專利名稱：玉米淹水脅迫響應zmERF2基因啟動子的克隆及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物基因工程技術領域，涉及一種綿玉米淹水脅迫響應zmERF2基因啟動子的克隆及其應用。
背景技術：
我國每年受洪澇災害的農田面積平均為956萬公頃，其中嚴重的年份，受災面積達1500萬公頃以上。在亞洲地區，洪澇災害給玉米的生產造成了很大的損失，僅南亞，每年超過15%的玉米種植面積遭受不同程度的危害。在印度，洪澇災害造成玉米每年減產25-30%。我國南方春玉米和北方夏玉米在正常的栽培季節中，經常遭受洪澇和潰害，玉米根系長期處于低氧狀態，導致玉米減產10% -40%。澇潰害已成為我國南方玉米高產、穩產的主要制約因子之一。因此，克隆玉米淹水脅迫響應基因及其啟動子，對闡明玉米淹水脅迫 響應形成的分子機理以及玉米和其他旱生作物耐澇潰的遺傳改良，具有十分重要的理論價值和實踐意義。ERF基因是參與植物非生物脅迫響應的關鍵基因之一，是水稻、深水稻和擬南芥淹水脅迫響應的關鍵基因。因此，克隆玉米ERF基因的啟動子，有助于闡明玉米耐潰性形成的分子機制，同時為玉米及其他旱生作物的耐潰遺傳改良提供理論指導。然而，玉米ERF啟動子的克隆，目前，尚未見有報道。
發明內容
本發明的目的在于提供一種綿玉米淹水脅迫響應zmERF2基因啟動子的克隆及其應用，含有 I 個 ARE、I 個 GAREU 個 GC motif、2 個 Skn-ImotifU 個 CGTCAiotif 和 I 個MBS位點順式元件，這些順式元件與植物激素、厭氧脅迫響應相關；是一個組織特異型的啟動子，只在根系中表達；是一個誘導型的啟動子，受淹水誘導高效表達。該啟動子與抗蟲、抗病、抗逆等目的基因連接，在淹水、澇潰條件下，可提高轉基因植株根部的抗蟲、抗病、抗逆境能力。同時該啟動子只在根部表達，不涉及食用轉基因植物地上部分的食品安全問題。zmERF2啟動子在旱生植物的耐潰遺傳改良中，具有很好的應用前景。其技術方案如下I、玉米zmERF2基因的獲得根據已知的玉米基因組信息，使用煙草ERF2蛋白的AP2/ERF結構域高度保守的蛋白質序列，進行同源比對分析，電子克隆出121個ERF基因。通過與擬南芥、水稻、煙草等其他植物ERF基因的比較分析，剔除48個假陽性，獲得了 73個ERF基因，分別命名為zmERFl—zmERF73。玉米自交系Hz32的耐潰性較強，而Mol7耐潰性較弱，在玉米3葉I心期，分別對Hz32和Mol7進行0、4、12h的淹水處理，并利用real-time PCR對73個ERF基因在各處理根系的表達進行了分析，結果發現zmERF2基因在Hz32根系受淹水誘導高效表達，而在Mol7中表達量低，結果暗示zmERF2基因的啟動子是淹水脅迫響應的誘導型啟動子。2、玉米自交系Hz32葉片總DNA的提取
取玉米葉片5. Og于液氮中研磨,轉入50ml離心管中。加預熱至95°C的CTAB緩沖液(I. 17MNaCL、0. 0016M EDTA-8. 0,0. 835M Ttis-7. 5,1. 6% CTAB, 1% β-疏基乙醇)10ml，混勻。在65°C水浴鍋內反應90分鐘，不時輕搖離心管。取出離心管，待冷至室溫后，加入等體積氯仿異醇(24 I)，小心搖動試管10分鐘。8000rpm離心10分鐘，將上清轉至另一50ml離心管中。加2/3體積異丙醇，小心混勻，將棉絮狀DNA轉入盛10ml70%乙醇的50ml離心管中，浸泡12小時。倒掉70%乙醇，將DNA晾干，加入Iml TE溶解。待DNA完全溶解后,轉入2. Oml離心管中，加入10 μ 110mg/ml RNaseA,混勻；在37°C下,溫育2小時。再用Iml苯酚氯仿異戊醇(25 24 I)抽提一次，8000rpm離心10分鐘。將上清液轉入2. Oml離心管中，加入1/10體積的3M NaAC (PH5. 2)，2/3體積異丙醇沉淀DNA0將棉絮狀DNA轉入2. Oml離心管中，用70%乙醇洗滌一次，短暫離心，使DNA貼壁，倒去70%乙醇，晾干DNA。待DNA晾干后，加入0.5ml T. E溶液，完全溶解DNA，于_20°C長期保存。3、zmERF2基因啟動子的克隆根據玉米自交系B73zmERF2基因的啟動子序列，設計一對特異引物，左引物5-' ATGGTCGGTGCCTGCTGCGTGGG-3’，右引物5' -GCACAAATCCTTTCCCTTTCCTT-3'。以 Hz32的DNA作為模板，進行PCR擴增。PCR擴增反應體系為2. 5 μ 110XPCR緩沖液，2 μ IlOmM·dNTPs，I μ IlOmM特異引物，I μ IlOmM特異右引物，I單位Taq酶，40ng模板DNA，總體積25 μ I。PCR擴增程序為95°C 3分鐘；95°C I分鐘，61°C I分鐘，72°C 2分鐘30秒，循環35次；72°C 7分鐘；4°C 30分鐘。PCR擴增產物于1%瓊脂糖凝膠中120伏直流電壓電泳45分鐘，使用北京全式金生物技術有限公司的凝膠回收試劑盒，回收特異DNA片段，并將該DNA片段連接到PGEM-T easy載體上，進行DNA測序。4、轉化載體的構建使用帶酶切位點的引物(左引物加HindIII酶切位點，右引物加BamHI酶切位點)，以玉米自交系Hz32的DNA為模板進行PCR擴增。將PCR產物與pGEM_T easy載體連接，轉化Escherichia coli DH5 α，生長在含氨芐青霉素、X-Gal和IPTG的LB固體平板上的白色菌株被分離出來。經PCR檢測，選擇陽性克隆進行DNA測序，提取所克隆zmERF2啟動子序列正確的質粒DNA。使用HindIII和BamHI限制性內切酶同時酶切質粒，I %瓊脂糖凝膠電泳，回收zmERF5啟動子片段。使用HindIII和BamHI限制性內切酶同時酶切pBI121質粒載體，并回收載體片段。將zmERF2啟動子片段與pBI121載體片段在體外進行鏈接，構建成pBI121-zmERF2-GUS載體，轉化到農桿菌GV3101菌株中。5、轉zmERF2啟動子擬南芥植株的獲得將含pBI121-zmERF2-GUS載體的GV3101農桿菌接種于LB液體培養基，加入利福平和卡那霉素至終濃度為100mg/L，28°C振蕩培養。離心收集菌體，用ddH20稀釋至OD =O. 8,每IOOml菌液加入5. Og鹿糖和50 μ I Silweet L-77。使用floral dip方法對擬南芥進行浸染，成熟后收獲種子，將種子播在含100mg/L卡那霉素的MS固體篩選培養基上。從篩選培養基中長出的抗性植株，經PCR檢測后確定為轉zmERF2啟動子陽性植株。6、zmERF2啟動子活性的檢測將轉zmERF2擬南芥于苗期進行淹水處理，將正常生長和淹水處理的轉基因擬南芥幼苗進行GUS組織化學染色。結果發現，在正常生長條件下，轉zmERF2啟動子擬南芥植株的根和葉片，未出現GUS染色的藍色；而淹水條件下，轉zmERF2啟動子擬南芥的根呈現較強的⑶S藍色，葉片未見⑶S藍色。研究表明zmERF2啟動子既是一個在根中表達的組織特異型啟動子，同時也是一個淹水誘導表達的誘導型啟動子。與現有技術相比，本發明的有益效果為l)zmERF2啟動子直接驅動外源基因的轉基因植物，淹水條件下快速高效(4h)啟動外源基因在植株根部的大量表達，可以提高植株的耐潰性，或抗蟲、抗病等能力；2)zmERF2啟動子直接驅動外源基因的轉基因植物，由于外源基因只在淹水條件下誘導表達，且表達部位僅局限于根部，所以對于食用非根部的轉基因植物，不存在轉基因食品安全問題。具體地說，本發明的優點1)淹水條件下誘導表達的誘導型啟動子；2)只在根部特異表達的組織特異性啟動子；3)該啟動子的啟動能力較強，是強啟動子；4)為玉米及其他旱生作物的耐潰性遺傳改良提供了新的根部特異表達、淹水誘導型的啟動子資源；5)對該啟動子中所含順式元件的分析，可進一步闡明玉米耐潰性形成的分子機制。
具體實施方式
下面結合具體實施方式
對本發明作進一步詳細地說明。把zmERF2啟動子克隆到轉化載體上，其后連接一個Tnos終止子，構建成一個轉化載體。將所轉化的目的基因以正確的方向，克隆到zmERF2啟動子與Tnos終止子之間，構建好轉化載體。然后通過基因槍轟擊法或農桿菌法介導法將目的基因轉化到受體細胞中，通過組織培養等技術手段獲得轉基因植株。在澇潰、淹水條件下，zmERF2啟動子可以啟動目的基因在植株根部大量表達。以上所述，僅為本發明較佳的具體實施方式
，本發明的保護范圍不限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明披露的技術范圍內，可顯而易見地得到的技術方案的簡單變化或等效替換均落入本發明的保護范圍內。
權利要求
1.一種綿玉米淹水脅迫響應zmERF2基因啟動子，其特征在于，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO 1 所示。
2.一種含有權利要求I所述綿玉米淹水脅迫響應zmERF2基因啟動子的植物表達載體。
3.如權利要求I所述綿玉米淹水脅迫響應zmERF2基因啟動子在植物耐潰遺傳改良中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種綿玉米淹水脅迫響應zmERF2基因啟動子的克隆及其應用，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示，該啟動子含有1個ARE、1個GARE、1個GC motif、2個Skn-1motif、1個CGTCA-motif和1個MBS位點順式元件，這些順式元件與植物激素、厭氧脅迫響應相關；是一個組織特異型的啟動子，只在根系中表達；是一個誘導型的啟動子，受淹水誘導高效表達。該啟動子與抗蟲、抗病、抗逆等目的基因連接，在淹水、澇漬條件下，可提高轉基因植株根部的抗蟲、抗病、抗逆境能力。同時該啟動子只在根部表達，不涉及食用轉基因植物地上部分的食品安全問題。zmERF2啟動子在旱生植物的耐漬遺傳改良中，具有很好的應用前景。
文檔編號C12N15/84GK102888402SQ20121021874
公開日2013年1月23日 申請日期2012年6月29日 優先權日2012年6月29日
發明者杜何為, 程水源, 黃敏, 李琳玲, 許鋒, 程華 申請人:黃岡師范學院