專利名稱：一株生物合成3β,7α,15α-三羥基雄甾-5-烯-17-酮的菌株及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域,具體涉及一株赤霉菌intermedia)CA3-1及其轉化去氫表雄酮為3 β，7 α，15 α -三羥基雄甾_5_烯_17_酮的方法。
背景技術：
優思明是一款由雌激素與孕激素復合而成的復方短效口服避孕藥，含有的主要成分屈螺酮可以有效對抗口服避孕藥中雌激素所引起的發胖的問題。3 β，7 α，15 α -三羥基雄甾-5-烯-17-酮則是生產屈螺酮的重要醫藥中間體，其生產方式主要有傳統的化學合成 法、半合成法、生物轉化法三類。生物轉化法一般通過微生物轉化羥化去氫表雄酮(DHEA)生成3 β，7 α，15 α -三羥基雄留_5_烯_17_酮，相比于化學方法減少了合成步驟、降低了能耗，并大幅削減了污染物的排放，屬于先進的清潔生產工藝路線。目前，據報道有刺盤胞屬(OiricA )、鐮刀菌屬(/7W1Sari )、支頂孢屬(Acremonium)以及黑孢子菌屬iNigrospora)有7 α和15 α輕化能力，能將去氫表雄酮轉化為3 β，7 α，15 α -三羥基雄留_5_烯_17_酮，但是普遍轉化率不高，只有40 70%，且底物投料濃度較低，一般為I飛g/L，工業成本較高。因此，自主篩選出一株能高效轉化DHEA生成3 β，7 α，15 α -三羥基雄留_5_烯_17_酮有很高的工業價值。
發明內容
本發明的目的在于提供一株高效轉化DHEA的赤霉菌iGibberella intermedia')CA3-1，以及利用該菌株轉化DHEA為3β，7α，15 α -三羥基雄留_5_烯_17_酮的方法，可達到高底物投料濃度、高產物得率的要求，并且菌種生長周期也較短。本發明的發明人從本實驗室的菌種保藏庫篩選獲得一株赤霉菌iGibberella
CA3-1，該菌于2011年5月24日保藏在位于北京市朝陽區北辰西路I號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 4903。應用上述微生物轉化DHEA生產3 β，7 α，15 α -三羥基雄甾_5_烯_17_酮的方法，其步驟如下
(1)采用保藏號為CGMCCNo. 4903的赤霉菌(GiMerdJa intermediaΧΑ3-1為生產菌種，按照常規方法進行活化培養得到種子液，將該種子液劃線于PDA培養基上培養3飛天；
(2)制備CA3-1菌株的種子液挑取步驟(I)的PDA固體培養基上的CA3-1菌株一環，接種于已滅菌的裝有8(Tl00mL種子培養基的500 mL錐形瓶中，培養溫度為25 35°C，置搖床上以15(T250 r/min的轉速培養12 20h至對數生長中后期，即得到CA3-1菌株的種子培養液；
(3)菌體培養將步驟(2)中制備好的細胞液體培養物以4 8%(v/v)的接種量接入發酵培養基，裝液量為250 mL錐形瓶中裝2(T60 mL發酵培養基，培養溫度為25 32°C，在150^220 r/min的轉速下培養2(T24 h，得菌體培養液。
(4)生物轉化精確稱取適量DHEA，投入步驟(3)中的菌體液，使其終濃度為5_8g/L,在轉化溫度26 30°C，200^220 r/min的轉速下轉化36 60h，即得轉化液。(5)產物檢測將步驟(4)的轉化液等體積乙酸乙酯抽提3次，合并抽提液后于離心濃縮儀中離心至有白色晶體出現，乙腈復溶晶體并通過O. 22 μ m的有機膜過濾除雜，濾液利用高效液相色譜法分析DHEA和3 β，7 α，15 α -三羥基雄留_5_烯_17_酮的含量。HPLC條件為色譜儀戴安Ultimate 3000 ;色譜柱C18柱；檢測器Ultimate 3000 variablewavelength detector ;流動相乙腈:水=70:30 ;流速0. 5mL/min ;進樣量10 μ L ;柱溫30。。。其中步驟(I)中所述的PDA培養基的成分及配比為土豆20(T500 g/L;葡萄糖3(T50 g/L;酵母粉5 10 g/L;瓊脂粉15 20 g/L ;pH自然，在121 °C高壓蒸汽下滅菌20min;步驟(2)所述種子培養基的成分及配比為葡萄糖20 50 g/L ;NaCI Γ5 g/L ;酵母粉 l(T30g/L ；K2HPO4 O. Γ5. O g/L ；FeS047 H2O O. θΓθ. lg/L ;滅菌前調培養基的 pH至6. 5-7. 5，在121°C高壓蒸汽下滅菌20min ;步驟(3)所述轉化培養基的成分及配比為葡萄糖 20 50 g/L ;酵母粉 10 30g/L ;NaCl O. 2 2 g/L ；Κ2ΗΡ04 O. Tl. O g/L ；FeS047 H2O·
0.θΓθ. 10 g/L ；pH 6. 5-7. 5，121°C高壓蒸汽下滅菌 20 min。本發明所述的赤霉菌(( iM6 r(977a in termedia ) CA3-1菌株首次發現可轉化DHEA生成3 β，7 α，15 α -三羥基雄留_5_烯_17_酮，并且能達到高底物投料量、高底物轉化率、高產物得率的要求，是一株極具開發研究價值的生產菌株。
圖I為去氧表雄麗在本發明赤霉菌i/7i<9_/s (9￡/ia)CA3-l菌體培養液中轉化的高效液相色譜圖。圖2為本發明的赤霉菌iGibberella intermedia') CA3-1在發酵培養基中轉化DHEA的過程研究。
具體實施例方式實施例I菌種的活化以及篩選。將實驗室_80°C保存的菌種甘油管，加入到IOmL的種子培養基進行活化培養。再轉接到種子培養基，裝液量為250 mL錐形瓶中裝30 mL培養2天得種子液。分別以4%接種量接種于發酵培養基中，裝液量為250 mL錐形瓶中裝30 mL, 30°C, 220 r/min培養24小時。準確稱取3g/L的DHEA投入到菌體培養液中，相同條件下轉化60小時。提取轉化液，HPLC分析。結果表明只有赤霉菌iGibberella in termedia ) CA3-1對DHEA有轉化能力，且能生成產物3 β，7 α，15 α -三羥基雄甾_5_烯_17_酮。實施例2 赤霉嵐 QGibberella) CA3-1 轉化 DHEA。(I)將接種菌種的PDA斜面置于30°C的恒溫培養箱中，培養4天，得到成熟的孢子，用接種環挑一環菌絲接種于裝有IOOmL種子培養基的500mL搖瓶中，在28°C，220rpm搖床上培養I天，得到適于接種的種子培養液；
(2)將種子培養液以4%的接種量接入裝有30mL發酵培養基的250mL的搖瓶中，以相同條件繼續培養20小時，得到菌體發酵液；(3)將去氫表雄酮投入到菌體發酵液中，投料濃度為3. Og/L，相同條件下轉化60小時放瓶。提取產物進行HPLC分析，得到轉化率為90. 08%。實施例3:
(I)斜面培養、種子培養以及發酵培養同實施例I。(2)將去氫表雄酮投 入到菌體發酵液中，投料濃度為5. Og/L，相同條件下轉化60小時放瓶。提取產物進行HPLC分析，得到轉化率為84. 08%。實施例4
(I)斜面培養、種子培養以及發酵培養同實施例I。(2)將去氫表雄酮投入到菌體發酵液中，投料濃度為8. Og/L，相同條件下轉化60小時放瓶。提取產物進行HPLC分析，得到轉化率為68. 23%。
權利要求
1.一株高效轉化去氫表雄酮生成3 β，7 α，15 α -三羥基雄留_5_烯_17_酮的菌株，該菌株為赤霉菌IGibberella i/ i6 r i ￡/ia)CA3-l,保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 4903，保藏日期為2011年5月24日。
2.利用赤霉菌iGibberellain termedi a ) CA3-1轉化去氧表雄麗為3β，7α，15α -三羥基雄留-5-烯-17-酮的方法，其特征為 Cl)將赤霉菌作為生產菌種從斜面上接入到種子培養基中，25 35°C，15(T250 r/min培養12 20h，得到種子液；種子培養基組成是葡萄糖2(T50 g/L ；NaCl Γ5 g/L ;酵母粉 10 30g/L ；K2HPO4 O. Γ5. O g/L ；FeS04*7 H2O 0. θΓθ. lg/L ;滅菌前調培養基的 pH 至,6.5 7. 5,在121°C高壓蒸汽下滅菌20min ； (2)將種子以Γ8%(v/v)的接種量接入轉化培養基，裝液量為250 mL錐形瓶中裝20 60 mL發酵培養基，培養溫度為25 32°C，在150 220 r/min的轉速下培養20 24 h，得菌體培養液；發酵培養基組成為葡萄糖20 50 g/L;酵母粉l(T30g/L;NaCl O. 2 2 g/L ; K2HPO4O.Γ . O g/L ;FeS04.7 H2O 0. θΓθ. 10 g/L ；pH 6. 5-7. 5，121°C高壓蒸汽下滅菌 20 min ； (3)稱取一定量的去氫表雄酮加入到菌體培養液中轉化36飛0h，得到轉化液。
全文摘要
本發明屬生物技術領域，涉及一株高效轉化去氫表雄酮的赤霉菌(Gibberellaintermedia)CA3-1及其應用，該菌株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo.4903。赤霉菌(Gibberellaintermedia)CA3-1能轉化去氫表雄酮為3β,7α,15α-三羥基雄甾-5-烯-17-酮，在底物投料量為5.0g/L的條件下，底物轉化率高達90%左右，產物得率80%左右，對生物轉化法生產甾體藥物有重要意義。
文檔編號C12P33/12GK102965288SQ20121023053
公開日2013年3月13日 申請日期2012年7月5日 優先權日2012年7月5日
發明者李會, 許正宏, 付珍珍, 史勁松, 張旦旦 申請人:江南大學