專利名稱：一株鮭魚腎桿菌及其生產的酶的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物篩選及應用技術領域。具體涉及ー株鮭魚腎桿菌及其生產的酶，即一株高產胞外殼聚糖酶的海洋細菌Renibacterium Salmoninarum QDl及其所產的殼聚糖降解酶CSN-A。
背景技術：
甲殼素(chitin)又稱幾丁質，是自然界中含量僅·次于纖維素的第二大類天然高分子化合物，年生物合成約十億噸。它廣泛存在于蝦、蟹和昆蟲類等節肢動物的外殼及部分高等植物和真菌的細胞壁中。殼聚糖(chitosan)是甲殼素脫去部分或全部こ酰基的產物，是ー類由2-氨基-2-脫氧-葡萄糖和2-こ酰氨基-2-脫氧-葡萄糖(< 40%)単體通過β -I，4糖苷鍵連接而成的直鏈多糖。與甲殼素相比，殼聚糖含有性質較活潑的伯氨基，它是天然多糖中唯一含有陽離子的高分子聚合物，具有多種生理功能，如抗菌性、成膠性和成膜性等，因而在多個領域具有重要的應用價值。殼聚糖酶是ー類催化氨基葡萄糖的β_1，4-糖苷鍵斷裂，從而專一性降解殼聚糖的糖苷水解酶。殼聚糖酶用途廣泛，一方面，殼聚糖酶可以用于制備具有獨特生理活性的殼寡糖；另一方面，殼聚糖酶本身還可以作為生物防腐剤，能提高植物的抗病能力；最后，殼聚糖酶在生物體的自溶、細胞壁的形態發生、土壤微生物的營養代謝等基礎研究方面也具有重要的用途。自1973年首次在真菌和細菌培養液中發現殼聚糖酶以來，人們已經在許多細菌、放線菌和真菌等類群的微生物中發現了殼聚糖酶的存在，但這些殼聚糖酶的活性大多低于10U/mlo根據文獻報道，2007年孫玉英等報道了一株來自海洋Microbacterium sp. OUOl的殼聚糖酶，其活力達到118U/ml，2004年陳小娥等報道的曲霉經優化后的活力達197U/ml。目前已有多個殼聚糖酶實行了商品化，其價格均比較昂貴，如鄭州駿濤化工有限公司生產的食品級殼聚糖酶售價為460元/升。綜上所述，目前殼聚糖酶的研究存在如下缺點，菌株產酶能力低下、酶活力不高、適合于エ業化生產的菌株少、發酵成本高。因此，高活力、低成本的殼聚糖酶及其微生物產生菌株具有重要的市場應用前景。
發明內容
本發明的目的是提供一株鮭魚腎桿菌及其生產的殼聚糖酶，即ー株高產胞外殼聚糖酶的菌株，及其生產的殼聚糖酶，從而彌補現有的技術不足。本發明提供的殼聚糖酶產生菌株為鮭魚腎桿菌屬海洋細菌RenibacteriumSp. QDl,已于2011年6月30日保藏在位于湖北省武漢市武昌區武漢大學的中國典型培養物保藏中心，保藏號CCTCC NO M 2011226。本發明的菌株用來生產殼2糖(殼寡2糖)和/或殼3糖(殼寡3糖)。本發明的菌株能大量分泌高活性的殼聚糖降解酶CSN-A，適合エ業化生產，產殼聚糖酶最適發酵時間為40-42hr。本發明的菌株產殼聚糖酶最適溫度為25_28°C。
上述的殼聚糖酶CSN-A是從QDl菌株發酵上清液中分離純化到的，具有如下性質殼聚糖降解酶CSN-A，其SDS-PAGE電泳分子量大小為28kD。上述的殼聚糖酶，其作用底物為殼聚糖。上述的殼聚糖酶，降解殼聚糖的最適溫度是50°C。
上述的殼聚糖酶，溫度穩定范圍為0_25°C。上述的殼聚糖酶,降解殼聚糖的最適pH是5. 6。上述的殼聚糖酶，pH穩定范圍為pH5-10。上述的殼聚糖酶，其抑制劑為Fe3+，Al3+，Cu2+和SDS，促進劑為Mn2+。上述的聚糖酶降解殼聚糖的終產物為殼2糖和殼3糖。本發明所涉及的產酶菌株經過對其發酵條件優化其活力可以達到300_400U/ml，是迄今報道產酶量較高的菌株，此外該菌株還具有發酵周期短、發酵成本低的優點，而且本發明所涉及的殼聚糖酶具有較高的PH穩定性，預示了其在エ業應用中的潛在價值。
圖I :本發明中所用菌株產胞外殼聚糖酶的溫度曲線圖譜；圖2 :本發明中所用菌株產胞外殼聚糖酶的時間梯度曲線；圖3 :本發明中所用菌株產胞外殼聚糖酶CSN-A的SDS-PAGE電泳圖；圖4 :本發明所用菌株產胞外殼聚糖酶CSN-A最適溫度和溫度穩定性圖譜；圖5 :本發明中所用菌株產胞外殼聚糖酶CSN-A最適pH和pH穩定性圖譜；圖6 :各種離子對本發明中所用菌株產殼聚糖酶CSN-A的活力影響圖譜；圖7 :本分明中所用菌株產殼聚糖酶CSN-A降解殼聚糖的終產物薄層分析。
具體實施例方式下面結合具體實施方式
對發明菌株的篩選、酶的性質進行詳細的描述。實施例I菌株的分離和鑒定從膠州灣采集海水，4°C保存，如下方法處理將海水經5000rpm/min離心IOmin后，用少量的海水重懸，將溶液進行梯度稀釋后直接涂布在含有O. 5%的殼聚糖固體培養基平板上，于28°C培養2-3天，選擇帶有明顯透明水解圈的菌落，挑取單克隆接種到含3ml液體培養基的試管中，28°C 200rpm/min培養12hr，將培養液按1%的比例接入含50ml液體培養基的250毫升三角瓶中，于28V 200rpm/min培養1_2天。培養液經離心后進行酶活力測定，篩選高穩定性、高活力的菌株。對其中活力最高的ー株菌經形態分析和16SrDNA序列測定，表明該菌株屬于鮭魚腎桿菌屬，革蘭氏染色呈陽性，命名為RenibacteriumSaimoninarum QDl0實施例2菌株發酵條件的優化I)菌株QDl最適發酵溫度的優化過夜培養的菌株接種于IOOml發酵液，分別于18、25、30、37°C進行發酵培養，定時取樣測定殼聚糖酶活，如圖I所示，QDl菌株最適發酵溫度確定為25 28°C。2)菌株QDl最適發酵時間的優化
過夜培養的菌株接種于IOOml發酵液，于28°C進行培養，定時取樣測定殼聚糖酶活力，如圖2所示，菌株QDl產殼聚糖酶在40-42hr達到高峰。按照上述優化條件，菌株QDl產殼聚糖酶活力可提高到300-400U/ml發酵液。使用的液體培養基配方為(g/L):殼聚糖膠體5g，氯化鈉lg，酵母粉lg。酶活力測定方法為光吸收法，O. 9ml 1%殼聚糖膠體溶液加入Iml O. 2M醋酸緩沖液(PH5. 8)，于50°C溫浴，加入IOOul發酵上清粗酶液，于50°C反應lOmin，反應完畢后加入DNS試劑1.5ml，于沸水浴煮沸IOmin,加水稀釋至25ml體積,取5ml于10000rpm/min離心5min,上清液于520nm測定吸光值，根據氨基葡萄糖標準曲線，求得還原糖量。ー個酶活力単位(U)定義為50°C下每分鐘催化生成相當于I μ mo I氨基葡萄糖的還原糖所需的酶量。殼聚糖膠體溶液的配制，稱取Ig殼聚糖，加入IOmllM鹽酸，玻璃棒攪拌至成膠，加入70ml去離子水，75°C水浴保溫攪拌至全部溶解，用IM氫氧化鈉調PH至6. 0，75°C保溫至白色沉淀全部溶解，加水定 容到100ml，12rC滅菌后備用。實施例3菌株產殼聚糖酶CSN-A的分離純化I =CSN-A酶的分離純化過夜培養的菌株QDl接種于IOOml發酵液，于28°C發酵培養36hr，收集發酵液以12000g、4°C離心20min,上清液用60%硫酸銨沉淀過夜,4°C 12000rpm/min離心30min,沉淀用20mM磷酸緩沖液pH6. 8溶解，經O. 22 μ m濾膜過濾后備用，過濾后的酶液上樣疏水層析柱，用去離子水進行梯度洗脫，收集各個洗脫峰，以殼聚糖酶活作為跟蹤，分別測定每個洗脫峰，所得的活性峰經PAGE電泳顯示為單一條帯，命名為CSN-A。比活性從199U/mg蛋白提高到1574U/mg，提高了 7. 89倍，回收率為67%，見表I。表I殼聚糖酶CSN-A的分離純化步驟及結果
方法總酶活(U) 總蛋白(mg) 比活力(U/mg) 純化倍數
得率(=/0)
粗酶液6782.8534.00199.49I
100
硫酸銨6425.14 4 681372.896.88
94.73
疏水層析4581.77 2.911574.497.89
67 實施例4殼聚糖酶CSN-A的酶學性質I)殼聚糖酶CSN-A的分子量確定因為蛋白質的相對遷移率與分子量的對數成正比，因此可以通過SDS-PAGE測定目標蛋白的分子量。根據SDS-PAGE中標準分子量蛋白和目標蛋白的相對遷移率，計算出CSN-A酶的分子量大小為28kD，如圖3所示,該大小與其在凝膠色譜中的大小一致。2)殼聚糖酶CSN-A的最適溫度和熱穩定性測定純化后的CSN-A在不同的溫度(20、30、40、50、60、70°C )下進行酶活性測定，結果如圖4A所示。CSN-A的最適溫度為50°C，當低于30°C或高于70°C時，酶活性大幅降低，僅為最適溫度下的15%左右。酶的溫度穩定性分析是指將酶在一定的溫度(0、10、20、30、40、50)下保溫Ih后，按標準方法測定殘余酶活，結果如圖4B所示。CSN-A在30°C以下有較好的穩定性，當溫度達到50°C時，純酶在Ih內幾乎全部失活。3)殼聚糖酶CSN-A的最適pH和pH穩定性測定純化后的CSN-A在不同的pH下的方法進行酶活性測定，結果如圖5A所示。CSN-A的酶活性對PH比較敏感，最適pH為5. 6。當pH低于5或高于7吋，酶活性顯著下降，要低于最適pH的50%。pH穩定性的測定是將等量的酶液與不同pH的緩沖液4°C放置24h，測定時按標準
方法測定殘余酶活，結果如圖5B所示。結果表明，CSN-A在pH5-10之間均能保持較好的穩定性。4)金屬離子對CSN-A酶活性的影響分別考察lmmol/L 的各種離子(Li+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Ca2+、Ba2+、Mg2+、Ni2+、Al3+、Fe3+)對酶活的影響，對照組的酶活定為100%。如圖6所示，Cu2+、Fe3+和Al3+對CSN-A的酶活具有強烈的抑制作用，此外表面活性劑SDS對酶活也有顯著的抑制作用，而Mn2+對酶活有顯著的激活作用。5)殼聚糖酶CSN-A降解殼聚糖的終產物薄層層析分析底物的配制(1%):按照I克殼聚糖粉IOml IM HCl的比例加入鹽酸，75°C加熱攪拌過夜，用IM NaOH回調PH至6.0，回調過程中要邊加熱邊攪拌，用去離子水補充體積至底物濃度為1%。水解調整酶液濃度為100U/ml，按照酶液底物=1 9的體積比，于55°C條件下水解lh，產物經噴霧干燥后密封保存。產物鑒定取適量產物干粉，用去離子水配制成溶液，利用薄層層析(TLC)鑒定產物的組成，展開劑為正丁醇冰こ酸水氨水=2:1:1:0. 3，展層后用吹風機吹干，將薄層板浸入顯色劑(2g ニ苯胺、2mL苯胺、Iml濃HCl與10mL85%磷酸共溶于200mL丙酮中)，迅速取出后用吹風機烘干，然后用電爐烘烤硅膠板，至顯色為止。結果如圖7所不，其中M為殼2糖和殼3糖標準品，A為未降解的殼聚糖，結果B說明CSN-A降解殼聚糖的終產物為殼2糖和殼3糖。本發明獲得的菌株和從該菌株獲得的殼聚糖酶CSN-A具有很好的エ業應用前景，能夠用來エ業化生產殼2糖和殼3糖。
權利要求
1.一種鮭魚腎桿菌屬海洋細菌Renibacterium Sp.，其保藏編號為CCTCC NO M2011226。
2.權利要求I所述的鮭魚腎桿菌屬海洋細菌RenibacteriumSp.的應用,其特征在于，是用來生產殼2糖和/或殼3糖。
3.一種殼聚糖降解酶，其特征在于，是用權利要求I所述的鮭魚腎桿菌屬海洋細菌Renibacterium Sp.所分泌的，其分子量大小為28kD。
4.如權利要求3所述的殼聚糖降解酶，其特征在于，所述的殼聚糖酶的作用底物為殼聚糖。
5.如權利要求3所述的殼聚糖降解酶，其特征在于，所述的殼聚糖酶降解殼聚糖的最適溫度是50°C。
6.如權利要求3所述的殼聚糖降解酶，其特征在于，所述的殼聚糖酶的溫度穩定范圍為 0-25 0C ο
7.如權利要求3所述的殼聚糖降解酶，其特征在于，所述的殼聚糖酶的最適pH為5.6。
8.如權利要求3所述的殼聚糖降解酶，其特征在于，所述的殼聚糖酶的pH穩定范圍為PH5-10。
9.如權利要求3所述的殼聚糖降解酶，其特征在于，所述的殼聚糖酶的抑制劑為Fe3+、Al3+、Cu2+ 和 SDS,促進劑為 Mn2+。
10.權利要求3所述的殼聚糖降解酶的用途，是用于生產殼2糖和殼3糖。
全文摘要
本發明涉及一株高產胞外殼聚糖降解酶的海洋細菌Renibacterium Sp.QD1及其產胞外殼聚糖降解酶CSN-A的分離純化條件、酶學性質。本發明通過對菌株QD1進行發酵培養，發酵上清液活性達300-400U/ml，粗酶液經硫酸銨沉淀、疏水層析，得到約28kDa的殼聚糖降解酶CSN-A，該酶降解殼聚糖的最適溫度為50℃，最適pH為5.6-5.8，Fe3+,Al3+,Cu2+和SDS對CSN-A酶活有強烈的抑制作用，而Mn2+能明顯激活CSN-A，CSN-A降解殼聚糖終產物以殼2糖、3糖為主。菌株QD1在適合于工業化生產條件下的酶活力可達300-400U/ml發酵液。本發明在解決目前市場上殼聚糖酶產生菌株產量低、價格昂貴方面將具有極大的應用前景，并將極大促進殼寡糖等相關產品的利用。
文檔編號C12R1/01GK102732462SQ20121021279
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月24日 優先權日2012年6月24日
發明者于文功, 刑培川, 路新枝 申請人:中國海洋大學