專利名稱：一種由牙齦組織培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞和成纖維組織的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及間充質(zhì)干細(xì)胞和成纖維組織的培養(yǎng)技術(shù)。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌素的美容產(chǎn)品(如蘋果干細(xì)胞)已經(jīng)為大眾所接受，而且學(xué)術(shù)界對于來自間充質(zhì)干細(xì)胞的分泌素的潛在醫(yī)療用途正展開深入的探討，近年已有分泌素的正面醫(yī)療效果的文獻(xiàn)出現(xiàn)，如改善皮膚皺紋，心衰竭，腦退化，視力，壽命延長，等等。近年有大量文獻(xiàn)亦指出分泌素的其它潛在醫(yī)藥價值，暫時研究得最深入的便是其改善心臟衰竭的功用，研究指出干細(xì)胞分泌物中所含的外吐小體(exosome)具有一定醫(yī)療用途如美國專利2011/0003008A1所揭示的。
現(xiàn)有技術(shù)中，醫(yī)院主要從病人的骨髓提取組織去培養(yǎng)出間充質(zhì)干細(xì)胞，其方法是首先通過手術(shù)獲取骨髓組織，然后用膠原蛋白酶消化骨髓組織，將離心后所沉淀出來的細(xì)胞團(tuán)利用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行清洗，之后將細(xì)胞置于含有細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)以提取間充質(zhì)干細(xì)胞，數(shù)天后更新細(xì)胞培養(yǎng)液，提取到的間充質(zhì)干細(xì)胞便會附在培養(yǎng)瓶的壁上繼續(xù)生長?，F(xiàn)有成纖維細(xì)胞的提取是主要從耳背提取皮膚組織(約5_ X 5_ X 2mm),然后再將提取得到的皮膚組織采用上述骨髓組織相同的提取方法進(jìn)行處理得到?，F(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)主要表現(xiàn)為I)間充質(zhì)干細(xì)胞和成纖維組織需要分別從不同的活體組織中提取和培養(yǎng)，培養(yǎng)復(fù)雜度大；2)間充質(zhì)干細(xì)胞和成纖維組織的提取源組織需要進(jìn)行手術(shù)，如骨髓組織的提取，提取過程需要進(jìn)行手術(shù)，給身體受到嚴(yán)重創(chuàng)傷(如嚴(yán)重?zé)齻?不能接受手術(shù)提取體內(nèi)組織(如骨髓，脂肪)的病人帶來限制；而成纖維細(xì)胞的提取會在客人的耳背抽取約5mm X 5mmx 2mm的皮膚組織(參看美國專利US 5，665，372)，造成可能會形成疤痕的傷口 ；3)手術(shù)提取得到骨髓組織的存活時間短，需要馬上進(jìn)行間充質(zhì)干細(xì)胞的提取工作，給培養(yǎng)帶來了時間和地域上的限制；
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種更為安全、更為簡單的由牙齦組織培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的方法。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)發(fā)明目的采用的技術(shù)方案是，一種由牙齦組織培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞和成纖維組織的方法，所述培養(yǎng)方法包括以下步驟a.從活體牙齦中抽取牙齦組織，將牙齦組織置于組織保持液中保存，所述組織保持液包含有MEM培養(yǎng)基底液、牛血清、抗生素和抗真菌素；b.以磷酸鹽緩沖液對所述牙齦組織進(jìn)行清洗，再加入膠原蛋白酶對所述牙齦組織進(jìn)行消化；c.對消化后的混合液進(jìn)行離心分離，得到細(xì)胞團(tuán)；
d.將上述細(xì)胞團(tuán)置于含有MEM培養(yǎng)基底液的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，收集培養(yǎng)得到的細(xì)胞并將所述細(xì)胞懸浮于磷酸鹽緩沖液中；e.在步驟d的磷酸鹽緩沖液中加入帶有磁鐵的成纖維細(xì)胞抗體，混合后靜置反應(yīng)；f.將步驟e反應(yīng)后的產(chǎn)物置于磁化細(xì)胞分離器的分離管中，加入磷酸鹽緩沖液進(jìn)行分離，收集磁化細(xì)胞分離器的洗脫物即為間充質(zhì)干細(xì)胞；g.取出所述分離管，加入磷酸鹽緩沖液到分離管中，利用柱塞將分離管中的細(xì)胞壓出，收集得到的細(xì)胞即為成纖維細(xì)胞。優(yōu)選地，其特征在于，所述組織保持液包含有MEM培養(yǎng)基底液、體積分?jǐn)?shù)為5-20%的牛血清、80-120U/ml的抗生素和0. 25-2. 5ug/ml抗真菌素。優(yōu)選地，所述步驟b中膠原蛋白酶的濃度為50_100U/ml。 優(yōu)選地，所述步驟c中，離心的轉(zhuǎn)速為1000-2500rpm，離心時間為3-5分鐘。優(yōu)選地,所述步驟d中利用質(zhì)量體積比為0. 2-0. 3%的胰蛋白酶或dispase分散酶收集培養(yǎng)得到的細(xì)胞。優(yōu)選地，所述步驟e中成纖維細(xì)胞抗體的加入量為10_30ul每四百萬顆細(xì)胞。優(yōu)選地，所述步驟f中還包括，重復(fù)加入磷酸鹽緩沖液進(jìn)行分離，再收集洗脫物。優(yōu)選地，所述步驟g中還包括，重復(fù)加入磷酸鹽緩沖液到分離管中，利用柱塞將分離管中的細(xì)胞壓出，收集得到的細(xì)胞即為成纖維細(xì)胞。優(yōu)選地，所述步驟g后還包括，將收集到的間充質(zhì)干細(xì)胞和成纖維組織分別置于含有細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)，得到目標(biāo)數(shù)量的間充質(zhì)干細(xì)胞和成纖維組織。本發(fā)明的有益效果是I)本發(fā)明通過一種源組織(牙齦組織)即可同時提取和培養(yǎng)出間充質(zhì)干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，具有方法簡單，安全的優(yōu)點(diǎn)；2)本發(fā)明中之組織取樣過程是微創(chuàng)進(jìn)行的，傷口于數(shù)天內(nèi)便完全康復(fù)，非常適合身體受到嚴(yán)重創(chuàng)傷(如嚴(yán)重?zé)齻?而不能接受手術(shù)提取體內(nèi)組織(如骨髓，脂肪)但需要間充質(zhì)干細(xì)胞作治療的病人；大大減低了病人手術(shù)時的痛楚及安全風(fēng)險.3)利用本發(fā)明的組織保持液，能夠支持組織樣本在常溫下存活72小時，而其中的成份能有效抑制細(xì)菌及真菌的生長，容許組織樣本被長距離運(yùn)輸，而不受地域的界限；4)本發(fā)明提取出來的成纖維細(xì)胞及間充質(zhì)干細(xì)胞的純度及一致性比起現(xiàn)有技術(shù)要高。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I:用體積比70%的乙醇溶液給人體消毒口腔，然后利用2mm直徑的活檢器在人體牙齦中抽取組織樣本，將牙齦組織置于組織保持液中保存，組織保持液包含有MEM培養(yǎng)基底液、體積分?jǐn)?shù)為5%的牛血清、80U/ml的抗生素和0. 25ug/ml抗真菌素；組織樣本在該組織保持液可保存72小時，在該時間范圍內(nèi)以磷酸鹽緩沖液對牙齦組織進(jìn)行清洗，再加入50U/ml膠原蛋白酶對牙齦組織進(jìn)行消化；再對消化后的混合液進(jìn)行離心分離，得到細(xì)胞團(tuán)；將上述細(xì)胞團(tuán)置于含有MEM培養(yǎng)基底液的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，收集培養(yǎng)得到的細(xì)胞并將細(xì)胞懸浮于磷酸鹽緩沖液中；在磷酸鹽緩沖液中加入IOul帶有磁鐵的成纖維細(xì)胞抗體，混合后在3攝氏度下反應(yīng)20分鐘；將反應(yīng)后的產(chǎn)物置于磁化細(xì)胞分離器的分離管中，加入磷酸鹽緩沖液進(jìn)行分離，收集磁化細(xì)胞分離器的洗脫物即為間充質(zhì)干細(xì)胞；取出分離管，加入磷酸鹽緩沖液到分離管中，利用柱塞將分離管中的細(xì)胞壓出，收集得到的細(xì)胞即為成纖維細(xì)胞。實(shí)施例2首先利用體積比70%的乙醇溶液給人體消毒口腔，然后利用2mm直徑的活檢器在人體牙齦中抽取組織樣本，將牙齦組織置于組織保持液中保存，組織保持液包含有MEM培養(yǎng)基底液、體積分?jǐn)?shù)為10%的牛血清、120U/ml的抗生素和2. 5ug/ml抗真菌素；組織樣本在該組織保持液可保存72小時，在該時間范圍內(nèi)將組織樣本利用20ml的磷酸鹽緩沖液清洗2次，再加入20ml的膠原蛋白酶(Type II，濃度100U/ml)消化組織樣本I小時；然后將上述混合液進(jìn)行離心分離得到細(xì)胞團(tuán)，分離轉(zhuǎn)速200rpm，分離4min，利用磷酸鹽緩沖液清洗細(xì)胞團(tuán)兩次；把細(xì)胞團(tuán)混合IOml alpha-MEM培養(yǎng)基底液放入T-75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)數(shù)天，直至細(xì)胞生長到不少于一百萬顆，然后用5ml 0.25%胰蛋白酶收集細(xì)胞，利用磷酸鹽緩沖液 清洗細(xì)胞兩次，然后將細(xì)胞懸浮于0. 5ml的磷酸鹽緩沖液中，混合30ul帶有磁鐵的成纖維細(xì)胞抗體并置放于4攝氏度下反應(yīng)15分鐘，將反應(yīng)產(chǎn)物全數(shù)載入已安裝在磁化細(xì)胞分離器(MACS)的分離管(MACS管)中，收集磁化細(xì)胞分離器的洗脫物并進(jìn)行離心分離(轉(zhuǎn)速200rpm, 4min),將分離得到的細(xì)胞即為間充質(zhì)干細(xì)胞。將MACS管經(jīng)磷酸鹽緩沖液沖洗，再將MACS管從磁化細(xì)胞分離器中移除出來，加入2ml磷酸鹽緩沖液到MACS管中并利用柱塞將MACS管中的細(xì)胞壓出并收集，重復(fù)以上步驟兩次，對收集物進(jìn)行離心(轉(zhuǎn)速200rpm, 4min)得到的細(xì)胞即為成纖維細(xì)胞。實(shí)施例3首先利用體積比70%的乙醇溶液給人體消毒口腔，然后利用2mm直徑的活檢器在人體牙齦中抽取組織樣本，將牙齦組織置于組織保持液中保存，組織保持液包含有MEM培養(yǎng)基底液、體積分?jǐn)?shù)為20%的牛血清、100U/ml的抗生素和lug/ml抗真菌素；組織樣本在該組織保持液可保存72小時，在該時間范圍內(nèi)將組織樣本利用20ml的磷酸鹽緩沖液清洗2次，再加入20ml的膠原蛋白酶(Type II，濃度100U/ml)消化組織樣本I小時；然后將上述混合液進(jìn)行離心分離得到細(xì)胞團(tuán)，分離轉(zhuǎn)速200rpm，分離4min，利用磷酸鹽緩沖液清洗細(xì)胞團(tuán)兩次；把細(xì)胞團(tuán)混合10ml alpha-MEM培養(yǎng)基底液放入T-75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)數(shù)天，直至細(xì)胞生長到不少于一百萬顆，然后用5ml0. 3%的dispase分散酶收集細(xì)胞，利用磷酸鹽緩沖液清洗細(xì)胞兩次，然后將細(xì)胞懸浮于0. 5ml的磷酸鹽緩沖液中，混合20ul帶有磁鐵的成纖維細(xì)胞抗體并置放于4攝氏度下反應(yīng)15分鐘，將反應(yīng)產(chǎn)物全數(shù)載入已安裝在磁化細(xì)胞分離器(MACS)的分離管(MACS管)中，收集磁化細(xì)胞分離器的洗脫物并進(jìn)行離心分離(轉(zhuǎn)速200rpm, 4min),將分離得到的細(xì)胞即為間充質(zhì)干細(xì)胞。將間充質(zhì)干細(xì)胞混合細(xì)胞培養(yǎng)液放到T-150細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培植至4百萬個細(xì)胞。將MACS管經(jīng)磷酸鹽緩沖液沖洗，再將MACS管從磁化細(xì)胞分離器中移除出來，加入2ml磷酸鹽緩沖液到MACS管中并利用柱塞將MACS管中的細(xì)胞壓出并收集，重復(fù)以上步驟兩次，對收集物進(jìn)行離心(轉(zhuǎn)速200rpm，4min)得到的細(xì)胞即為成纖維細(xì)胞。將得到成纖維細(xì)胞的混合細(xì)胞培養(yǎng)液放到T-150細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培植至目標(biāo)數(shù)量。最后應(yīng)說明的是以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明而并非限制本發(fā)明所描述的技術(shù)方案；因此盡管本說明書參照上述的各個實(shí)施例對本發(fā)明已進(jìn)行了詳細(xì)的說明，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，仍然可以對本發(fā)明進(jìn)行修改或等同替換；而一切不脫離本發(fā)明的 精神和范圍的技術(shù)方案及其改進(jìn)，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。
權(quán)利要求
1.一種由牙齦組織培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞和成纖維組織的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)方法包括以下步驟 a.從活體牙齦中抽取牙齦組織，將牙齦組織置于組織保持液中保存，所述組織保持液包含有MEM培養(yǎng)基底液、牛血清、抗生素和抗真菌素； b.以磷酸鹽緩沖液對所述牙齦組織進(jìn)行清洗，再加入膠原蛋白酶對所述牙齦組織進(jìn)行消化； c.對消化后的混合液進(jìn)行離心分離，得到細(xì)胞團(tuán)； d.將上述細(xì)胞團(tuán)置于含有MEM培養(yǎng)基底液的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，收集培養(yǎng)得到的細(xì)胞并將所述細(xì)胞懸浮于磷酸鹽緩沖液中； e.在步驟d的磷酸鹽緩沖液中加入帶有磁鐵的成纖維細(xì)胞抗體，混合后靜置反應(yīng)； f.將步驟e反應(yīng)后的產(chǎn)物置于磁化細(xì)胞分離器的分離管中，加入磷酸鹽緩沖液進(jìn)行分離，收集磁化細(xì)胞分離器的洗脫物即為間充質(zhì)干細(xì)胞； g.取出所述分離管，加入磷酸鹽緩沖液到分離管中，利用柱塞將分離管中的細(xì)胞壓出，收集得到的細(xì)胞即為成纖維細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的由牙齦組織培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞和成纖維組織的方法，其特征在于，所述組織保持液包含有MEM培養(yǎng)基底液、體積分?jǐn)?shù)為5-20%的牛血清、80-120U/ml的抗生素和0. 25-2. 5ug/ml抗真菌素。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的由牙齦組織培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞和成纖維組織的方法，其特征在于，所述步驟b中膠原蛋白酶的濃度為50-100U/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的由牙齦組織培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞和成纖維組織的方法，其特征在于，所述步驟c中，離心的轉(zhuǎn)速為1000-2500rpm，離心時間為3_5分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的由牙齦組織培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞和成纖維組織的方法，其特征在于，所述步驟d中利用質(zhì)量體積比為0. 2-0. 3%的胰蛋白酶或dispase分散酶收集培養(yǎng)得到的細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的由牙齦組織培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞和成纖維組織的方法，其特征在于，所述步驟e中成纖維細(xì)胞抗體的加入量為10-30ul每四百萬顆細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的由牙齦組織培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞和成纖維組織的方法，其特征在于，所述步驟f中還包括，重復(fù)加入磷酸鹽緩沖液進(jìn)行分離，再收集洗脫物。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的由牙齦組織培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞和成纖維組織的方法，其特征在于，所述步驟g中還包括，重復(fù)加入磷酸鹽緩沖液到分離管中，利用柱塞將分離管中的細(xì)胞壓出，收集得到的細(xì)胞即為成纖維細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的由牙齦組織培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞和成纖維組織的方法，其特征在于，所述步驟g后還包括，將收集到的間充質(zhì)干細(xì)胞和成纖維組織分別置于含有細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)，得到目標(biāo)數(shù)量的間充質(zhì)干細(xì)胞和成纖維組織。
全文摘要
本發(fā)明提供一種安全、簡單的間充質(zhì)干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)方法，能通過從活體牙齦中抽取的牙齦組織培養(yǎng)出間充質(zhì)干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，該方法能容許組織樣本被長距離運(yùn)輸,而不受地域的界限；且提取出來的成纖維細(xì)胞及間充質(zhì)干細(xì)胞的純度及一致性比起現(xiàn)有技術(shù)要高。
文檔編號C12N5/071GK102747033SQ20121021323
公開日2012年10月24日 申請日期2012年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月26日
發(fā)明者周向榮, 鄧銘權(quán), 陳庭鵬 申請人:亞太干細(xì)胞科研中心有限公司