專利名稱：一種大鼠原代氣道上皮細胞的培養方法
技術領域：
本發明涉及一種細胞培養方法，是一種大鼠原代氣道上皮細胞的培養方法。
背景技術：
氣道上皮細胞作為病原微生物及炎癥介質的效應細胞，在氣道的免疫防御機制中起著重要作用。體外培養的原代上皮細胞廣泛應用于呼吸道炎癥機制、細胞癌變機制、跨膜離子轉運、呼吸道上皮電生理等許多研究領域。大鼠氣道上皮細胞原代培養的優點在于以下幾個方面1)大鼠作為目前生命科學研究領域最常見、最實用、最方便的實驗動物，標本的獲取較人標本的獲取簡單容易；2)人的標本比較珍貴，相關的實驗研究可預先在大鼠上皮細胞中進行，在得到一些前期的數據后再回歸于人，這樣可以有效的保證使用人氣道上皮細胞的實驗進展順利。3)采用大鼠·原代氣道上皮細胞氣液界面培養方法培養出來的細胞，其結構和功能更接近于體內細胞，使得體外實驗的結果能夠更加真實的反映體內的情況，利于下一步實驗的把握。但是，由于大鼠的氣道比較小，同時上皮細胞層僅有單層，因此將細胞消化下來存在一定的難度。現今培養大鼠氣道上皮細胞的方法較多，包括機械刷洗法、酶消化法和聯合消化法。在細胞消化和收集模型的制作時，一般會直接把氣道剪開，浸于消化液中消化，然后直接收集消化液中的細胞，這樣處理收到的上皮細胞純度不高，含成纖維細胞多，在培養中又不能有效抑制成纖維細胞的生長，從而影響上皮細胞的培養。另外，機械刷洗法易對細胞損傷大，而酶消化法和聯合消化法中使用較多的酶是胰酶和蛋白酶。胰酶對細胞的消化功能較強，消化時間不好控制，對細胞損傷大，影響細胞的活性；蛋白酶法的消化強度較緩和，對細胞的損傷少，但是消化不徹底，消化后獲得的細胞較少，影響后續的培養。可見，酶消化法和聯合消化法難以保證細胞的活性和數量同時達到較高的水平，后續的培養效果不能達到預期效果。現今的上皮細胞培養主要采用液體界面培養，這樣培養的細胞活性較差、分化不完全、細胞壽命短。
發明內容
本發明的目的是提供一種高效、簡便、高純度的大鼠原代氣道上皮細胞的培養方法。本發明的目的是通過以下技術方案來實現的一種大鼠原代氣道上皮細胞的培養方法，它包括以下步驟
(1)大鼠氣道組織細胞消化采用密閉管腔消化法對離體的已去除血液和里面粘液后且組織細胞具有活性的大鼠氣道進行消化處理，使氣道的上皮細胞和平滑肌層分離；
(2)收集大鼠氣道上皮細胞收集步驟(I)消化處理后的消化液，用基礎培養基清洗大鼠氣道內壁，所得的消化液和基礎培養基混合均勻，經離心獲得大鼠氣道上皮細胞；
(3)將步驟(2)中收集所得的大鼠氣道組織細胞置于鋪有膠原蛋白的培養皿中，在37°C,5% CO2常氧環境下靜置培養至獲得具有纖毛的大鼠原代氣道上皮細胞。
作為本發明的一種實施方式，所述步驟(I)的密閉管腔消化法的具體操作為向離體的已去除血液和里面粘液后且組織細胞具有活性的大鼠氣道中灌入消化液，至氣道中氣體排盡時結扎氣道遠端，然后繼續灌入消化液至氣道呈充盈狀態，封閉氣道近端，放入加有基礎培養基的培養皿內，4°C靜置消化l(T24h，使氣道上皮細胞面能與消化液充分的接觸；并且在低溫的環境下長時間的消化，既可以減少對細胞的損傷，同時能收獲較多的細胞。而由于氣道外面沒有酶液的消化，在收集細胞的時候能減少雜細胞的混入，增加了上皮細胞的純度。所述的步驟(I)中消化液采用鏈酶蛋白酶溶液,可以采用鏈酶蛋白酶與基礎培養基混合配制而成。其中，鏈酶蛋白酶的濃度通常為0. 5mg/ml lmg/ml,視消化情況適當增減。所述的鏈酶蛋白酶(pronase),為粉劑。作為本發明的一種實施方式，所述步驟(2)具體操作為取出經步驟(I)的消化處理的氣道，用吸有基礎培養基的注射器連接于氣道近端，然后剪開遠端的結扎線，同時將基礎培養基緩慢灌入氣道內，將已消化的上皮細胞沖刷下來，并在遠端收集氣道中的消化液和灌入的基礎培養基，離心，棄上清，獲得大鼠氣道上皮細胞。這樣的處理能防止雜細胞的混入，提高上皮細胞的純度；并且通過培養基的沖刷作用，能使消化的細胞脫落，便于細胞·的收集。本發明中所述步驟(I)和步驟(2)的基礎培養基采用DMEM/F-12 (Dulbcco'sModifed Eagle Medium/Factor 12)。所述步驟(3)具體操作為在所獲得的大鼠氣道上皮細胞中加入含有5%胎牛血清(FBS)的完全培養基使細胞重新懸浮，混勻獲得細胞懸液，然后將所述細胞懸液加入包被有膠原蛋白的培養皿內，加入完全培養基，置于37°C、5% CO2常氧環境下靜置培養。本發明所述的步驟(3)中的培養皿優選采用插入式培養皿，該插入式培養皿底部鋪有膠原蛋白。作為本發明的一個實施方式，插入式培養皿預處理具體操作為在插入式培養皿底部鋪150ul濃度為0. 25 lmg/ml的膠原蛋白，在超凈臺中自然風干后，在UV燈下消毒30分鐘，密封，2 8°C保存待用。在所述步驟(3)中，每個插入式培養皿內加入的細胞懸液為200u，所述的完全培養基加入量為500ul。本發明所述步驟⑶中的完全培養基采用50ml含5%胎牛血清(FBS)完全培養基，即每50ml完全培養基中含有以下成分DMEM/F_12 46. 5ml> 10mg/ml膜島素(Insulin)50ul、5mg/ml 全鐵轉鐵蛋白(Holo-Transferrin) 50ul、0. lmg/ml 霍亂毒素(CholeaToxin) 50ul、25ug/ul 表皮生長因子(Epidermal Growing Factor) 50ul、20mg/ml 牛垂體提取物(Bovine Pituitary Extracct) 0. 5ml、0. OlM 氫化可的松(Hydrocortisone)I. 5ul、0. OlM 視橫酸(Retionic Acid) 0. 25ul> 青霉素(penicillin)和鏈霉素(streptomycin)混合溶液 0. 5ml、胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)2.5ml。作為本發明的一種改進，所述步驟(3)中細胞會貼壁并生長，待細胞鋪滿整個插入式培養皿的底部時，將插入式培養皿內的培養基移去，只在培養皿的外面給予含有5%BSA(Bovine Serum Albumin)無血清完全培養基,從插入式培養皿底部供給營養,形成氣液界面培養，在培養期間定期進行細胞換液，將細胞分泌的粘液清除，培養皿的外面則更換新培養基，氣液界面培養2 3周，即可獲得具有纖毛的大鼠原代氣道上皮細胞。
本發明所述步驟(3)中，通過顯微鏡觀察和細胞表面阻力的測定等方法確定細胞是否鋪滿整個插入式培養皿的底部。而所述的細胞表面阻力的測定采用的是MILLICELLERS-2，通過測定插入式培養皿內外液體之間的阻力來判斷細胞生長情況，一般當測得電阻在1000歐姆以上時，說明細胞已經鋪滿培養皿底部。本發明所述的5%牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)無血清完全培養基采用50ml含5%BSA無血清完全培養基，即每50ml完全培養基中含有以下成分DMEM/F-12 46. 5ml、10mg/ml 膜島素(Insulin) 50ul、5mg/ml 全鐵轉鐵蛋白(Holo-Transferrin)50ul、0. lmg/ml 霍亂毒素(Cholea Toxin)50ul、25ug/ul 表皮生長因子(Epidermal GrowingFactor) 50ul、20mg/ml 牛垂體提取物(Bovine Pituitary Extracct) 0. 5ml>0. OlM 氫化可的松(Hydrocortisone) I. 5ul、0. OlM 視橫酸(Retionic Acid) 0.25ul、青霉素(penicillin)和鏈霉素(streptomycin)混合溶液 0. 5ml、60mg/ml 牛血清白蛋白(BovineSerum Albumin, BSA) 2. 5ml。本發明所述步驟(3)中在培養期間定期進行細胞換液時，可用PBS沖洗培養皿內·面將細胞分泌的粘液清除。本發明所提供的方法與現有技術相比具有以下有益效果
I.本發明采用的插入式培養皿上鋪有膠原蛋白，由于上皮細胞在膠原蛋白層上容易貼壁并且生長狀態優于普通的塑料平面，因而以膠原蛋白為支持物有利于上皮細胞的貼壁和增殖，膠原蛋白還能抑制成纖維細胞的生長，可以提高上皮細胞的純度。2.本發明中鏈酶蛋白酶的蛋白水解能力弱，采用冷凍消化法，消化時間掌握在l(T24h內能有效的減少成纖維細胞的混雜，既能獲得較多的細胞，同時也能保證細胞的活性。3.本發明中氣道上皮細胞的消化采用鏈酶蛋白酶4°C消化過夜，此方法對細胞的損傷少，消化下來的細胞具有狀態良好，活性強，易于貼壁，增殖快，不易老化等優點。4.本發明采用的培養基是無血清培養基，可有效減少血清對細胞的毒性，有利于細胞生長、增殖且細胞不易老化，同時，可以通過調節培養基里相關因子的濃度來觀察細胞的改變，便于對細胞功能的研究。5.本發明中采用氣液界面的培養方法，此方法提供的培養環境更接近體內，使得培養的細胞有良好的活性，有利于細胞的分化和纖毛的形成，保證細胞的數量和質量，便于細胞動力方面的研究。采用此方法培養的氣道上皮細胞，其功能更接近在體細胞，為進一步研究呼吸道炎癥、呼吸道粘液高分泌以及來源于氣道上皮細胞的腫瘤等疾病的發病機制奠定了實驗基礎，提供了適宜的實驗材料來源。因此本法培養出來的細胞能為體外實驗提供良好的工具，使得實驗的結果更具真實性和可靠性。
圖I是普通倒置相差顯微鏡(40X )下細胞消化下來培養4天后的顯微圖。圖2是普通倒置相差顯微鏡(40 X )下氣道上皮細胞角蛋白免疫組化 其中a :角蛋白免疫細胞染色，DAB顯色，上皮細胞的細胞質呈棕黃色；b :為陰性對照。圖3是普通正立式顯微鏡(40X )觀察采用插入式培養皿底部膜片制作的石蠟切片的HE染色圖。
圖4是普通正立式顯微鏡(100X )觀察采用插入式培養皿底部膜片制作的石蠟切片的HE染色圖。
具體實施例方式 下面結合實例及附圖對本發明作進一步的詳細闡述，但本發明的實施方式不限于此，根據本發明的上述內容，結合本領域的普通技術知識和慣用技術手段，在不脫離本發明上述基本技術思想前提下，可以衍生出其它多種形式的修改、替換或變更。實施例一
(一)主要實驗材料 (I)基礎培養基DMEM/F-12。(2)含5%FBS完全培養基，即每50ml完全培養基中含有以下成分DMEM/F_12·46. 5ml> 10mg/ml 膜島素(Insulin) 50ul、5mg/ml 全鐵轉鐵蛋白(Holo-Transferrin)50ul、0. lmg/ml 霍亂毒素(Cholea Toxin) 50ul、25ug/ul 表皮生長因子(EpidermalGrowing Factor) 50ul>20mg/ml 牛垂體提取物(Bovine Pituitary Extracct) 0.5ml、0. OlM 氫化可的松(Hydrocortisone) I. 5ul 0. OlM 視橫酸(Retionic Acid) 0. 25ul、青霉素(penicillin)和鏈霉素(streptomycin)按體積比I: I混合的溶液0. 5ml、胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)2.5ml00(3)含5%BSA無血清完全培養基，即每50ml完全培養基中含有以下成分DMEM/F-12 46. 5ml、10mg/ml 膜島素(Insulin) 50ul、5mg/ml 全鐵轉鐵蛋白(Holo-Transferrin)50ul、0. lmg/ml 霍亂毒素(Cholea Toxin) 50ul、25ug/ul 表皮生長因子(EpidermalGrowing Factor) 50ul、20mg/ml 牛垂體提取物(Bovine Pituitary Extracct) 0.5ml、0. OlM 氫化可的松(Hydrocortisone) I. 5ul、0. OlM 視橫酸(Retionic Acid) 0. 25ul、青霉素(penicillin)和鏈霉素(streptomycin)按體積比1:1混合的溶液0. 5ml、60mg/ml牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA) 2. 5ml。(4)消化液鏈酶蛋白酶(pronase)，為粉劑，采用DMEM/F-12對其進行溶解，配置成濃度為0. 5mg/ml工作液。(5) 細胞培養皿插入式培養皿，事先在每個皿內加入150ul濃度為0. 5mg/ml的膠原蛋白進行包被，將其晾干后在UV燈下消毒30分鐘，密封后置于2l°C保存待用。(6)細胞表面阻力測定MILLICELL ERS-2。( 二)操作步驟 獲取大鼠原代氣道上皮細胞
(I)大鼠氣道組織細胞消化取離體的組織細胞具有活性的大鼠氣管，沖洗干凈內外的血液及內壁的粘液，將已裝有Iml消化液的注射器與硅膠管相連，然后將其內的消化液緩慢注入氣管。當消化液充滿整條氣管段時將遠端結扎，繼續注入消化液使其達到一個合適的充盈狀態后堵塞硅膠管口，使氣道內的消化液無法漏出。將取得的氣管段標本放入加有基礎培養基的細胞培養皿中，于4°C消化10 24h。(2)收集大鼠氣道上皮細胞取出消化過夜的氣管段，棄去過夜培養基，使用新基礎培養基將氣管段外壁沖洗3次，打開硅膠管口，并連接裝有IOml基礎培養基的注射器，然后剪開氣道遠端結扎處，收集消化液，并通過注射器把基礎培養基注入氣管，將消化的上皮細胞沖刷下來，將消化液和基礎培養基混合均勻后置于在15ml的離心管中，1000rpm/min離心5min后,棄上清,獲得大鼠氣道上皮細胞。(3)培養具有纖毛，功能更接近體內細胞的大鼠原代氣道上皮細胞
在細胞沉淀中加入3ml的含5%FBS完全培養基使細胞重新懸浮，混勻，將混勻后的細胞懸液加入包被有膠原蛋白的插入式培養皿內，每個插入式培養皿約加入200ul細胞懸液，每個培養皿外加入500ul完全培養基，置于37°C、5% CO2常氧細胞培養箱內靜置培養，細胞貼壁后每2天換液一次。消化下來的氣道上皮細胞培養約5天后，在倒置顯 微鏡下可觀察到細胞已經鋪滿整個插入式培養皿的底部，使用ERS-2檢測細胞表面的阻力，阻力大于1000歐姆，說明細胞已經覆蓋整個培養皿底部，細胞層已可將培養皿內外培養基完全隔離開，此時，將培養皿內培養基移去，只在培養皿外給予含有5%BSA無血清完全培養基，從底部供給營養，形成氣液界面培養。一般8天左右細胞即可分泌粘液，因此每次細胞換液時，培養皿內細胞面用PBS沖洗3次，將細胞分泌的粘液去除，培養皿外則只需更換培養基無需沖洗，一般培養2周左右后，細胞上層粘液洗去后，可于40高倍倒置顯微鏡下可觀察到纖毛擺動。(三)培養結果
(I)倒置相差顯微鏡下觀察，剛接種的細胞圓形、透亮，呈團狀，并且由于纖毛的擺動，細胞團不斷的游動和翻滾；一般接種培養2 3天后，大部分細胞已經貼壁，展開的細胞呈形態多樣、大小較均一、鋪石路樣片狀生長；繼續培養，散在的片狀細胞團將慢慢匯合，一般5飛天可以鋪滿整個培養皿，并最終連成一片將培養皿的底部全部覆蓋(圖I);培養3周后的原代上皮細胞，用PBS沖洗去除細胞分泌的粘液后，在40高倍倒置顯微鏡下觀察，可以見到纖毛的不規則擺動，并且，隨著培養時間的延長，分化出纖毛的細胞的數量將逐漸增加。(2)細胞免疫組化鑒定用羊抗鼠角蛋白單克隆抗體進行免疫組化鑒定，DAB顯色。可見，上皮細胞的細胞質呈棕黃色，細胞核為深藍色(圖2)。在光鏡下計數陽性著色細胞數。純度(％)=陽性著色細胞數/細胞總數XlOO %，重復3次取平均值。每張片隨機選取5個視野，每個視野至少檢測200個細胞。計算每個視野中上皮細胞的純度，平均達95%以上。(3)將插入式培養皿的底部的膜片取出，按病理切片的方法將其包埋切片，然后進行染色(圖3、圖4)，圖片顯示細胞間緊緊相連，細胞成柱狀單層生長，細胞核靠近基地部，胞漿豐富。上述實施例只是本發明其中一個實施方式，在本發明中只要在細胞培養時采用包被膠原蛋白的培養皿進行培養，即可獲得純度較高的大鼠氣道上皮細胞，所以氣道組織細胞消化采用常規機械洗法、酶消化法或胰酶和蛋白酶聯合消化法進行消化，采用常規方法收集大鼠氣道上皮細胞，所得到的培養結果與實施例一的培養結果基本相同。消化液的鏈酶蛋白酶的濃度在0. 5mg/ml lmg/ml范圍內，采用0. 5mg/ml、0. 6mg/ml、0. 7mg/ml、0. 8mg/ml、0. 9mg/ml或lmg/ml濃度都可以獲得良好的消化結果，獲得較多的活性細胞。消化時間在10 24h范圍內，對氣道組織進行10h、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h、20h、21 h、22 h、23 h或24h消化都能獲得較多的活性細胞。本發明所采用的培養基并不僅限于實施例一所列舉的培養基，采用可用于上皮細胞培養的常規的培養基，也能夠達到良好的培養效果。
本發明可用其他的不違背本發明的精神或主要特征的具體形式來概述。本發明的上述實施例都只能認為是對本發明的說明而不是限制。凡是依據本發明的實質技術對以上 實施例所作的任何細微修改、等同變化與修飾，均屬于本發明技術方案的范圍內。
權利要求
1.一種大鼠原代氣道上皮細胞的培養方法，其特征是，包括以下步驟 (1)大鼠氣道組織細胞消化采用密閉管腔消化法對離體的組織細胞具有活性的去除血液和里面粘液后的大鼠氣道進行消化處理，使氣道的上皮細胞和平滑肌層分離； (2)收集大鼠氣道上皮細胞收集步驟(I)消化處理后的消化液，用基礎培養基清洗大鼠氣道內壁，所得的消化液和基礎培養基混合均勻，經離心獲得大鼠氣道上皮細胞； (3)將步驟(2)中收集所得的大鼠氣道組織細胞置于鋪有膠原蛋白的培養皿中，在37°C,5% CO2常氧環境下靜置培養至獲得具有纖毛的大鼠原代氣道上皮細胞。
2.根據權利要求I所述的大鼠原代氣道上皮細胞的培養方法，其特征是，所述步驟(3)具體操作為在所獲得的大鼠氣道上皮細胞中含有5%胎牛血清的完全培養基使細胞重新懸浮，混勻，然后將混勻后的細胞懸液加入包被有膠原蛋白的培養皿內，加入完全培養基，置于37°C、5% CO2常氧環境下靜置培養。
3.根據權利要求I或2所述的大鼠原代氣道上皮細胞的培養方法，其特征是，所述的步驟(3)中的培養皿采用插入式培養皿，該插入式培養皿底部鋪有膠原蛋白。
4.根據權利要求3所述的大鼠原代氣道上皮細胞的培養方法，其特征是，每個插入式培養皿內加入的細胞懸液為200u，所述的完全培養基加入量為500ul。
5.根據權利要求4所述的大鼠原代氣道上皮細胞的培養方法，其特征是，所述步驟(3)中細胞會貼壁并生長，待細胞鋪滿整個插入式培養皿的底部時，將內層的培養基移去，只在培養皿的外面給予含有5%BSA無血清完全培養基，從插入式培養皿底部供給營養，形成氣液界面培養，在培養期間定期進行細胞換液，將細胞分泌的粘液清除，培養皿的外面則更換
6.根據權利要求I所述的大鼠原代氣道上皮細胞的培養方法，其特征是，所述步驟(3)中的完全培養基采用含5%胎牛血清完全培養基，即每50ml完全培養基中含有以下成分DMEM/F_12 46. 5ml> 10mg/ml 膜島素 50ul、5mg/ml 全鐵轉鐵蛋白 50ul、0. lmg/ml 霍亂毒素50ul、25ug/ul表皮生長因子50ul、20mg/ml牛垂體提取物O. 5ml、0. OlM氫化可的松I.5ul、0. OlM視磺酸O. 25ul、青霉素和鏈霉素混合溶液O. 5ml、胎牛血清2. 5ml ； 所述的5%牛血清白蛋白無血清完全培養基采用含5%BSA無血清完全培養基，即每50ml完全培養基中含有以下成分DMEM/F_12 46. 5ml> 10mg/ml胰島素50ul、5mg/ml全鐵轉鐵蛋白50ul、0. lmg/ml霍亂毒素50ul、25ug/ul表皮生長因子50ul、20mg/ml牛垂體提取物O.5ml,O. OlM氫化可的松I. 5ul、0. OlM視磺酸O. 25ul、青霉素和鏈霉素混合溶液O. 5ml、60mg/ml牛血清白蛋白2. 5ml。
7.根據權利要求I所述的大鼠原代氣道上皮細胞的培養方法，其特征是，所述的步驟(I)中消化液采用O. 5mg/mflmg/ml鏈酶蛋白酶溶液。
8.根據權利要求I所述的大鼠原代氣道上皮細胞的培養方法，其特征是，所述步驟(2)具體操作為取出經步驟(I)的消化處理的氣道，用吸有基礎培養基的注射器連接于氣道近端，然后剪開遠端的結扎線，同時將基礎培養基緩慢灌入氣道內，將已消化的上皮細胞沖刷下來，并在遠端收集氣道中的消化液和灌入的基礎培養基，離心，棄上清，獲得大鼠氣道上皮細胞。
9.根據權利要求I所述的大鼠原代氣道上皮細胞的培養方法，其特征是，所述步驟(I)的密閉管腔消化法的具體操作向離體的組織細胞具有活性的去除血液和里面粘液后的大鼠氣道中灌入消化液，至氣道中氣體排盡時結扎氣道遠端，然后繼續灌入消化液至氣道呈充盈狀態，封閉氣道近端，放入加有基礎培養基的培養皿內，4°C靜置消化l(T24h。
10.根據權利要求8或9所述的大鼠原代氣道上皮細胞的培養方法，其特征是，所述步驟⑴和步驟(2)的基礎培養基采用DMEM/F-12。
全文摘要
本發明公開了一種大鼠原代氣道上皮細胞的培養方法，包括以下步驟(1)大鼠氣道組織細胞消化；(2)收集大鼠氣道上皮細胞收集步驟(1)消化處理后的消化液以及清洗的大鼠氣道內壁的基礎培養基，經離心獲得大鼠氣道上皮細胞；(3)將步驟(2)中收集所得的大鼠氣道組織細胞置于鋪有膠原蛋白的培養皿中，在37℃、5％CO2常氧環境下靜置培養至獲得具有纖毛、功能更接近體內細胞生活狀態的大鼠原代氣道上皮細胞。本發明可以提高上皮細胞的純度，細胞具有狀態良好，活性強。
文檔編號C12N5/071GK102787095SQ20121023324
公開日2012年11月21日 申請日期2012年7月6日 優先權日2012年7月6日
發明者盧文菊, 張晨婷, 張雅潔, 徐小明, 王健 申請人:呼吸疾病國家重點實驗室, 廣州醫學院第一附屬醫院