專利名稱：人游離dna完整性的檢測方法
技術領域：
本發明涉及ー種人游離DNA完整性的檢測方法。
背景技術：
游離DNA是ー種無細胞狀態的胞外DNA，可存在于血液、腦脊液、胸腹水等體液中。正常人體內游離DNA主要由細胞凋亡后釋放入循環系統，通過此途徑釋放的游離DNA由于經過程序化酶切后，大部分DNA片段大小都在185-200bp之間。與之相反，通過細胞壞死、裂解和主動釋放等途徑外排出的DNA片段，大小在200-400bp之間。尋求快速、準確的人游離DNA完整性檢測方法是現階段亟待解決的問題
發明內容
本發明的目的在于提供一種準確、方便的人游離DNA完整性的檢測方法。本發明的技術解決方案是ー種人游離DNA完整性的檢測方法，其特征是包括下列步驟(I)引物設計用引物設計軟件針對人類ALU序列分別設計長、短片段的引物，引物序列為
引物名稱上游引物ド游引物
_7]5'-CCT GAG GTC AGG AGT TCG 5'-CCC GAG TAG CTG GGA TTA CA
M L-I 15bp
AG-3’-3,
ALlJ-247bp 5,-GTG GCT CAC GCC TGT AAT C S1-CAG GCT GGA GTG CAG TGG -3'
_3,其中ALU-115bp對應的擴增產物為短片段產物，大小為115bp ；ALU-247bp對應的擴增產物為長片段產物，大小為247bp ；(2)提取人游離DNA;(3)采用步驟(I)設計的兩對引物對步驟(2)提取的樣本分別進行實時熒光PCR檢測。步驟(2)具體方法為取人血清樣本200 ii I，采用試劑盒提取游離DNA。步驟(3)中，所述實時熒光PCR檢測的反應體系為20 ii 1，包括SYBR'V’ PremixEx TaqTM (2X ) IOu I, ROX Reference Dye II (50X ) 0. 4 ii 1，步驟(I) 10 ii M 上游引物0. 4iil，步驟(I) 101^下游引物0.4111，0嫩模板2.0111，滅菌雙蒸水6.8111。步驟(3)中，實時熒光PCR檢測的反應程序為95°C預變性30sec，95°C變性5sec，60で退火31 sec，72で延伸32sec，循環40次。本發明針對人類ALU重復序列設計特異性長、短片段引物，建立人類ALU重復序列的長、短片段的實時熒光定量PCR檢測方法，可以快速、準確檢測人游離DNA完整性。
下面結合附圖和實施例對本發明作進ー步說明。圖I是本發明的引物ALU-115bp和ALU-247bp在人ALU基因上的位置示意圖。圖2是待測樣本DNA的ALU-247bp實時熒光PCR擴增曲線。圖3是待測樣本DNA的ALU_247bp實時熒光PCR溶解曲線。
圖4是基因組DNA標準品倍比稀釋獲得的標準曲線。
具體實施例方式
權利要求
1.ー種人游離DNA完整性的檢測方法，其特征是包括下列步驟 (1)引物設計 用引物設計軟件針對人類ALU序列分別設計長、短片段的引物，引物序列為
2.根據權利要求I所述的人游離DNA完整性的檢測方法，其特征是步驟(2)具體方法為取人血清樣本200 u I，采用試劑盒提取游離DNA。
3.根據權利要求I或2所述的人游離DNA完整性的檢測方法，其特征是步驟(3)中，所述實時熒光PCR檢測的反應體系為20 iil，包括S YBRwPremix Ex TaqTM (2X)10u I,ROX Reference Dye II (50 X )0. 4 y 1，步驟(I) 10 y M 上游引物 0. 4 y 1，步驟(I) 10 y M 下游引物0. 4 ill，DNA模板2. 0 ill，滅菌雙蒸水6. 8 ill。
4.根據權利要求3所述的人游離DNA完整性的檢測方法，其特征是步驟(3)中，實時熒光PCR檢測的反應程序為95°C預變性30sec，95°C變性5sec，60°C退火31sec，72°C延伸32sec，循環40次。
全文摘要
本發明公開了一種人游離DNA完整性的檢測方法，包括引物設計、提取人游離DNA、采用引物對提取的樣本進行實時熒光PCR檢測。本發明針對人類ALU重復序列設計特異性長、短片段引物，建立人類ALU重復序列的長、短片段的實時熒光定量PCR檢測方法，可以快速、準確檢測人游離DNA完整性。
文檔編號C12Q1/68GK102732631SQ201210230830
公開日2012年10月17日 申請日期2012年7月4日 優先權日2012年7月4日
發明者呂成林, 吳信華, 戚菁, 施煒, 施維, 景蓉蓉, 朱慧, 王志偉, 申嫻娟, 陸玉華, 陳建, 鞠少卿 申請人:南通大學附屬醫院