蟲草屬真菌指紋圖譜的建立方法及其標準指紋圖譜的制作方法
【專利摘要】本發明涉蟲草屬不同產品形式蟲草真菌核苷類成分HPLC指紋圖譜建立的方法及其標準指紋圖譜。色譜柱為Agilent?Zorbax?Extend?C18(250mm×4.6mm，5μm)，柱溫25℃，檢測波長260nm，流動相為甲醇-水系統，采用梯度洗脫方式，得到蟲草子座、菌絲體和子實體的核苷類成分HPLC指紋圖譜。通過六種蟲草真菌的子座、菌絲體和子實體HPLC指紋圖譜的對比，分別確定三種形式蟲草的共有指紋特征，得到標準指紋圖譜，并對共有指紋峰定性與定量。本發明的優點是方法簡便、穩定、精密度高、重現性好，能從不同形式蟲草的整體色譜特征上準確地反映蟲草真菌的品質情況。可將其作為蟲草質量控制及鑒別的指標之一。
【專利說明】蟲草屬真菌指紋圖譜的建立方法及其標準指紋圖譜
【技術領域】
[0001]本發明涉及蟲草屬真菌的鑒別評價方法，具體的說是用高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜來鑒別評價蟲草真菌的方法，屬于藥物分析【技術領域】。
【背景技術】
[0002]蟲草屬(Cordycep s)屬于真菌門、子囊菌亞門、核菌綱、麥角菌目、麥角菌科。本屬真菌絕大多數能感染昆蟲，并從其頭部或體表長出子座體而構成蟲、菌復合體一蟲草。當前蟲草屬真菌的應用形式主要有三種:ー種是原生態的蟲草復合體(根據中國藥典和中國真菌志的定義，蟲草復合體由子座和菌核組成。菌核指長滿菌絲的蟲體，而子座是指在菌核上長出的“草”)，第二種是人工培養基栽培的子實體(即蟲草無性型在人工培養基上栽培得到的“草”，以下簡稱子實體)，第三種是發酵菌絲體(即蟲草無性型繁殖體)。目前，對蟲草屬真菌及其產品的鑒定評價，主要是采用高效液相色譜法測定其腺苷的含量，不低于
0.01% (中國藥典，2005版一部75頁)。指標單一而不具特異性，再加上蟲草屬真菌的有效成分種類繁多，僅以腺苷作為蟲草質控指標，無法客觀反映蟲草屬真菌的質量，更不能對蟲草屬真菌進行鑒別。中藥指紋圖譜能基本反映中藥全貌，使其質控指標由原有的對單ー成分含量的測定上升為對整個中藥內在品質的檢測，實現對中藥內在質量的綜合評價和整體物質的全面控制。但當前的文獻集中于人工蛹蟲草和冬蟲夏草的指紋圖譜的研究，所采用品種單一，產品形式沒有區分，所采用方法不統一，造成結果沒有可比性及其可評價性。所報道的也是單一品種的圖譜(欒蘭等，2010 ;于榮敏等2007，張紅霞，2009)，缺乏品種之間的成分對比和含量分析。無法針對當前種類繁多、形式多祥的蟲草屬真菌及其產品的質量進行有效的評價。鑒于此，建立ー種涵蓋多種蟲草屬真菌及不同形式蟲草屬真菌的鑒別評價方法對蟲草屬真菌進行進行全面準確的判定，具有重要的實際意義。目前，已有研究者在中藥質量控制中提出這一概念(Xin-miao Liang, et al.Journal of ChromatographyA.2009,1216:2033~2044)，還有專利:ー種中藥丹參的鑒別方法等。為解決蟲草屬真菌的鑒別評價與質控問題， 申請人:對 目前用于市場的蟲草屬真菌品種進行了不同產品形式的蟲草屬真菌產品進行指紋圖譜研究，并建立標準方法。目前已經開發應用的蟲草屬真菌主要有6種，并且也是全部可以回接寄主驗證其無性型的真菌，其基本生物學特征和遺傳特性如下:
[0003]冬蟲夏草(Cordyceps sinensis)為蟲草屬，無性型為中華被毛孢(Hirsutellasinensis)，是最具藥用價值的蟲草菌，但資源稀缺，是當前消費者追逐的熱點產品。其基因序列:CGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCCTTATCGAGTCACCACTCCCAAACCCCCTGCGAACACCACAGCAGTTGCCTCGGCGGGACCGCCGGCGCCCCAGGGCCCGACCAGGGCGCCCGCCGGAGGACCCCCAGACCCTCCTGTCGCAGTGGCATTTNNCAGTCAAGAAGCAAGCAAATGAATC。
[0004]蛹蟲草(Cordyceps militaris)為蟲草屬，無性型為蛹擬青霉(Paecilomycesmilitaris)。蛹蟲草富含的蟲草素具有獨特藥理作用，是冬蟲夏草的主要代替品，當前市場上大多數蟲草產品是以蛹蟲草為原料的。其基因序列:ACCCTTTGTGAACATACCTATCGTTGCTTCGGCGGACTCGCCCAGCGCCTGGACGCGGGCCTGGGCGGCGGCCGTCGGGGGCCCCAAACACTGTATCTACCAGTTTTTCTGAATCCGCCGCAAGGCAAAACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGACGTCCCCTGGGGGATGTCGGCGTTGGGGACCGGCAGCACACCGCCGCCCCCGAAATGAAGTGGCGGCCCGTCCGCGGCGACCTCTGCGTAGTACCCCAACTCGCACCGGGAACCCGACGTGGCCACGCCGTAAAACGCCCAACTCTGAACGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGGCGGAGGAA。
[0005]球抱蟲草(Cordyceps bassiana)為蟲草屬，無性型為球抱白僵菌(Beauveriabassiana)。與傳統中藥僵蠶在化學成分和藥用功效上相似，具有潛在藥用價值。其基因序列:TATTCGAGGTCACGTTCAGAAGTTGGGTGTTTTACGGCGTGGCCGCGTCGGGGTTCCGGTGCGAGCTGTATTACTACGCAGAGGTCGCCGCGGACGGGCCGCCACTCCATTTCAGGGCCGGCGGTGTGCTGCCGGTCCCCAACGCCGACCTCCCCAAGGGGAGGTCGAGGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATGCTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGGATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAGCCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTGTTTTGCCTTGCGGCGTATTCAGAAGATGCTGGAATACAAGAGTTTGAGGTCCCCGGCGGGCCGCTGGTCCAGTCCGCGTCCGGGCTGGGGCGAGTCCGCCGAAGCAACGATAGGTAGGTTCACAGAAGGGTTGGGGAGTTGAAAACTCGGTAATGATCCCTCCGCTGGTTCACCAACGGAGACCTTGTTACGACTTTTTACTTCCCA。
[0006]高雄山蟲草(Cordyceps takaomontana)為蟲草屬，無性型為日本擬青霉(Paecilomyces japonica)。韓國和日本對高雄山蟲草研究較多，并將其作為冬蟲夏草的替代物進行了開發利用。其基因序列:TGGGGTGTCTACCTGATCCGAGGTCACGITCAGAGGITGGGGGITTCACGGCGGGCCGCGTCGGGTTCCCGGTGCGAGTGCTTGTACTGCGCAGAGGTCGCCGCGGACGGGCCGCCACTCCATTTCAGGGCCGGCGGGGTGCTGCCGGTCCCCAAGGCCGACGTCCCGGGGGACGTCGAGGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATGCTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACGGAATTCTGCAATTCACATTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCGTTTGTGTTGCCTTGCGGCGGATTCAGAGAGGCTGACAGATACAGGGTTGCGTGGTCCCCGGCGGCCGCCTGGGTCCAGGTCGCGGGCCGGCGCTGGGCCGTCCGGACG`CTGGGGCGGGTCCGCCGAAGCAACTATGGGTAGGTTCACAGAAGGGTTGGGAGTTGTAAAACTCTGGTAATGATCCCTCCGCTGGTTCACCAACGGAGACCTTGTTACGATTTTTTACTTCCo
[0007]蟲花(Isaria farinose)為蟲草屬，無性型為粉質擬青霉(Paecilomycesfarinosus)，是蟲草中較為特殊的ー類，也歸為棒束孢屬(Isaria)。其基因序列:TGTGGGGCATTCTACTGATCCGAGGTCAACGTTCAGAAGTCGGGGGTTTTACGGCGTGGCCACGTCGGGGTTCCGGTGCGAGTTGGATTACTACGCAGAGGTCGCCGCGGACGGGCCGCCACTTCATTTCGGGGCCGGCGGTATACGGCCGGTCCCCAACGCCGATTTCCCCAAAGGGAAGTCGAGGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATGCTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTGTGTTGCCTTGCGGCGGATTCAGAAGATACTGAGAATACAGAGTTTGGGGGTCTCCGGCGGCCGCCTGGATCCAGGCCGCGGCCGGCGCGGGGCCGGCCGGACGCTGGGGCGAGTCCGCCGAAGCAACGATAGGTATGTTCACAGAAGGGTTTGGGAGTTGAAAACTCGGTAATGATCCCTCCGCTGGTTCACCAACGGAGACCTTGTTACGATTTTTTACTTCCA。
[0008]古尼蟲草(Cordyceps gunnii)屬蟲草屬，無性型為古尼擬青霉(Paecilomycesgunnii)，是繼冬蟲夏草后又ー種重要的蟲草資源。其外形與冬蟲夏草較為相似，與其他蟲草不同的是其在鎮痛、促進睡眠和記憶カ等方面具有良好的活性。其基因序列:CATTACCGAGTTTTCTACAACTCCCAAACCCCTGTGAACTTATACCTATACTGTTGCTTCGGCGGGTCTTTGCCCCGGGGACGGACAGGGAGCCGGCAACGGCCCCCCTGGAAACCCCCCGGAACCAGGCGCTCGCCGGGGAACTCAAACTCTGTATTTCTCTTTACTGTATTGTATACCGTCTGAGTGACAAAAAACAAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTACTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAGGCACCCCCCGCTGCGGCTGTGGCGGGCGGGAGCCTGGTGTTGGGGACCGGCGGAAAACCTGCCCCCAGGGCAGCCGCCGCCCCCTAAATGAATTGGCGGCCTCGTCGCGGCCCTCCTCTGCGTAGTAGCACACACCTCGCAACGGGAGCCCGGCGGCGGCCACTGCCGTAAAACGCACAATCTTCTCTTCTAGAGTTGA。
【發明內容】
[0009]本發明對蟲草屬真菌的6個驗證無性型的蟲草為研究對象，又依據每種蟲草屬真菌在應用方面有不同的產品形式，選取不同蟲草屬真菌的子座、菌絲體和子實體為材料，采用用高效液相色譜(HPLC)方法，提供了三種應用形式的蟲草屬真菌的標準指紋圖譜；建立起標準指紋圖譜及指紋圖譜中共有化合物含量的測定方法和蟲草屬真菌及不同產品形式的鑒別評價體系，可用于蟲草屬真菌質控及真偽鑒別。
[0010]本發明的優點如下:
[0011](I)本發明中建立了子座、菌絲體、子實體三種形式蟲草屬真菌的標準指紋圖譜，與其他指紋圖譜一祥都能反映藥材化學成分的整體面貌特征。同時設定了共有特征成分的定量評價指標。該法結合了現有蟲草屬真菌鑒定評價方法一指紋圖譜分析法和特定成分定量分析法的優點，避免了只測單一成分判定蟲草整體質量的片面性，又降低了以次充好、以假亂真等造假行為的可能性。
[0012](2)本發明提供了ー套全面、系統、準確、可靠的蟲草屬真菌質量評價體系，同時為蟲草屬真菌的鑒別提供了一種新的方法。為蟲草屬真菌資源的合理開發利用提供檢測技術支持。
[0013](3)本發明具有簡便快捷、穩定性好、精密度高、重現性好等特點。益于推廣應用。也為蟲草屬真菌產品的標準制定提供了可靠方法。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1蟲草屬真菌子座標準指紋圖譜
[0015]圖2蟲草屬真菌菌絲體標準指紋圖譜
[0016]圖3蟲草屬真菌子實體標準指紋圖譜
[0017]圖4對照品圖譜
【具體實施方式】
[0018]1.蟲草屬真菌HPLC標準指紋圖譜的建立方法
[0019]1.1儀器與試劑
[0020]1.1.1 儀器
[0021]Waters 2690型HPLC高效液相色譜儀；光電二極管陣列檢測器；Waters色譜工作站。
[0022]1.1.2材料試劑
[0023]冬蟲夏草(Cordycepssinensis)、蛹蟲草(Cordyceps militaris)、球抱蟲草(Cordyceps bassiana)、聞雄山蟲草(Cordyceps takaomon tana)、古尼蟲卓(Cordycepsgunnii)、蟲花(Isaria farinose)的子座、菌絲體和子實體等蟲草材料，
[0024]標準對照品:蟲草素、腺苷、尿苷、鳥苷、肌苷、胞苷、胸苷，均購自Sigma公司；甲醇，色譜純。
[0025]1.2色譜條件
[0026]色譜柱:AgilentZorbax Extend C18 (250mm X 4.6mm, 5 U m)分析柱；進樣量:IOuL ;流速:0.5mL/min ;柱溫:25°C;檢測時間:40min ;檢測波長:260nm。流動相擦采用甲醇(A)-水(B)系統，甲醇濃度在5% -75%范圍進行梯度洗脫。
[0027]1.3指紋圖譜測定
[0028]蟲草屬真菌供試樣品液制備:精密稱取粉末(過80目篩)樣品1.00g，置于具塞容器中，加入超純水50mL，振蕩IOmin使粉末完全浸透，超聲提取20min，6000r/min離心IOmin,取其上清液用0.22 ii m的微孔濾膜過濾，濾液作為供試樣品溶液。
[0029]吸取10 ii L注入高效液相色譜儀進行測定，記錄40min內的色譜圖。在此條件下分析供試樣品液，得到樣品的指紋圖譜。
[0030]1.4標準指紋圖譜的`確立
[0031]按照上述方法，分別對六種蟲草屬真菌的子座、菌絲體、子實體分別建立HPLC指紋圖譜。經《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A》確立共有特征峰，并擬合建立蟲草屬真菌的子座、菌絲體、子實體的標準指紋圖譜。蟲草屬真菌子座標準指紋圖譜(見圖1)，確立了 6個共有特征峰，其平均相對保留時間及其相對標準偏差統計結果(見表1)。蟲草屬真菌菌絲體標準指紋圖譜(見圖2)，確立了 11個共有特征峰，其平均相對保留時間及其相對標準偏差統計結果(見表2)。蟲草屬真菌子實體標準指紋圖譜(見圖3)，確立了 10個共有特征峰，其平均相對保留時間及其相對標準偏差統計結果(見表3)。
[0032]1.5指紋圖譜精密度試驗
[0033]按照指紋圖譜精密度測試規定方法操作，隨機抽取一份供試品，連續進樣6次，分別對主要色譜峰的相對保留時間及其峰面積進行統計。相對保留時間RSD%低于1.0%，峰面積RSD%低于2.5%0
[0034]1.6指紋圖譜重現性試驗
[0035]隨機抽取一種供試品，制取6份供試樣品液進樣，分別對主要色譜峰的相對保留時間及其峰面積進行統計。相對保留時間RSD%低于1.0%，峰面積RSD%低于3.0%，。
[0036]1.7指紋圖譜穩定性試驗
[0037]隨機抽取一份供試品進樣，考察供試樣品液與儀器在24h內的穩定性。計算主要色譜峰的相對保留時間和峰面積的相對標準偏差。相對保留時間RSD%低于1.0%，峰面積RSD%低于 3.0%0
[0038]該測定方法精密、穩定、重現性好，滿足中藥色譜指紋的技術要求。
[0039]表1蟲草子座標準指紋圖譜共有特征峰
[0040]
【權利要求】
1.ー種蟲草屬真菌指紋圖譜建立方法，其特征是采取如下步驟: (1)供試樣品液的制備:精密稱取蟲草粉末(過80目篩)1.00g，置于具塞容器中，加水振蕩IOmin使粉末完全浸透，超聲提取10~30min，離心，取其上清液用微孔濾膜過濾，濾液作為供試樣品溶液； (2)對照品溶液的制備:精密稱取蟲草素、腺苷、尿苷、鳥苷、肌苷、胞苷及胸苷標準品適量，用超純水配制成含量各為10-100 ii g/mL的標準品對照液； (3)指紋圖譜的制作:色譜柱為Agilent Zorbax Extend C18 (250mmX 4.6mm, 5 u m)分析柱，溫度25°C，檢測波長260nm ;流動相為甲醇-水系統，采用濃度在5% -75%范圍洗脫方式； (4)標準指紋圖譜的確定:按照本發明提供的方法，對蟲草屬真菌建立HPLC標準指紋圖譜； (5)標準指紋圖譜中共有峰的定性定量測定:通過標準品的出峰時間定性，井根據繪制標準曲線計算共有峰所對應化合物的含量。
2.—種蟲草屬真菌子座的標準指紋圖譜，包含6個共有峰，其中I號峰的平均相對保留時間RT為5.368，相對標準偏差為0.79% ；2號峰的平均RT為9.040，相對標準偏差為，0.40% ；3號峰的平均RT為11.750，相對標準偏差為0.24% ；4號峰的平均RT為20.733，相對標準偏差為0.15% ；5號峰的平均RT為26.251，相對標準偏差為0.10% ；6號峰的平均RT為27.229，相對標準偏差為 0.09% ;其中，第3、4、5號共有峰所對應化合物分別為尿苷、鳥苷和腺苷，其最低含量分別為0.045%,0.025%,0.010%。
3.—種蟲草屬真菌菌絲體的標準指紋圖譜，包含11個共有峰，其中I號峰的平均RT為，4.762，相對標準偏差為0.15% ；2號峰的平均RT為5.355，相對標準偏差為0.65% ;3號峰的平均RT為7.124，相對標準偏差為0.32%；4號峰的平均RT為9.696，相對標準偏差為，0.89%；5號峰的平均RT為11.542，相對標準偏差為0.47%；6號峰的平均RT為20.439，相對標準偏差為0.39%；7號峰的平均RT為21.904，相對標準偏差為0.20%；8號峰的平均RT為22.836，相對標準偏差為0.02%；9號峰的平均RT為23.528，相對標準偏差為0.17%; 10號峰的平均RT為26.075，相對標準偏差為0.22% ;11號峰的平均RT為26.995，相對標準偏差為0.23% ;其中，第5、6、9、10號共有峰所對應化合物分別為尿苷、鳥苷、胸苷和腺苷，其最低含量分別為 0.200%,0.200%,0.001%,0.010%。
4.ー種蟲草子屬真菌實體的標準指紋圖譜，包含10個共有峰，其中I號峰的平均RT為，4.207，相對標準偏差為0.60% ；2號峰的平均RT為5.379，相對標準偏差為0.94% ；3號峰的平均RT為7.084，相對標準偏差為0.88% ；4號峰的平均RT為8.427，相對標準偏差為，0.53%；5號峰的平均RT為11.764，相對標準偏差為0.44%；6號峰的平均RT為20.734，相對標準偏差為0.35%；7號峰的平均RT為22.118，相對標準偏差為0.14%；8號峰的平均RT為26.288，相對標準偏差為0.16%；9號峰的平均RT為27.228，相對標準偏差為0.19%; 10號峰的平均RT為33.625，相對標準偏差為0.14% ;其中，第4、5、6、8號共有峰所對應化合物分別為胞苷、尿苷、鳥苷和腺苷，其最低含量分別為0.015%、0.070%,0.150%、0.080%。
【文檔編號】C12Q1/04GK103484522SQ201210224877
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2012年6月13日 優先權日:2012年6月13日
【發明者】江曉路, 沈照鵬, 劉養仲 申請人:中國海洋大學