分的物理性質不同，使得在薄層板上遷移的距離不同，因此各組分就分離開來，量取的便是原點到各個組分的距離。)與原點到展開劑前沿的距離(13 cm)的比值。對具有相同Rf值的各組分連同吸附劑一起刮下，然后用2_5ml的丙酮將被分離的物質從吸附劑上洗脫下來，各洗脫液12 OOOrpm下離心lOmin，得到上清液；
(7)提取物生物測定
培養皿中先鋪一張浸有無菌水的濾紙，取3-4葉期番茄植株葉片，75%酒精消毒后平鋪到濾紙上，每皿放3片，用接種針輕輕刺破葉片，滴入20iU上清液，置于25°C光照培養箱中，3次重復，設同樣濃度的丙酮溶液作為對照，5天后觀察葉片的變化。(8)提取物保存
對可在葉片上產生類似于灰霉菌感染后的病斑的上清液，作為層析純毒素，4°C下保存備用。
權利要求
1.一種番茄灰霉菌毒素的提取和純化方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)病原菌分離、純化采集感染番爺灰霉菌cinerea/ /^)的病葉或病果，滅菌處理后，在葉片病健交接處剪取邊長約3mm的小塊接入PSA平板內或用接種針接觸果實霉層并在PSA平板上劃線，分離培養l-2d后挑取單菌絲，接入PSA平板，純化2-3次后，轉接于PSA斜面培養基中，4°C保存； (2)病原菌活化灰霉菌株從斜面上培養基上接種于PSA平板,置于25°C環境中培養3天； (3)毒素提取 A :Czapek-Dox培養液的配制 其配方為葡萄糖 50. Og，酵母浸出液 I. Og, NaNO3 2. Og, FeSO4 0. Olg, K2HPO4 0. 5g，MgSO4 7H20 0. 5g，用蒸餾水定容至 IOOOml ； B :毒素產生 在灰霉菌絲將要長滿PSA平板時，使用打孔器沿菌落邊緣依次打取直徑5_的菌碟，將打好的菌碟接入Czapek-Dox培養液中，16菌片/500ml培養液，25°C條件下黑暗培養21d，每天振蕩培養lh, 120r/min ； C:減壓濃縮 用雙層紗布濾去菌絲，在50-60°C下進行減壓濃縮； D :毒素提取 將濃縮后的濾液加等體積的有機溶劑乙酸乙酯于分液漏斗中，充分振蕩10-15 min，靜置15min，移去下層溶液，上層溶液重復萃取2-3次，收集下層溶液，進行減壓濃縮，用旋轉蒸發儀去除溶劑，得到棕褐色物質，用分析天平稱質量，按100g/L的濃度加丙酮溶解，即獲得毒素粗提液； (4)提取液薄層層析 A :薄層層析板的制作 按質量比硅膠GF254 :羧甲基纖維素鈉CMC:H2O=O. 4:0. 007:1的比例混合，先將CMC與H2O混合溶解均勻，再加入硅膠研磨，使之完全混勻，將配制好的漿料鋪在干燥潔凈的玻璃板上，使其表面均勻平滑，厚度1mm，涂布好的薄層板于室溫下在水平臺上晾干，晾干后，放在烘箱內加熱活化，硅膠板在烘箱中漸漸升溫，維持105°C -110°C活化30min ； B :點樣 在距薄層板一端I. 5cm處用鉛筆輕輕劃一起始線，用0. 5mm毛細管將毒素粗提液點在起始線上，待丙酮揮發后在起始線上重復點樣2-3次，使點樣原點直徑為3mm ； C :展開 待丙酮揮發后，將點好樣品的薄層板放入內襯濾紙的展開槽中，展開槽內預先已放置由體積比正己烷乙酸乙酯=7:3組成的展開劑，展開劑浸沒薄層板點樣起始線的一端·0.5cm,薄層板與水平成45-60 °角，蓋好槽蓋，讓薄層板在密閉的展開槽中，展開劑在薄層板上展開，當展開劑前沿上升至距點樣基線13 cm處時，取出層析板，立即用鉛筆在展開劑上端前沿處劃記號，置空氣中晾干； D :顯色 待板自然風干后，放在紫外254nm下觀察；(5)提取物洗脫 各個樣品間隔一定距離點在起始線上，每個樣品在起始線上的點樣點為原點，層析后計算各組分Rf值原點到組分斑點中心的距離與原點到展開劑前沿的距離(13 cm)的比值； 對具有相同Rf值的各組分連同吸附劑一起刮下，然后用2-5ml的丙酮將被分離的物質從吸附劑上洗脫下來，各洗脫液12 OOOrpm下離心lOmin，得到上清液； (6)提取物生物測定 培養皿中先鋪一張浸有無菌水的濾紙，取3-4葉期番茄植株葉片，75%酒精消毒后平鋪到濾紙上，每皿放3片，用接種針輕輕刺破葉片，滴入20 μ I上清液，置于25°C光照培養箱中，3次重復，設同樣濃度的丙酮溶液作為對照，5天后觀察葉片的變化； (7)提取物保存 對能在葉片上產生類似于灰霉菌感染后的病斑的上清液，作為層析純毒素，4°C下保存備用。
2.根據權利要求I所述的一種番茄灰霉菌毒素的提取和純化方法，其特征在于所述的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基PSA配方為馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，用蒸餾水定容至 IOOOml0
全文摘要
本發明涉及農業生物技術領域，具體講是一種番茄灰霉菌毒素的提取和純化方法。該方法經病原菌的分離純化、毒素粗提液的制備、薄層層析技術、毒素的生物測定等步驟提取和純化灰霉菌毒素。本發明的提取純化技術簡單易行，安全性高，成本低，可以用于抗番茄灰霉病突變體技術的研究。
文檔編號C12P1/02GK102766657SQ20121023437
公開日2012年11月7日 申請日期2012年7月9日 優先權日2012年7月9日
發明者余文貴, 楊瑪麗, 趙麗萍, 趙統敏 申請人:江蘇省農業科學院