一種固定化酶法連續轉化生產γ-氨基丁酸的方法

專利名稱：一種固定化酶法連續轉化生產γ-氨基丁酸的方法
技術領域：
本發明屬于生物技術生產氨基酸的技術領域，涉及通過固定化酶法生產Y-氨基丁酸的方法。
背景技術：
Y-氨基丁酸是一種具有很高生理活性的天然氨基酸，廣泛分布于動植物中。是目前研究較為深入的一種重要的抑制性神經遞質，參與多種代謝活動。根據目前的研究，發現Y-氨基丁酸的生理活性主要表現在以下幾方面(1)鎮靜神經、抗焦慮；(2)降低血壓；(3)治療帕金森病、癲癇、老年癡呆等疾病；(4)降低血氨，以解決氨毒，從而增進肝機能；(5)提高腦活力；(6)促進乙醇代謝；(7)其他如防止皮膚老化、消除體臭、改善脂質代謝、防止動脈硬化高效減肥等功能。Y-氨基丁酸目前在醫藥中已有廣泛的應用，同時作為 一種具有顯著藥理作用的功能性因子，其在食品工業中的應用也越來越受關注。由于Y -氨基丁酸在動植物原料中含量很低，很難直接從天然組織中大量提取得至IJ，目前Y-氨基丁酸的制備方法主要有化學合成法和生物合成法。但是，化學合成法得率較低，并且在生產工藝中使用危險溶劑，甚至是有毒溶劑，因此化學合成法制備的Y -氨基丁酸不宜用于食品添加劑使用。生物合成法主要是利用酶催化轉化，在Y-氨基丁酸支路中合成。該方法生產成本低、無毒、安全環保，屬于低碳、綠色生產方式。就酶源而言，可分為兩種途徑植物組織代謝和微生物發酵。其中，植物組織代謝主要利用內源酶轉化制備Y-氨基丁酸，分為植物組織生長代謝和立體植物組織應激代謝兩種方式。微生物發酵法主要是利用谷氨酸脫羧酶(GAD)生物催化谷氨酸脫羧生成Y-氨基丁酸。至今為止，被發現具有GAD活性并用來制備Y-氨基丁酸的微生物主要包括大腸桿菌E. coli、乳酸菌、酵母菌、紅曲霉菌等，表I是目前微生物生產Y-氨基丁酸的情況。表I微生物生產Y -氨基丁酸的研究概況
權利要求
1.一種采用固定化酶法連續轉化生產Y-氨基丁酸的方法，其特征在于該方法包括 以固定化重組表達的纖維素結合域-谷氨酸脫羧酶融合蛋白、簡稱“固定化酶”為酶源，濃度為0. 05mlT0. 15mM的磷酸吡哆醛存在的條件下，進行酶促反應，反應過程中，向反應體系中加入固定化酶4mL/L至20mL/L，底物L-谷氨酸鈉或L-谷氨酸為20g/L至50g/L，溫度25至50°C，pH值為4至6，經酶法轉化反應Ih至4h生產、-氨基丁酸，并進一步分離獲得Y-氨基丁酸粉末或晶體。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述的固定化重組表達的纖維素結合域-谷氨酸脫羧酶融合蛋白的制備方法是 首先，構建高效融合表達纖維素結合域-谷氨酸脫羧酶的基因工程菌株大腸桿菌BL21 (DE3)-pET35b-GAD，即以大腸桿菌BL21的基因組為模板進行PCR擴增谷氨酸脫羧酶基因，構建PET21 (+)-GAD表達載體，并在大腸桿菌BL21 (DE3)中進行表達，隨后將確認的GAD基因轉入pET35b，獲得重組表達載體pET35b_GAD，再構建基因工程菌株大腸桿菌BL21 (DE3) -pET35b-GAD，并在大腸桿菌BL21 (DE3)中進行表達； 以上述重組基因工程菌株大腸桿菌BL21(DE3)-pET35b-GAD的細胞裂解液為起始酶源，經過纖維素載體吸附，完成固定化，得到固定化酶。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述的谷氨酸脫羧酶基因來源于構建的重組菌株BL21 (DE3) -pET21a (+) -GAD,該菌株具備可表達谷氨酸脫羧酶融合蛋白，并能夠將L-谷氨酸或其鈉鹽轉化為Y-氨基丁酸。
4.根據權利要求2或3所述的方法，其特征在于所述的纖維素載體包括纖維素微球、纖維素凝膠、脫脂棉和濾紙。
5.根據權利要求2或3所述的方法，其特征在于固定化酶采用纖維素結合域-谷氨酸脫羧酶融合蛋白特異性吸附固定的方式，或采用交聯劑進一步交聯固定的方式，其中交聯劑為戊二醒，濃度為0. 1%。
6.根據權利要求I所述的方法，其特征在于酶促反應優選轉化溫度為37°C;優選轉化PH值為5. 5 ;優選轉化時間為2h ;底物L-谷氨酸鈉或L-谷氨酸的用量優選分別為40g/L ；輔酶磷酸吡哆醛濃度為0. ImM ;固定化酶優選用量為8mL/L。
7.根據權利要求I所述的方法，其特征在于固定化酶源可重復使用15次以上，且在最佳的反應條件和體系下，連續轉化10次，其催化底物轉化率均能夠達93%以上。
全文摘要
一種采用固定化酶連續轉化生產γ-氨基丁酸的方法。采用構建的谷氨酸脫羧酶基因工程菌BL21(DE3)-pET35b-GAD，將其誘導表達后破碎細胞，收集上清液，對融合表達纖維素結合域(CBD)的谷氨酸脫羧酶的最適反應條件和固定化條件進行了研究。利用CBD標簽對纖維素的特異性吸附性能，將纖維素載體加入到細胞裂解液中，實現谷氨酸脫羧酶的特異性吸附，并采用交聯劑交聯固定化谷氨酸脫羧酶。優化轉化條件，最佳的催化反應條件為，pH5.5；反應時間2h；底物L-谷氨酸鈉的濃度40g/L；固定化酶濃度8mL/L；輔酶磷酸吡哆醛濃度0.1mM。在最適反應條件下，重復連續轉化10次，底物L-谷氨酸鈉的轉化率均達到93%以上。
文檔編號C12N11/12GK102719500SQ201210233749
公開日2012年10月10日 申請日期2012年7月6日 優先權日2012年7月6日
發明者丁國鈺, 任麗梅, 余瓊林, 劉磊, 王文芳, 高智慧 申請人:天津啟仁醫藥科技有限公司