專利名稱：大豆生物鐘基因GmLCL1及其編碼蛋白與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，特別是涉及一個大豆生物鐘基因、其編碼蛋白及其在植物光周期和開花時間調節中的應用。
背景技術：
大豆是重要的農作物之一，是植物蛋白質、食用油、生物柴油以及異黃酮和卵磷脂等次生代謝產物的重要來源。大豆是短日植物，開花受光周期的嚴格控制，因而不同區域間的優異品種不能相互引種，生育期也受環境光周期的制約(Zhang等，2008)。如果能降低大豆對光周期的敏感性，突破光周期對大豆開花的限制，就能解決大豆的引種問題，從而實現各區域間優質品種的相互交換，豐富各地優異種質資源，調節大豆生育期，提高大豆產量和品質。以往解決大豆光周期敏感性主要是通過雜交的方法獲得新品種，但是，這種育種方法具有對親本依賴性強和周期長等缺點，到目前為止尚未獲得大豆光周期廣適應性品種。對擬南芥等植物的研究表明，植物的光周期是受極其復雜的調節網絡控制的(Mouradov等，2002 ;Turck等，2008)。其中重要的一個調控途徑是生物鐘調控系統。擬南芥生物鐘系統的中央振蕩器主要有三個重要組分即CCAl (Circadian Clock AssociatedI), LHY (Late Elongated Hypocotyl)和 TOCl (Timing Of CAB Expression l^CCAl 和 LHY各編碼MYB相關的轉錄因子,TOCl是一個偽反應調節因子(Pseudo-response regulator)。凌晨時，CCAl和LHY的轉錄達到高峰，其蛋白結合在TOCl啟動子的夜晚元件(Eveningelement, EE)上協同抑制TOCl的轉錄。而在暗中，TOCl表達逐漸升高并在深夜達到高峰，高表達的TOCl通過一種未知的機制促進CCAl和LHY的表達并使其在凌晨達到高峰，三者形成一個反饋抑制環(Feedback loop),并有節律的振蕩(Gould等，2006 ；Barak等，1998 ；Alabadi 等，2002 ；Mizoguchi 等，2002 ；Staiger 等，2002)。大豆是典型的短日植物，又是古四倍體，因此，研究大豆生物鐘成分LHY/CCA1/T0C1，闡明其功能，對揭示大豆光周期調節及植物生物鐘系統的進化和多樣性具有重要意義。截止目前為止，通過調節大豆生物鐘來改變植物對光周期的敏感性和開花時間尚未見報道。
發明內容
為解決通過對大豆生物鐘的調節來改變植物對光周期的敏感性和開花時間的問題，本發明的目的是提供一種大豆GmLCLl蛋白。大豆GmLCLl蛋白為1)由SEQ ID No. I所示的氨基酸序列組成的蛋白質；或2)在SEQ ID No. I所示的氨基酸序列中經取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有同等活性的由I)衍生的蛋白質。本發明的另一目的是提供編碼上述的大豆GmLCLl蛋白的GmLCLl基因。GmLCLU全稱為 Glycine max L. LHYand CCAAl Like)基因具有 SEQ ID No. 2 所示的核苷酸序列。本發明的大豆GmLCLl基因是從大豆墾農18 (Gycine max L. Kennong 18)、中通過RT-PCR克隆到的一個基因。應當理解，本領域技術人員可根據本發明公開的氨基酸序列，在不影響其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一個或幾個氨基酸，得到所述蛋白的突變序列。例如在非活性區段，將第(4)位酪氨酸(Y)替換為天冬氨酸(D)，或是將第(12 )位的纈氨酸(V)替換為異亮氨酸(I)，或是將第(42)位的組氨酸(H)替換為酪氨酸(Y)。
因此，本發明的大豆GmLCLl蛋白還包括SEQ ID No. I所示氨基酸序列經取代、替換和/或增加一個或幾個氨基酸，具有大豆GmLCLl蛋白同等活性的由大豆GmLCLl蛋白衍生得到的蛋白質。本發明基因包括編碼所述蛋白的核酸序列。此外，應理解，考慮到密碼子的簡并性以及不同物種密碼子的偏愛性，本領域技術人員可以根據需要使用適合特定物種表達的密碼子。本發明的另一個目的是提供攜帶GmLCLl基因的植物表達載體，所述的植物表達載體為p35S-GW。本發明的GmLCLl基因，它的蛋白序列與擬南芥LHY蛋白的氨基酸序列之間的相似性為55. 8%，在保守功能域(MYB DNA-bindingdomain)更與LHY蛋白高度相似，因此推測與擬南芥LHY基因功能類似，GmLCLl也具有抑制開花的功能。GmLCLl主要在大豆的葉片中表達，在開花期的第二復葉中表達量最高。本發明將GmLCLl基因構建到表達載體p35S_GW上，并在大腸桿菌DH5 a中擴繁。通過農桿菌介導轉化方法，將P35S-GW攜帶的GmLCLl基因轉入模式植物擬南芥中，獲得擬南芥轉化植株。結果表明，GmLCLl具有降低植物對光周期的敏感性并抑制擬南芥開花的作用。本發明還提供含有GmLCLl核苷酸序列或其片段的克隆載體或各類表達載體、含有所述載體的宿主細胞、含有所述核苷酸序列或其特異片段的轉化植物細胞和轉基因植物。本發明的另一個目的是提供GmLCLl基因及其編碼蛋白GmLCLl在調節植物光周期以及開花時間中的應用。本發明的有益效果在于(I)提供了大豆GmLCLl基因及其編碼蛋白GmLCLl ；(2)通過在植物中過表達GmLCLl基因延長植物生育期，抑制植物開花。因此，GmLCLl基因及其編碼的蛋白可以調節花期，可用于解決雜交育種中的花期不遇的問題，各種作物、蔬菜、水果、花卉的生育期控制的問題以及光周期敏感性問題和引種問題。
圖I為本發明大豆生物鐘基因GmLCLl編碼蛋白的氨基酸序列與LHY、CCA1基因編碼蛋白的氨基酸序列的比較。圖2為克隆中間載體pGWCm的結構示意圖。圖3A為大豆生物鐘基因GmLCLl在大豆中不同組織器官的表達水平。圖3B為大豆生物鐘基因GmLCLl在大豆中不同發育時期的表達水平。圖4為植物表達載體p35S-GW的結構示意圖。
圖5為大豆生物鐘基因GmLCLl在轉基因植物細胞核中的定位。圖6為大豆生物鐘基因GmLCLl轉化擬南芥，導致擬南芥晚開花。圖7為大豆生物鐘基因GmLCLl蛋白的Western檢測。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。實施例I大豆生物鐘基因GmLCLl的克隆分別利用正向引物5’-ATGGACGCATACTCCTCCGGC-3’和反向引物5’ -TCAAGTCGAAGTCTCCCCTTCCA-3’ 通過 RT-PCR 的方法從大豆墾農 18 (Glycine maxL. Kennong 18)中擴增基因。PCR 反應程序為95°C 5min 預變性，95°C 30S,50°C 35S，72°C 2min30S，30 個循環，72 °C IOmin 延伸。GmLCLl克隆載體的獲得將擴增獲得的PCR產物直接按照TA克隆方法克隆到如圖2所示的pGWCm載體上。先將pGWCm載體用Ahd I內切酶水解后用凝膠回收試劑盒回收酶切產物以獲得T載體。然后PCR產物和T載體于16°C進行12小時連接，將連接產物轉化大腸桿菌DH5 a，并在其中擴增，篩選陽性克隆，并測序。獲得的GmLCLl基因，其基因序列如SEQ ID No. 2所示；由其編碼的蛋白質的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示。實施例2大豆生物鐘基因GmLCLl編碼蛋白的氨基酸序列分析大豆生物鐘基因的GmLCLl蛋白序列與擬南芥LHY蛋白之間的相似性為55. 8%，且 在保守功能域(MYB DAN-binding domain)高度相似，如圖I所示。因此推測GmLCLl與擬南芥LHY的功能類似，具有抑制植物開花的活性。實施例3大豆生物鐘基因GmLCLl在大豆中不同組織器官及不同發育時期的表達水平利用實時定量熒光PCR(quantitative real time RT-PCR)測定大豆生物鐘基因GmLCLl在大豆中的表達。實時熒光定量PCR采用ABISt印One進行，用SYBR Green I檢測熒光信號。上游引物5’ -TATCATTTCTTTATCCCTCCAACGG-3 ’下游引物5，-ACACACATCTACACGACAAGTTTC-3， 反應體系為
SYBR Primix Ex Taq ( 2x ) ( TaKaRa ) 7.5 山 上游引物(IO^iM)0.3 ^il
下游引物(IOjiM )0.3 Jil
ROX Reference Dye ( 5Ox )0 3 [il
cDNA1.0 (il (IdH2O (滅菌雙蒸水)5.6 plI
反應參數為兩步法95° C10S，熱啟動；95° C5S，60° C lmin，40個循環。用基因芯片數據分析軟件Genesis對基因的表達進行標準化并作圖。大豆生物鐘基因GmLCLl在大豆子葉、莖、葉、花、葉柄中均有表達，在開花期的第~■復葉中表達量最聞，如圖3所不。實施例4大豆生物鐘基因GmLCLl的植物表達載體將從實施例I中得到的大豆生物鐘基因GmLCLl的克隆載體與如圖4所示的植物表達載體P35S-GW (購自Invitrogen)等比例混合后通過LR反應(兩種質粒各50ng, LR酶I ill，補ddH20至終體積5 ill，混勻后25 °C反應6小時以上)，將GmLCLl構建在p35S_GW上，用于在植物中過表達大豆生物鐘基因GmLCLl，研究其功能。植物的轉化方法采用農桿菌介導法進行，參見《擬南芥實驗手冊》，2004。植物中的篩選標記為Bar。實施例5大豆生物鐘基因GmLCLl編碼蛋白在轉基因植物中的定位 將大豆生物鐘基因GmLCLl與YFP的融合基因，轉化至擬南芥原生質體中。具體方法如下I)原生質體提取將生長四周左右的擬南芥葉片切成細條，放入甘露醇溶液中；配制酶解液將上述溶液55°C加熱lOmin，室溫放置后，加入CaCl2IOmM, ^ -巰基乙醇5mM，BSA 0. 1%(W/V)，
0.45uM濾頭過濾,避光4°C保存備用；將擬南芥葉片細條撈出，放入酶解液中(1%纖維素酶 R-10，0. 4% 離析酶 R-10，0. 4M 甘露醇，20mM KCl,20mM MES, pH 值 5. 7)，23°C避光，40 60rpm酶解3h ;金屬篩過濾(200目)至小燒杯中(冰上操作)，濾液吸至IOmL塑料離心管中，IOOXg離心lmin,棄上清；向IOmL離心管中加入預冷的等體積W5溶液沖洗原生質體,輕輕顛倒混勻，100 X g離心lmin,棄上清,再加入預冷的1/2體積W5溶液，輕彈使沉淀懸浮起來，冰上放置30min ; 100 X g離心lmin，拿出時放冰上，棄上清，加適量預冷的MMg溶液沖洗原生質體，IOOXg離心lmin,棄上清,加適量預冷的MMg溶液懸浮原生質體。2) PEG 轉化取IOii L融合表達載體的質粒DNA (IOiig)于I. 5mL離心管中，用剪掉頭的黃槍頭加入IOOiI L原生質體提取液，輕輕吸打混勻，再加入IlOiI L的PEG/Ca2+溶液，混勻，23°C避光溫浴30min,進行轉化；向離心管中加入440 U L W5溶液,23°C, IOOXg離心lmin,去除上清，向沉淀中加入IOOiiL W5溶液，混勻，23°C，IOOXg離心lmin，吸棄上清，加IOOyLW5溶液，重復I次，23°C，100Xg離心lmin，吸棄上清，再加入ImL W5溶液將沉淀混勻；將懸浮液倒入六孔板中(先用5%的BSA溶液充分潤洗)，避光，平放于23°C暗培養12 16h ；IOOXg離心lmin,直接吸取一定量的原生質體沉淀在激光共聚焦顯微鏡(Laser ScanningConfocal Microscope)下觀察。轉化細胞中的YFP熒光信號表示大豆生物鐘基因GmLCLl編碼蛋白的定位，如圖5所示。圖5顯示大豆生物鐘基因GmLCLl編碼的蛋白在擬南芥原生質體中主要定位于核。實施例6大豆生物鐘基因GmLCLl抑制擬南芥開花從實施例4獲得的擬南芥轉化植株與其親本(野生型Col對照)在長日植株生長室中的條件(16小時光照/8小時黑暗的光周期，光強80 u mo I m_2 s—1)下同時培育。對27株GmLCLl的T1代過表達轉基因植株進行花期觀測。大豆生物鐘基因GmLCLl轉化擬南芥的轉化株系從播種到開花為48 57天，平均為53天，而其對照的開花時間為47 50天左右，平均為48天。結果表明，大豆生物鐘基因GmLCLl轉化擬南芥，抑制擬南芥開花，對光周期不敏感。如圖6所示，其中右側代表對照野生型Col，左側代表轉基因植株。說明大豆GmLCLl蛋白具有抑制開花的活性。實施例7大豆生物鐘基因GmLCLl編碼蛋白的誘導表達及檢測參照實施例4中的方法將GmLCLl構建在表達載 體pDEST17上，并轉化至大腸桿菌BL21Star中并誘導表達融合His標簽的重組蛋白，經鎳柱純化后(Qiagen Ni-NTA Spin KitHandbook, 2008)用His抗體經Western雜交檢測確定純化蛋白的特異性。檢測結果如圖I所示，GmLCLl蛋白具有很好的特異性。雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。序列說明SEQ ID No. I所示為大豆GmLCLl的氨基酸序列；SEQ ID No. 2所示為大豆GmLCLl的核苷酸序列；SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示為克隆大豆GmLCLl的引物對；SEQ IDNo. 5 和 SEQ ID No. 6 所示為大豆 GmLCLl Real-time PCR 的引物對。
權利要求
1.一種大 GmLCLl蛋白，其為 1)由SEQID NO. I所示的氨基酸序列組成的蛋白質，或 2)在SEQID NO. I所示的氨基酸序列中經取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有同等活性的由I)衍生的蛋白質。
2.編碼權利要求I所述的蛋白的大豆GmLCLl基因。
3.根據權利要求2所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQID NO. 2所示。
4.含有權利要求2或3所述基因的載體。
5.含有權利要求4所述載體的宿主。
6.含有權利要求2或3所述基因或其特異片段的轉化植物細胞或轉基因植物。
7.權利要求2或3所述的基因在調節植物光周期和開花時間中的應用。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述的應用是在植物體內過量表達大豆GmLCLl基因，抑制植物開花，延長植物生育期。
全文摘要
本發明提供了一種大豆GmLCL1蛋白，其為1)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質，或2)在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中經取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白質。本發明同時提供了編碼上述蛋白的基因GmLCL1，過表達所述基因可明顯抑制植物開花，延長生育期。可用于解決雜交育種中的花期不遇問題，各種作物、蔬菜、水果、花卉的生育期控制問題，光周期敏感性問題和引種問題。
文檔編號C12N15/29GK102731636SQ20121021767
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月27日 優先權日2012年6月27日
發明者傅永福, 吳卓晶, 張曉玫 申請人:中國農業科學院作物科學研究所