人參形成層干細胞分離及培養方法
【專利摘要】人參形成層干細胞分離及培養方法，其特征在于：包括以下步驟；（1）首先將東北人參的直徑為2厘米的塊根經過0.1%的升汞消毒處理10分鐘，然后橫切成0.2厘米厚的包含周皮、韌皮部和形成層在內的半圓形切片；（2）將半圓形切片放置在含有0.1-4.0mg.L-1毒莠定與0.1-4.0mg.L-12，4-二氯苯氧乙酸的WPM培養基上，25℃黑暗下培養；（3）兩周后將形成層明顯增殖的外殖體取出，分離形成層干細胞并轉移到轉繼代培養基上培養；繼代培養基為含有0.1-4.0mg.L-1毒莠定與0.1-4.0mg.L-12，4-二氯苯氧乙酸的WPM培養基，每兩周繼代一次。該方法采用未分裂的形成層干細胞進行分離及培養人參干細胞，其形成層干細胞進行無限增殖，可有效擴大生產。
【專利說明】人參形成層干細胞分離及培養方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種植物干細胞分離及培養方法，特別涉及一種人參形成層干細胞分離及培養方法。
【背景技術】
[0002]人參是名貴的中藥材，深受廣大消費者喜愛，市場需求量很大。野生的人參資源有限，目前生產上采用人工種植人參的辦法來滿足市場需求。
[0003]但由于人參生長周期長，占用耕地，生產過程中又容易受到環境條件、病蟲害和重金屬污染的影響，所以這種傳統的生產技術的成本相對較高和質量難以控制。
[0004]為解決上述問題，產生了通過離體懸浮培養人參的細胞來生產人參的藥用成份的技術，這種技術不受人參生長季節的限制就可以通過規模化生產來獲得大量人參產品。通常取人參的根或葉片為外殖體在特定培養基上培養，經過脫分化階段誘導成具有分裂能力的愈傷細胞，進一步將該細胞懸浮培養來擴大生產。
[0005]但目前采用該技術在分離人參細胞時，均采用已經分化的組織器官為外殖體，通過離體培養階段的培養(脫分化過程)將其誘導為具有分化能力的愈傷細胞。但這種細胞的本質是來源于已經分化的體細胞，所以分裂能力有限，抗逆能力不強。在工業化量產過程中，經常會出現細胞系退化，分裂能力弱，很難進行超大體積的培養。
[0006]針對已有的人參細胞懸浮培養體系中采用體細胞的缺點，本發明則注重分離和培養人參的形成層干細胞。因為形成層干細胞是處于未分化狀態的細胞，具有無限分裂的能力，所以懸浮培養中如果采用形成層干細胞將可以避免脫分化體細胞的缺點。
【發明內容】
[0007]本發明提供一種人參形成層干細胞分離及培養方法，目的是解決現有技術問題，提供一種采用未分裂的形成層干細胞進行分離及培養人參干細胞的方法，該方法僅使形成層干細胞進行無限增殖，而體細胞則不會增殖。
[0008]本發明解決問題采用的技術方案是:
[0009]1.人參形成層干細胞分離及培養方法，包括以下步驟；
[0010]( I)首先將東北人參的直徑為2厘米的塊根經過0.1%的升汞消毒處理10分鐘，然后橫切成0.2厘米厚的包含周皮、韌皮部和形成層在內的半圓形切片。
[0011](2)將半圓形切片放置在含有0.1-4.0mg.L—1毒莠定與0.1-4.0mg.1^2,4~ 二氯苯氧乙酸的WPM培養基上，25°C黑暗下培養。
[0012](3)兩周后將形成層明顯增殖的外殖體取出，分離形成層干細胞并轉移到轉繼代培養基上培養；繼代培養基為含有0.1-4.0mg.L-1毒莠定與0.1-4.0mg.1^2,4~ 二氯苯氧乙酸的WPM培養基，每兩周繼代一次，短期內可以獲得大量的干細胞。
[0013]步驟(2)中WPM培養基上毒莠定的濃度優選1.0mg.L—1，2，4_ 二氯苯氧乙酸的濃度優選 0.5mg.171。[0014]步驟(3)中繼代培養基上毒莠定的濃度優選0.5mg.U1, 2,4_ 二氯苯氧乙酸的濃度優選 0.5mg.171。
[0015]本發明的有益效果:本發明中提供的人參形成層干細胞分離及培養方法可以有效地分離人參的形成層干細胞，形成層干細胞具有無限分裂的能力，生長速度快，抗逆能力強，為超大體積的液體懸浮培養提供基礎，可以顯著減少生產成本。而且通過控制培養基中毒莠定和2，4_ 二氯苯氧乙酸的濃度，使形成層干細胞進行增殖的同時其體細胞不會進行增殖。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016]圖1是本發明中的人參外殖體切片，箭頭所指處為環形的形成層干細胞；
[0017]圖2是人參干細胞在人參外殖體切片上增殖的示意圖，箭頭所指處為形成層干細胞增殖團塊；
[0018]圖3是人參干細胞在固體培養基上增殖示意圖。
【具體實施方式】
[0019]對人參形成層干細胞進行分離和培養的方法具體過程如下實施例中所示:
[0020]實施例1
[0021 ] ( I)首先將東北人參的直徑為2厘米的塊根經過0.1%的升汞消毒處理10分鐘，然后橫切成0.2厘米厚的包含周皮、韌皮部和形成層在內的半圓形切片，見圖1。
[0022](2)將上述半圓形切片放置在含有1.0mg.L—1毒莠定與0.5mg.1^2,4-二氯苯氧乙酸的WPM培養基上，25°C黑暗下培養。由于形成層的干細胞分裂速度快，導致形成層干細胞團在外殖體上顯著積累而形成一個凸起，見圖2，這種干細胞團質地致密，表面較光滑平整。
[0023](3)兩周后將形成層明顯增殖的外殖體取出，分離形成層干細胞并轉移到轉繼代培養基上培養，見圖3。繼代培養基為含有0.5mg.1/1毒莠定與0.5mg.1^2,4- 二氯苯氧乙酸的WPM培養基，每兩周繼代一次，短期內可以獲得大量的干細胞。
[0024]實施例2
[0025](I)首先將東北人參的直徑為2厘米的塊根經過0.1%的升汞消毒處理10分鐘，然后橫切成0.2厘米厚的包含周皮、韌皮部和形成層在內的半圓形切片。
[0026](2)將半圓形切片放置在含有0.lmg.L—1毒莠定與0.5mg.d4_ 二氯苯氧乙酸的WPM培養基上，25 °C黑暗下培養。
[0027](3)兩周后將形成層明顯增殖的外殖體取出，分離形成層干細胞并轉移到轉繼代培養基上培養；繼代培養基為含有1.0mg.1-1毒莠定與2.0mg.1^2,4~ 二氯苯氧乙酸的WPM培養基，每兩周繼代一次，短期內可以獲得大量的干細胞。
[0028]下述表格I中數值為實施例3至實施例15采用的WPM培養基和繼代培養基中毒莠定和2，4-二氯苯氧乙酸的濃度。
[0029]表1
[0030]
【權利要求】
1.人參形成層干細胞分離及培養方法，其特征在于:包括以下步驟； (1)首先將東北人參的直徑為2厘米的塊根經過0.1%的升汞消毒處理10分鐘，然后橫切成0.2厘米厚的包含周皮、韌皮部和形成層在內的半圓形切片； (2)將半圓形切片放置在含有0.1-4.0mg.L-1毒莠定與0.1-4.0mg.L-1 2,4-二氯苯氧乙酸的WPM培養基上，25 °C黑暗下培養； (3)兩周后將形成層明顯增殖的外殖體取出，分離形成層干細胞并轉移到轉繼代培養基上培養；繼代培養基為含有0.1-4.0mg.L-1毒莠定與0.1-4.0mg.L-1 2,4- 二氯苯氧乙酸的WPM培養基，每兩周繼代一次。
2.如權利要求1中所述的人參形成層干細胞分離及培養方法，其特征在于:步驟(2)中WPM培養基上毒莠定的濃度優選1.0mg.L—1, 2,4- 二氯苯氧乙酸的濃度優選0.5mg.L—1。
3.如權利要求1中所述的人參形成層干細胞分離及培養方法，其特征在于:步驟(3)中繼代培養基上毒莠定的濃度優選0.5mg.L-1, 2,4- 二氯苯氧乙酸的濃度優選0.5mg.L-1。
【文檔編號】C12N5/04GK103509749SQ201210223930
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2012年6月29日 優先權日:2012年6月29日
【發明者】亓琴 申請人:鷺港生物藥業有限公司