專利名稱：鋅指蛋白的快速篩選方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種用于鋅指蛋白的快速篩選方法。
背景技術：
鋅指蛋白最初于1983年由諾貝爾獎獲得者Klug和同事在非洲爪蟾卵母細胞的轉錄因子TFIIIA中被發現，是迄今在真核生物基因組中分布最廣的一類蛋白，人類基因組中有近1%的序列編碼含有鋅指結構的蛋白，由于該類蛋白形狀類似于一根手指，因此而得名。自從發現非洲爪蟾轉錄因子TFIII，許多科研工作者展開了一系列的研究，揭示了人工鋅指蛋白的廣闊應用前景。根據鋅指蛋白保守結構域的差異，可以將鋅指蛋白分為C2H2型(Krilppel相關型)、C4型和C6型等3個類群。C2H2鋅指是真核細胞中最常見的DNA結合模體。由于C2H2鋅指域靶位點特異性與結構和功能的模塊性構成，使得C2H2鋅指域對構建特定的DNA結合蛋白十分有用。2005年4月23日，Cys2His2鋅指蛋白作為人類基因治療的革命性的工具這一消息被刊登上了泰晤士報。目前鋅指蛋白已經被成功地應用與構建靶向特定基因的人工轉錄因子、靶向特定基因的鋅指核酸酶(可使基因打靶的效率提高IO3-IO5,該技術在2010年被科學家雜志評為十大科技進展)，對該領域產生了深遠的影響。Pavletich等(1991)的Zif268_DNA晶體復合物X射線衍射分析表明鋅指單元的α螺旋伸入DNA大溝中，通過其外側的氨基酸殘基來識別DNA雙螺旋大溝中相鄰的3 4bp序列，并通過氫鍵與相應的堿基特異結合。而且與鋅指單元的靶位點特異性相關的主要是α螺旋的第-1，1，2，3，6位殘基。因此可以通過控制鋅指單元的數量可以識別特定長度的DNA序列的鋅指蛋白，正是由于鋅指蛋白這種特殊的結構使得能夠人工篩選針對任何特定DNA序列的鋅指蛋白(理論上)。目前研究人員已經開發出的鋅指蛋白的篩選方法總的來說可以分為兩類一類是利用已經單獨篩選好的鋅指單元進行隨機的組合，產生鋅指蛋 白；另一類是考慮到鋅指單元在結合時受到兩側的鋅指單元的影響，在保持兩個鋅指單元不動的情況下進行第三個鋅指的篩選。這些方法仍然存在以下缺點I、這些方法都是在細菌或是酵母中進行，因此鋅指與DNA的結合并不一定反應在哺乳動物細胞中的實際結合能力。2、這些篩選方法不夠敏感，對于結合能力弱的鋅指蛋白容易被或略。3、這些篩選方法成功率很低，工作量很大，一般實驗室難以實施。
發明內容
本發明所要解決的一個技術問題在于克服上述鋅指蛋白的篩選方法的缺點，提供一種簡單、高效的鋅指蛋白的快速篩選方法。解決上述技術問題所采用的技術方案是由下述步驟組成I、構建小型鋅指蛋白庫通過在線鋅指蛋白預測軟件預測鋅指蛋白靶序列并組裝鋅指蛋白，選擇1-50個鋅指蛋白組成小型鋅指蛋白庫。
2、構建嵌合型轉錄因子和鋅指蛋白檢測載體由N端的鋅指蛋白和C端的轉錄激活結構域形成融合蛋白，在鋅指蛋白的5丨端插入核定位信號，組裝成嵌合型轉錄因子，由鋅指蛋白靶序列和下游的啟動子核心元件組成嵌合型啟動子，在嵌合型啟動子的下游插入報告基因組成鋅指蛋白檢測載體。3、在哺乳動物細胞中篩選鋅指蛋白將嵌合型轉錄因子和鋅指蛋白檢測載體共轉染到哺乳動物細胞內作為實驗組，將鋅指蛋白檢測載體單獨轉染到哺乳動物細胞內作為對照組，實驗組的報告基因表達強度高于或等于對照組5倍的是合格的鋅指蛋白。本發明的鋅指蛋白是由三個鋅指單元組裝而成，其組裝過程是以一條合成的模 板鋅指蛋白的DNA序列為模板，通過聚合酶鏈式反應方法分別獲得三個鋅指單元，通過鋅指單元間的重疊聚合酶鏈式反應擴增獲得鋅指蛋白，模板鋅指蛋白的DNA序列為CCCCACGAGAGACCTTTCCAGTGCAGGATCTGTATGCGGAACTTCAGCCGCCAACAGAAGCTGGACACCCACACAAGGACCCATACTGGCGAAAAGCCCTTTCAATGTCGGATTTGCATGCGCAACTTTTCCCTCAGCCAGACACTGAAGAGGCACCTCCGGACACACACCGGAGAGAAACCATTCCAGTGTAGAATCTGCATGAGGAATTTCTCTCGCATGGACCACCTGGCCGGCCATCTGAGAACCCAT。本發明的轉錄激活結構域是轉錄因子p65或VP16的轉錄激活結構域。本發明的嵌合型轉錄因子在核定位信號的5丨端、核定位信號和鋅指蛋白間、轉錄激活結構域的3 '端之中的任意一個位置插入檢測標簽，檢測標簽從Flag、HA、His、myc的任意一種中選擇。本發明的鋅指蛋白靶序列包含2-12次重復。本發明的啟動子核心元件是miniCMV或TAL minipromoter ；miniCMV 的 DNA 序列是GTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGA ；TAL minipromoter 的 DNA 序列是GCCGCCCCGACTGCATCTGCGTGTTCGAATTCGCCAATGACAAGACGCTGGGCGGGGTTTGTGTCATCATAGAACTAAAGACATGCAAATATATTTCTTCCGGGGACACCGCCAGCAAACGCGAGCAACGGGCCACGGGGATGAAGCAG。本發明的報告基因是熒光素酶、綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、β半乳糖苷酶中的任意一種。本發明的哺乳動物細胞是冊1(293、2931\抱1&、現7、[!13了3中的任意一種。本發明彌補上述方法的不足，建立了一種方便高效的鋅指蛋白快速篩選方法，它具有以下特征1)由于在鋅指蛋白檢測載體中插入了多個鋅指蛋白靶序列，使得報告基因的表達達到放大，因此該方法更加敏感；2)篩選過程在哺乳動物細胞內進行，使得篩選的結果更加可靠；3)該篩選方法對設備、材料的要求很低，采用了小型的鋅指蛋白庫，成本大大降低，使得大多數實驗室都能夠進行。為鋅指蛋白的廣泛推廣應用提供了基礎。
圖I是鋅指蛋白的組裝模式圖。圖2是由鋅指蛋白和轉錄激活結構域組成的嵌合型轉錄因子結構示意圖。
圖3是鋒指蛋白檢測載體結構意圖。圖4是用7次重復的靶序列篩選針對hPGRN左側鋅指蛋白的實驗結果。圖5是用7次重復的靶序列篩選針對hPGRN右側鋅指蛋白的實驗結果。圖6是用12次重復的靶序列篩選針對hrai33鋅指蛋白的實驗結果。圖7是靶向hPGRN的鋅指核酸酶活力檢測的結果。圖8是293-eGFP-hPGRN TSF細胞中突變的eGFP被糾正后的eGFP陽性細胞克隆。具體實施方案下面結合附圖和實施例對本發明進一步詳細說明，但本發明不限于這些實施例。
實施例I以篩選針對人PGRN的鋅指蛋白，用于構建靶向人PGRN基因的鋅指核酸酶為例，其步驟如下I、構建針對人PGRN的小型鋅指蛋白庫由于鋅指核酸酶是成對存在，形成二聚體才能發揮作用，所以需要篩選一對鋅指蛋白，兩個鋅指蛋白的結合位點分別位于靶基因互補的兩條DNA鏈上，兩個識別位點間間隔57個堿基，因此最終的靶序列是一段23-25bp長的DNA片段。在鋅指協會(Zinc FingerConsortium)提供的在線鋅指蛋白預測軟件ZiFiT上提供了專門預測用于鋅指核酸酶的成對鋅指蛋白靶位點的服務。具體方法如下從NCBI上查找人PGRN的基因組序列NG_007886，通過在線鋅指蛋白預測軟件ZiFiT (http: //zifit. partners. orR/ZiFiT/ChoiceMenu. aspx)中的 CoDA 法下面的設計鋅指核酸酶(Design Zinc Finger Nucleases)分析人PGRN基因中潛在的鋅指蛋白結合位點。將人PGRN基因組序列輸入到軟件中，提交后可獲得該序列中潛在的鋅指蛋白作用位點；根據實驗的具體需要選擇若干個潛在靶位點做進一步的研究。本實施例選用一個靶位點GTCACCTTCCCTGAGTGGGCTGGT。該序列中存在兩個相鄰且反向的鋅指蛋白結合位點，兩個結合位點之間相隔6個堿基，分別是位于左側的GAC GGT GAA和位于右側的GGT GCT TGG ；將針對這兩個結合位點的鋅指分別稱為ZFPL和ZFPR (ZFPL即針對左側結合位點的鋅指蛋白，ZFPR即針對右側結合位點的鋅指蛋白，每個鋅指蛋白有三個鋅指單元組成，每個鋅指單元識別連續的三個堿基)。針對左側結合位點的鋅指單元稱為LZF,針對右側結合位點的鋅指單元稱為RZF。ZFPL由三個LZF組成，ZFPR由三個RZF組成。在選中的祀位點上點擊相應的鏈接即可得到針對各祀位點的鋅指單元。在本實施例中，分別需獲得針對位于左側的GAC GGT GAA和位于右側的GGT GCT TGG的鋅指單元。參照相鄰組裝法(CoDA),依據鋅指單元的結合力由大到小選擇鋅指單元,針對每一個鋅指蛋白結合位點組裝出1-50鋅指蛋白組成鋅指蛋白庫。詳細的方法該軟件的官方網站上有說明，在文獻中也有詳細的報道。在該步驟中也可采用ZiFiT軟件中寡聚體庫工程平臺(OPEN)下的設計鋅指核酸酶(Design Zinc Finger Nuclease)實施。所選擇的鋅指單元是針對GAC的(LZFI)PHERPFQCRICMRNFSEEANLRRHTRTH ；(LZF2)PHERPFQCRICMRNFSEESNLRRHTRTH ；
(LZF3)PHERPFQCRICMRNFSEQSNLRRHTRTH(LZF4)PHERPFQCRICMRNFSDRSNLTRHTRTH針對GGT的(LZF5)TGEKPFQCRICMRNFSLRHHLTRHLRTH針對GAA的 (LZF6)TGEKPFQCRICMRNFSQKANLTRHLRTH針對GGT的(RZFl)PHERPFQCRICMRNFSRQQKLDTHTRTH (RZF2)PHERPFQCRICMRNFSRRSRLDV HTRTH(RZF3)PHERPFQCRICMRNFSTTTKLAIHTRTH針對GCT的(RZF4)TGEKPFQCRICMRNFSLSQTLKRHLRTH(RZF5)TGEKPFQCRICMRNFSLSQTLNRHLRTH針對TGG的(RZF6)TGEKPFQCRICMRNFSRMDHLAGHLRTH
(RZF7)TGEKPFQCRICMRNFSRVDHLGGHLRTH依據相鄰組裝法獲得針對左側結合位點的四個鋅指蛋白組成的鋅指蛋白庫ZFPLI:LZFl-LZF5-LZF6 ；ZFPL2:LZF2-LZF5-LZF6 ；ZFPL3:LZF3-LZF5-LZF6 ； ZFPL4:LZF4-LZF5-LZF6 ；用同樣的方法可獲得針對右側結合位點的七個鋅指蛋白組成的鋅指蛋白庫ZFPRl:RZF1-RZF4-RZF6 ；ZFPR2:RZF1-RZF-4RZF7 ；ZFPR3:RZF2-RZF4-RZF6 ；ZFPR4:RZF2-RZF4-RZF7 ；ZFPR5:RZF3-RZF4-RZF6 ； ZFPR6:RZF3-RZF4-RZF7 ；ZFPR7:RZF3-RZF5-RZF7 ；在鋅指蛋白庫的構建采用了聚合酶鏈式反應的方法，構建方法見圖1，在圖I中Fl, F2，F3分別代表三個鋅指單元，每個鋅指單元中的7KEY AA代表每個鋅指單元中的關鍵氨基酸。首先合成一個全長的模板鋅指蛋白的DNA序列(ZFT)，以此全長序列為模板用Pl/P4, P2/P5, P3/P6分別擴增三個鋅指單元，通過重疊聚合酶鏈式反應將鋅指單元間組合形成鋅指蛋白庫。 模板鋅指蛋白(ZFT )的DNA序列為CCCCACGAGAGACCTTTCCAGTGCAGGATCTGTATGCGGAACTTCAGCCGCCAACAGAAGCTGGACACCCACACAAGGACCCATACTGGCGAAAAGCCCTTTCAATGTCGGATTTGCATGCGCAACTTTTCCCTCAGCCAGACACTGAAGAGGCACCTCCGGACACACACCGGAGAGAAACCATTCCAGTGTAGAATCTGCATGAGGAATTTCTCTCGCATGGACCACCTGGCCGGCCATCTGAGAACCCAT。根據上一步分析的鋅指蛋白的氨基酸序列，以及哺乳動物中密碼子偏愛性原則將氨基酸序列轉換成DNA序列，并依據DNA序列合成引物。引物序列如下用于構建左側鋅指蛋白庫的引物LPl Fl HindIII For:AAAGCTTCCCCACGAGAGACCTTTCCALP2 F2 For:CACACAAGGACCCATACTGGCGAA
LP3 F3 For: CACCTCCGGACACACACCGLP4 hPGRN LZFlreverse:AGTATGGGTCCTTGTGTGTCTCCTCAGGTTGGCTTCCTCGCTGAAGTTCCGCATACALP5 hPGRN LZF2reverse:AGTATGGGTCCTTGTGTGTCTCCTCAGGTTGCTTTCCTCGCTGAAGTTCCGCATACALP6 hPGRN LZF3reverse:AGTATGGGTCCTTGTGTGTCTCCTCAGGTTGCTCTGCTCGCTGAAGTTCCGCATACALP7 hPGRN LZF4reverse:AGTATGGGTCCTTGTGTGCCTGGTCAGGTTGCTTCTGTCGCTGAAGTTCCGCATACA
LP8 hPGRN LZF5reverse:GGTGTGTGTCCGGAGGTGTCTTGTGAGATGGTGTCTCAGGGAAAAGTTGCGCATGCALP9 hPGRN LZF6BmaHI reverse:AGGATCCATGGGTTCTCAGATGCCTGGTCAGGTTGGCCTTCTGAGAGAAATTCCTCATGCA用于構建右側鋅指蛋白庫的引物(RPl) Fl KpnI For:AGGTACCCCCCACGAGAGACCTTTCCA(RP2) F2 For:CACACAAGGACCCATACTGGCGAA(RP3) F3 For:CACCTCCGGACACACACCG(RP4) hPGRN RZFlreverse:AGTATGGGTCCTTGTGTGGGTGTCCAGCTTCTGTTGGCGGCTGAAGTTCCGCATACA(RP5) hPGRN RZF2reverse:AGTATGGGTCCTTGTGTGCACGTCCAGTCTGCTCCTTCTGCTGAAGTTCCGCATACA(RP6) hPGRN RZF3reverse:AGTATGGGTCCTTGTGTGGATGGCCAGCTTAGTTGTGGTGCTGAAGTTCCGCATACA(RP7) hPGRN RZF4reverse:GGTGTGTGTCCGGAGGTGCCTCTTCAGTGTCTGGCTGAGGGAAAAGTTGCGCATGCA(RP8) hPGRN RZF5reverse:GGTGTGTGTCCGGAGGTGCCTGTTCAGTGTCTGGCTGAGGGAAAAGTTGCGCATGCA(RP9) hPGRN RZF6XhoI reverse:ACTCGAGATGGGTTCTCAGATGGCCGGCCAGGTGGTCCATGCGAGAGAAATTCCTCATGCA(RPlO) hPGRN RZF7XhoI reverse:ACTCGAGATGGGTTCTCAGATGGCCCCCCAGGTGGTCCACGCGAGAGAAATTCCTCATGCA以全長的模板鋅指蛋白序列(ZFT)為模板，用LP1/LP4，LP1/LP5，LP1/LP6，LP1/LP7, LP2/LP8, LP3/LP9 分別進行聚合酶鏈式反應獲得 LZF1，LZF2, LZF3, LZF4, LZF5, LZF6。用 RP1/RP4, RP1/RP5, RP1/RP6, RP2/RP7, RP2/RP8, RP3/RP9, RP3/RP10 分別進行聚合酶鏈式反應獲得RZF1，RZF2, RZF3, RZF4, RZF5, RZF6, RZF7。聚合酶鏈式反應擴增條件是94°C、30秒，98°C、10秒，55°C、15秒，72°C、15秒，28個循環。聚合酶鏈式反應產物經質量濃度為2. 0%的瓊脂糖電泳后回片段即獲得所有的鋅指單元DNA片段。將鋅指單元DNA片段按照上述的組合方式進行重疊聚合酶鏈式反應組裝鋅指蛋白，獲得ZFPL1，ZFPL2，ZFPL3，ZFPL4, ZFPRl, ZFPR2, ZFPR3, ZFPR4, ZFPR5, ZFPR6, ZFPR7。聚合酶鏈式反應擴增條件是94°C >30秒，98°C、10秒，55°C、15秒，72°C >20秒，30個循環。聚合酶鏈式反應產物經質量濃度為2. 0%的瓊脂糖電泳后回片段即獲得所有的鋅指蛋白DNA片段。將重疊聚合酶鏈式反應獲得鋅指蛋白片段與pGEMT-T easy載體連接。連接條件是2 μ I酶切純化片段，I μ I10 X Τ4連接酶緩沖液，O. 5μ I T載體，O. 5μ I Τ4連接酶，6 μ I三蒸水，16°C連接過夜，將連接產物轉化感受態的DH5 α細胞，并涂布于含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB平板中。挑取菌落接種到含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB培養液中，14 16小時后，經堿性裂解法提取質粒DNA，通過酶切及測序鑒定陽性克隆。將所獲得陽性克隆分別命名為pGEMT/hPGRN ZFPL I, pGEMT/hPGRN ZFPL2, pGEMT/hPGRN ZFPL3, pGEMT/hPGRN ZFPL4, pGEMT/hPGRN ZFPR1, pGEMT/hPGRN ZFPR2,pGEMT/hPGRN ZFPR3, pGEMT/hPGRN ZFPR4, pGEMT/hPGRNZFPR5, pGEMT/hPGRN ZFPR6, pGEMT/hPGRN ZFPR7。至此獲得了針對人 PGRN 基因組DNA序列上兩個相鄰鋅指蛋白結合位點的鋅指蛋白庫。同時在左側的鋅指蛋白兩端引物了HindIII和SalI位點，在右側的鋅指蛋白兩端引入KpnI和BamHI位點，為后面的嵌合型轉錄因子的構建提供了基礎。2、構建嵌合型轉錄因子和人PGRN鋅指蛋白檢測載體 (I)核定位信號和檢測標簽的合成在左右側鋅指蛋白組裝的嵌合型轉錄因子的核定位信號和鋅指蛋白間插入不同的檢測標簽，分別是左側Flag標簽，右側HA標簽，左側和右側的檢測標簽也可相互替換。在上海生工全長合成左側和右側的核定位信號和檢測標簽，DNA序列是左側ATcGAtATGGCACCAAAGAAAAAGCGGAAGGTAGATTACAAAGATCATGATGGCGATTACAAGGACCACGATATCGACTACAAAGATGACGATGATAAGAAGCTTAAGCTT ；右側GAATTCATGGCGCCCAAGAAGAAACGAAAGGTCTATCCTTACGATGTGCCAGACTACGCCGGGTATCCATATGATGTGCCTGACTATGCCGGAGCTATCCCTATGACGTGCCCGATTATGCAGCTCACGGTACC同時在左側核定位信號和檢測標簽的兩端引入了 ClaI和HindIII位點，在右側核定位信號和檢測標簽的兩端引入了 EcoRI和KpnI位點。(2)轉錄因子P65的轉錄激活結構域的克隆根據轉錄因子P65的轉錄激活結構域P65AD的DNA序列設計并合成下列引物，由于左側和右側的鋅指蛋白兩端引入了不同的酶切位點，分別克隆了兩種不同酶切位點的P65AD，分別命名為p65ADL和p65ADR。其中P1/P2擴增的p65ADL引入了 XhoI-XbaI位點，P3/P4 擴增的 p65ADR 引入了 BamHI-SpeI 位點Plp65ADL XhoI For ACTCGAGGGAGGTGGATCTTACCTGCCAGATACAGACGAT ；P2:p65ADL XbaI back ATCTAGATTACTGACTCAGCAGGGCT ；P3:p65ADR BamHI For AGGATCCTACCTGCCAGATACAGACGAT ；P4:p65ADR Spe I back AACTAGTTCACTGACTCAGCAGGGCT ；以cDNA文庫為模板，上面合成的P1/P2、P3/P4引物分別擴增p65ADL和p65ADR。聚合酶鏈式反應擴增條件是94°C、30秒，98°C、10秒，55°C、15秒，72°C、15秒，28個循環。聚合酶鏈式反應產物經質量濃度為I. 0%的瓊脂糖電泳后回片段即獲得P65ADL和p65ADR。將聚合酶鏈式反應獲得DNA片段與pGEMTT easy載體連接。連接條件是2 μ I酶切純化片段，Ιμ 10 X Τ4連接酶緩沖液，O. 5μ I T載體，O. 5μ I 了4連接酶，6 4 1三蒸水，161連接過夜，將連接產物轉化感受態的DH5 α細胞，并涂布于含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB平板中。挑取菌落接種到含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB培養液中，14 16小時后，經堿性裂解法提取質粒DNA，通過酶切及測序鑒定陽性克隆，分別命名為pGEMT/p65ADL和pGEMT/p65ADR。(3)嵌合型轉錄因子的構建將合成的左側核定位信號和檢測標簽的DNA片段NLS-FLAG用ClaI和HindIII酶切并回收片段，與ClaI和HindIII酶切的SB1625載體連接(SB1625載體是在pcDNA3. I (+)的基礎上插入了通過NheI和ApaI位點插入新的多克隆位點=Nhel-ClaI-HindIII-XhoI-Xbal-EcoRl-KpnI-BamHI-SpeI-ApaI,該多克隆位點的 DNA 序列為gctagcttatcgataagcttctcgagtctagaagaattccggtacctggatccaactagtgggccc,該序列由上海生工合成)。連接條件是2 μ I酶切純化片段，1μ I 10 X Τ4連接酶緩沖液，1μ I酶切載體，O. 5μ I Τ4連接酶，5. 5μ I三蒸水。連接產物采用同樣的方法轉化、提取質粒DNA、酶切鑒定獲得陽性克隆，命 名為SB1625/NLS-FLAG。將pGEMT/p65ADL用XhoI和XbaI酶切并回收片段與經同樣酶切處理的SB1625/NLS-FLAG載體連接，連接條件同上。連接產物采用同樣的方法轉化、提取質粒DNA、酶切鑒定獲得陽性克隆，命名為SB1625/NLS-FLAG/p65ADL。將左側鋅指蛋白庫中的所有鋅指蛋白用HindIII和XhoI酶切并回收片段與經同樣酶切處理的SB1625/NLS-FLAG/P65ADL載體連接，連接條件同上，連接產物采用同樣的方法轉化、提取質粒DNA、酶切鑒定獲得陽性克隆，分別命名為SB1625/NLS-FLAG/p65ADL/hPGRN ZFPLl ；SB1625/NLS-FLAG/p65ADL/hPGRN ZFPL2 ；SB1625/NLS-FLAG/p65ADL/hPGRN ZFPL3 ;SB1625/NLS_FLAG/p65ADL/hPGRN ZFPL4。至此獲得所有左側鋅指蛋白和p65轉錄激活結構域組成的嵌合型轉錄因子。采用同樣的方法，將合成的右側核定位信號和檢測標簽的DNA片段NLS-HA用EcoRI和KpnI酶切，與經過同樣酶切處理的SB1625載體連接，獲得SB1625/NLS-HA。將pGEMT/p65ADR用BamHI和SpeI酶切并回收片段與經同樣酶切處理的SB1625/NLS-HA載體連接，獲得SB1625/NLS-HA/p65ADR。將所有右側的鋅指蛋白用KpnI和BamHI酶切，與經過同樣酶切處理的SB1625/NLS-HA/p65ADR載體連接，能夠獲得所有右側鋅指蛋白和p65轉錄激活結構域組成的嵌合型轉錄因子，分別命名為SB1625/NLS-HA/p65ADR/hPGRN ZFPRl ；SB1625/NLS-HA/p65ADR/hPGRNZFPR2 ;SB1625/NLS_HA/p65ADR/hPGRN ZFPR3 ；SB1625/NLS-HA/p65ADR/hPGRN ZFPR4 ；SB1625/NLS-HA/p65ADR/hPGRN ZFPR5 ；SB1625/NLS-HA/p65ADR/hPGRN ZFPR6 ；SB1625/NLS-HA/p65ADR/hPGRN ZFPR7。嵌合型轉錄因子的結構見圖2。(4) miniCMV 的克隆依據miniCMV的序列合成以下引物Pl miniCMV Flfor AGGTACCAATCGATTTAGATCTGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGP2 miniCMV F2reverse CACTAAACGAGCTCTGCTTATATAGGCCTCCCACCGTACACGCCP3 miniCMV F3reverse TAAGCTTCCAGGCGATCTGACGGTTCACTAAACGAGCTCTGCT
用Pl，P2，P3三條引物進行重疊聚合酶鏈式反應，聚合酶鏈式反應擴增條件是940C >30秒，98°C、10秒，55°C、15秒，72°C、10秒，28個循環。產物經質量濃度為2. 0%的瓊脂糖電泳后回片段即獲得miniCMV片段。將聚合酶鏈式反應獲得DNA片段與pGEMT_T easy載體連接，連接條件同上。連接產物采用同樣的方法轉化、提取質粒DNA、酶切鑒定獲得陽性克隆，命名為pGEMT/miniCMV。(5 )人hPGRN鋅指蛋白靶序列的合成根據在線鋅指蛋白預測軟件ZiFiT預測得到的鋅指蛋白靶序列GTCACCTTCCCTGAGTGGGCTGGT (即hPGRN TSF)合成四條互補的寡核苷酸序列，分別是Pl hPGRN TSF KXBL for cagtcaccttccctgagtgggctggtactcgagtta ；P2 hPGRN TSF KXBL reverse gatctaactcgagtaccagcccactcagggaaggtgactggtac ； P3 hPGRN TSF SBBL for tcgacagtcaccttccctgagtgggctggtactcgaggatcca ；P4 hPGRN TSF SBBL reverse gatctggatcctcgagtaccagcccactcagggaaggtgactg ;將Pl和P2各取15μ I于25°C退火，獲得命名為hPGRN TSF KXBL的片段；將P3和P4各取15μ I于25°C退火，獲得命名為hPGRN TSF SBBL片段。(6)構建人PGRN鋅指蛋白檢測載體將pGEMT/miniCMV用KpnI和HindIII酶切后與經同樣酶切處理的pGL4載體連接(pGL4載體購買自Promega公司，在pGL4載體中已經插入了螢火蟲突光素酶報告基因，該報告基因也可為綠色熒光蛋白，紅色熒光蛋白，β_半乳糖苷酶中的一種)，連接條件同上。連接產物采用同樣的方法轉化、提取質粒DNA、酶切鑒定獲得陽性克隆，命名為pGL4/miniCMV。將pGL4/miniCMV載體用KpnI和BglII酶切后與hPGRN TSF KBL連接，連接條件同上。連接產物采用同樣的方法轉化、提取質粒DNA、酶切鑒定獲得陽性克隆，命名為pGL4/hPGRNl X TSF/miniCMV。將 pGL4/hPGRNl X TSF/miniCMV 載體用 XhoI 和 BglII 酶切后與hPGRN TSF SBBL連接，連接條件同上。連接產物采用同樣的方法轉化、提取質粒DNA、酶切鑒定獲得陽性克隆，命名為pGL4/hPGRN2XTSF/miniCMV。以同樣的方式重復連接hPGRN TSFSBBL可以獲得pGL4/hPGRN 7XTSF/miniCMV。也可以同樣的方式重復的連接hPGRN TSFSBBL可以獲得pGL4/hPGRN 12 X TSF/miniCMV。獲得了人PGRN鋅指蛋白檢測載體，其結構見圖3。3、在哺乳動物細胞HEK293中篩選人PGRN鋅指蛋白將嵌合型轉錄因子和鋅指蛋白檢測載體共轉染到HEK293細胞內，通過嵌合型轉錄因子結合于嵌合型啟動子驅動下游熒光素酶報告基因的表達，通過檢測熒光素酶報告基因的熒光強度來檢測鋅指蛋白對靶序列的結合能力，得到所需的鋅指蛋白。實驗前一天將293細胞以IXlO5的密度接種于24孔板。實驗當天，用脂質體的方法將表達嵌合型轉錄因子的載體SB1625/NLS-FLAG/p65ADL/hPGRN ZFPLl ；SB1625/NLS-FLAG/p65ADL/hPGRNZFPL2 ;SB1625/NLS_FLAG/p65ADL/hPGRN ZFPL3 ；SB1625/NLS-FLAG/p65ADL/hPGRN ZFPL4 ；SB1625/NLS-HA/p65ADR/hPGRN ZFPRl ；SB1625/NLS-HA/p65ADR/hPGRN ZFPR2 ;SB1625/NLS_HA/p65ADR/hPGRN ZFPR3 ；SB1625/NLS-HA/p65ADR/hPGRN ZFPR4 ；SB1625/NLS-HA/p65ADR/hPGRN ZFPR5 ；SB1625/NLS-HA/p65ADR/hPGRN ZFPR6 ；SB1625/NLS-HA/p65ADR/hPGRN ZFPR7 ;分別與人 PGRN 鋅指蛋白檢測載體pGL4/hPGRN 7 X TSF/miniCMV和內參pRL-CMV (Promega公司購買，貨號E2261)共轉染到之前鋪好的293細胞中，pRL-CMV (攜帶海蜃熒光素酶)共轉染。并設置陰性對照組(以SB1625載體替代實驗組的表達嵌合型轉錄因子的載體)轉染條件表達嵌合型轉錄因子系列載體O. 5 μ g，鋅指蛋白檢測載體O. 4 μ g，內參載體O. 3 μ g加入到50 μ IOpti-MEM培養基，脂質體2 μ I加入到50 μ I Opti-MEM培養基，分別混勻，室溫作用5分鐘；然后將融有DNA的Opti-MEM加入到50 μ I的融有脂質體的Opti-MEM中，混勻，室溫作用20分鐘；將混合液分別加入到24孔板中。48小時后用Promega的Dual-Iuciferasedetectionkit (貨號E1910)收取細胞蛋白并用GLO MAX 20/20生物發光檢測儀(Promega公司)檢測熒光素酶的熒光強度。分別測出實驗組和對照組螢火蟲熒光素酶活性和海蜃熒光素酶活性，算出實驗組和對照組螢火蟲熒光素酶活性與海蜃熒光素酶活性的比值，然后用實驗組的比值除以對照組的比值，算出實驗組熒光素酶活性是對照組的多少倍。結果見圖4和圖5。該步驟中用于轉染的哺乳動物細胞也可選擇293T、Hela、U87、NIH3T3的一種。在圖4和圖5中，橫坐標代表我們克隆的人PGRN的鋅指蛋白，縱坐標代表實驗組 的熒光素酶活性與對照組熒光素沒活性的比值。由圖4可見，所篩選的四個鋅指蛋白活性均高出對照組活性5倍，因此ZFPLl、ZFPL2、ZFPL3、ZFPL4都是具有特異性結合能力的有效鋅指蛋白。由圖5可見，所篩選的右側7個鋅指中ZFPRl、ZFPR2、ZFPR5、ZFPR6、ZFPR7活性高出對照組5倍，因此ZFPRl、ZFPR2、ZFPR5、ZFPR6、ZFPR7是具有特異性結合能力的有效鋅指蛋白。實施例2以針對人PGRN的鋅指蛋白的篩選為例，其步驟如下在實施例I的核定位信號和檢測標簽的合成步驟2- (I)中，在左右側鋅指蛋白組裝成的嵌合型轉錄因子的核定位信號的5 '端加入了不同的檢測標簽，分別是左側His標簽，右側myc標簽，左側和右側的檢測標簽也可相互替換。在上海生工全長合成了左側和右側的核定位信號和檢測標簽，其序列是左側ATCGATATGCACCATCACCACCATCACGCACCAAAGAAAAAGCGGAAGGTAGATTACAAAGATCATGATGGCGATTACAAGGACCACGATATCAAGCTT右側GAATTCATGCAGAAGCTGATCAGCGAGGAGGACCTGGCGCCCAAGAAGAAACGAAAGGTCTATCCTTACGATGTGCCAGACTACGCCGGGTATCCATATGATGTGCCTGACTATGCCGGCAGCGAGGGTACC在該步驟的轉錄激活結構域VP16的克隆2- (2)中，依據VP16的序列設計引物，以已經有的pVP16(購買自Clontech公司)為模板，通過聚合酶鏈式反應在VP16基因的兩端分別引入兩組酶切位點XhoI-XbaI和BamHI-SpeI，獲得兩個片段VP16L和VP16R。引物序列如下PlVP16L XhoI For ACTCGAGACCGCCCCCATTACCG ；P2:VP16L XbaI back ATCTAGATTACCCCCCAAAGTCGTC ；P3:VP16R BamHI For AGGATCCACCGCCCCCATTACCG ；P4:VP16R SpeI back AACTAGTTTACCCCCCAAAGTCGTC ；
以pVP16為模板，分別用引物P1/P2，P3/P4通過聚合酶鏈式反應獲得VP16L和VP16R。聚合酶鏈式反應擴增條件是94°C、30秒，98°C、10秒，55°C、15秒，72°C >20秒，28個循環。聚合酶鏈式反應產物經質量濃度為1.0%的瓊脂糖電泳后回片段即獲得VP16L和VP16R。將聚合酶鏈式反應獲得DNA片段與pGEMT-T easy載體連接。連接條件是2 μ I酶切純化片段，1μ I 10 X Τ4連接酶緩沖液，O. 5μ I T載體，O. 5μ I Τ4連接酶，6 μ I三蒸水，16°C連接過夜，將連接產物轉化感受態的DH5a細胞，并涂布于含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB平板中。挑取菌落接種到含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB培養液中，14 16小時后，經堿性裂解法提取質粒DNA，通過酶切及測序鑒定陽性克隆，分別命名為pGEMT/VP16L 和 pGEMT/VP16R。在該步驟的TAL minipromoter 的克隆步驟 2- (4)中，依據 TAL minipromoter的序列合成以下引物Pl TAL minipromoter Fl for:AGGTACCGCCGCCCCGACTGCATCTGCGTGTTCGAATTCGCCAATGACAAGACGCTGGG P2 TAL minipromoter Fl reverse:TATATTTGCATGTCTTTAGTTCTATGATGACACAAACCCCGCCCAGCGTCTTGTCATTGP3 TAL minipromoter F2 for:TAAAGACATGCAAATATATTTCTTCCGGGGACACCGCCAGCMACGCGAGCAACGGGCCP4 TAL minipromoter F2 reverse:AAAGCTTCTGCTTCATCCCCGTGGCCCGTTGCTCGCGTTT用Pl，P2兩條引物進行聚合酶鏈式反應，聚合酶鏈式反應擴增條件是94°C、30秒，98°C、10秒，550C、15秒，72°C、10秒，28個循環。產物經質量濃度為2. 0%的瓊脂糖電泳后回片段即獲得TAL minipromoter Fl片段；用P3, P4兩條引物進行聚合酶鏈式反應，條件同上可以獲得TAL minipromoter F2片段。用Fl,F2兩個片段進行重疊聚合酶鏈式反應，聚合酶鏈式反應擴增條件是94°C、30秒，98°C、10秒，55°C、15秒，72°C >20秒，30個循環。產物經質量濃度為2.0%的瓊脂糖電泳后回片段即獲得TAL minipiOmoter片段。將重疊聚合酶鏈式反應獲得DNA片段與pGEMT-T easy載體連接，連接條件同上。連接產物采用同樣的方法轉化、提取質粒DNA、酶切鑒定獲得陽性克隆，命名為pGEMT/TAL minipromoter。其它步驟與實施例I相同，篩選出鋅指蛋白。實施例3在實施例I的核定位信號合成步驟2-(1)中，在上海生工全長合成了核定位信號，其序列是左側ATcGAtATGGCACCAAAGAAAAAGCGGAAGGTAGATTACAAAGATCATGATGGCGATTACAAGGACCACGATATCAAGCTT ；右側GAATTCATGGCGCCCAAGAAGAAACGAAAGGTCTATCCTTACGATGTGCCAGACTACGCCGGGTATCCATATGATGTGCCTGACTATGCCGGAGCGGTACC同時在左側核定位信號的兩端引入了 ClaI和Hindi 11位點，在右側核定位信號的兩端引入了 EcoRI和KpnI位點。
在轉錄因子p65的轉錄激活結構域p65AD的克隆步驟2_ (2)中，根據p65AD的DNA序列設計并合成下列引物，由于左側和右側的鋅指蛋白兩端引入了不同的酶切位點，分別克隆了兩種不同酶切位點的P65AD，分別命名為p65ADL和p65ADR。其中P1/P2擴增的P65ADL引入了 XhoI-XbaI位點，P3/P4擴增的p65ADR引入了 BamHI-SpeI位點，同時通過引物分別在左側和右側P65AD的3 '端引入了 Flag標簽和HA標簽。引入序列如下Plp65ADL XhoI For ACTCGAGGGAGGTGGATCTTACCTGCCAGATACAGACGAT ；P2:p65ADL Flag XbaI backATCTAGATTAAAGCTTCTTATCATCGTCATCTTTGTAGTCCTGACTCAGCAGGGCT ；P3:p65ADR BamHI For AGGATCCTACCTGCCAGATACAGACGAT ；
P4:p65ADRHA SpeI backAACTAGTTCAGTGAGCTGCATAATCGGGCACGTCATAGGGATACTGACTCAGCAGGGCT ；以cDNA文庫為模板，上面合成的引物分別擴增p65ADL-Flag和p65ADR_HA。聚合酶鏈式反應擴增條件是94°C、30秒，98°C、10秒，55°C>15秒，72°C>15秒，28個循環。聚合酶鏈式反應產物經質量濃度為1.0%的瓊脂糖電泳后回片段即獲得p65ADL-Flag和P65ADR-HA。將聚合酶鏈式反應獲得DNA片段與pGEMT-T easy載體連接。連接條件是2μ I酶切純化片段，1μ I 10 X Τ4連接酶緩沖液，O. 5μ I T載體，O. 5μ I Τ4連接酶，6 μ I三蒸水，16°C連接過夜，將連接產物轉化感受態的DH5 α細胞，并涂布于含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB平板中。挑取菌落接種到含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB培養液中，14 16小時后，經堿性裂解法提取質粒DNA，通過酶切及測序鑒定陽性克隆，分別命名為pGEMT/p65ADLFlag 和 pGEMT/p65ADR_HA。其它步驟與實施例I相同，篩選出鋅指蛋白。實施例4以針對人CD133的鋅指蛋白，用于構建人工轉錄抑制因子為例，其步驟如下在本實施例中，設計的鋅指蛋白用于和轉錄抑制因子KRAB組合形成人工轉錄抑制因子，因此只需篩選靶向一個靶序列的鋅指蛋白。I、構建針對人⑶133的小型鋅指蛋白庫從NCBI上查找人⑶133的基因組序列NG_011696，通過在線鋅指蛋白預測軟件ZiFiT (http: //zifit. partners. orR/ZiFiT/Disclaimer. aspx)中的 OPEN 法下面的設計鋅指陣列(Design Zinc Finger Arrays)可獲得人⑶133基因組DNA中潛在的鋅指蛋白結合位點GGA GCC GAG。通過選中的靶位點上的鏈接進入對應的鋅指單元庫，依據結合能力選擇1-50個鋅指蛋白組成鋅指蛋白庫。詳細的方法該軟件的官方網站上有說明，在文獻中也有詳細的報道。在該步驟中也可采用相鄰組裝法平臺(CoDA)下面的設計鋅指陣列實施。所選擇的鋅指單元是針對GAG的(ZFl)PHERPFQCRICMRNFSRQSNLARHTRTH(ZF2)PHERPFQCRICMRNFSRMSNLDRHTRTH(ZF3)PHERPFQCRICMRNFSRHSNLTRHTRTH(ZF4)PHERPFQCRICMRNFSRASNLTRHTRTH針對GCC的
(ZF5)TGEKPFQCRICMRNFSDRTTLKRHLRTH針對GGA的(ZF6)TGEKPFQCRICMRNFSQTTHLRRHLRTH(ZF7)TGEKPFQCRICMRNFSQSQHLKRHLRTH(ZF8)TGEKPFQCRICMRNFSQTTHLSRHLRTH與靶位點中不同堿基特異性結合的鋅指單元分別隨機的組合可以獲得12個鋅指蛋白組成的鋅指蛋白庫ZFP1:ZF1-ZF5-ZF6 ZFP2:ZF1-ZF5-ZF7 ZFP3:ZF1-ZF5-ZF8ZFP4:ZF2-ZF5-ZF6 ZFP5:ZF2-ZF5-ZF7 ZFP6:ZF2-ZF5-ZF8 ZFP7:ZF3-ZF5-ZF6 ZFP8:ZF3-ZF5-ZF7 ZFP9:ZF3-ZF5-ZF8ZFPlO:ZF4-ZF5-ZF6 ZFPll:ZF4_ZF5_ZF7 ZFP12:ZF4-ZF5-ZF8根據上一步分析得到的鋅指蛋白的氨基酸序列，以及哺乳動物中密碼子偏愛性原則，將氨基酸序列轉換成DNA序列，并依據DNA序列合成引物。引物序列如下hCD133 ZFl reverse:AGTATGGGTCCTTGTGTG TCTGGCCAGGTTGCTCTGTCT GCTGAAGTTCCGCATACAhCD133 ZF2 reverse:AGTATGGGTCCTTGTGTG TCTGTCCAGGTTGCTCATTCT GCTGAAGTTCCGCATACAhCD133 ZF3 reverse:AGTATGGGTCCTTGTGTG TCTGGTCAGGTTGCTGTGTCT GCTGAAGTTCCGCATACAhCD133 ZF4 reverse:AGTATGGGTCCTTGTGTG TCTGGTCAGGTTGCTGGCTCT GCTGAAGTTCCGCATACAhCD133 ZF5 reverse:GGTGTGTGTCCGGAGGTG TCTCTTCAGGGTGGTTCTGTC GGAAAAGTTGCGCATGCAhCD133 ZF6 Sail reverse:AGTCGACATGGGTTCTCAGATG TCTTCTCAGGTGGGTGGTCTG AGAGAAATTCCTCATGCAhCD133 ZF7 Sail reverse:AGTCGACATGGGTTCTCAGATG TCTCTTCAGGTGCTGGCTCTG AGAGAAATTCCTCATGCAhCD133 ZF8 Sail reverse:AGTCGACATGGGTTCTCAGATG TCTGCTCAGGTGGGTGGTCTG AGAGAAATTCCTCATGCA采用同實施例I相同的方法，即可獲得了針對人⑶133基因組DNA序列上潛在鋅指蛋白結合位點的鋅指蛋白庫。pGEMT/hCD133 ZFP1，pGEMT/hCD133 ZFP2, pGEMT/hCD133 ZFP3, pGEMT/hCD133ZFP4, pGEMT/hCD133 ZFP5, pGEMT/hCD133 ZFP6, pGEMT/hCD133ZFP7, pGEMT/hCD133 ZFP8, pGEMT/hCD133 ZFP9, pGEMT/hCD133 ZFP10, pGEMT/hCD133ZFPll，pGEMT/h⑶133 ZFP12。同時在鋅指蛋白兩端引入了 HindIII和Sail位點，為后面的嵌合型轉錄因子的構建提供了基礎。2、構建嵌合型轉錄因子和人CD133鋅指蛋白檢測載體(I)將鋅指蛋白庫中的所有鋅指蛋白用HindIII和SalII酶切并回收片段與經HindIII和XhoI酶切處理的SB1625/NLS-FLAG/p65ADL載體連接，連接條件同上，連接產物采用同樣的方法轉化、提取質粒DNA、酶切鑒定獲得陽性克隆，分別命名為SB1625/NLS-FLAG/p65ADL/hCD133 ZFPl ;SB1625/NLS_FLAG/p65ADL/hCD133 ZFP2 ；SB1625/NLS-FLAG/p65ADL/hCD133 ZFP3 ;SB1625/NLS_FLAG/p65ADL/hCD133 ZFP4 ；SB1625/NLS-FLAG/p65ADL/hCD133 ZFP5 ;SB1625/NLS_FLAG/p65ADL/hCD133 ZFP6 ；SB1625/NLS-FLAG/p65ADL/hCD133 ZFP7 ;SB1625/NLS_FLAG/p65ADL/hCD133 ZFP8 ；SB1625/NLS-FLAG/p65ADL/hCD133 ZFP9 ;SB1625/NLS_FLAG/p65ADL/hCD133 ZFPlO ；SB1625/NLS-FLAG/p65ADL/hCD133 ZFPll ;SB1625/NLS_FLAG/p65ADL/hCD133 ZFP12。嵌合型轉錄因子的結構見圖2。(2)人⑶133鋅指蛋白靶序列的合成根據在線鋅指蛋白預測軟件ZiFiT預測得到的鋅指蛋白靶序列GGA GCC GAG合成四條互補的寡核苷酸序列，分別是Pl hCD133 TSF KBL for:CctcggctccCTCGAGTTAP2 hCD133 TSF KBL reverse: GATCTAACTCGAGggagccgagGGTACP3 hCD133 TSF SBBL for:TCGACctcggctccCTCGAGGGATCCAP4 hCD133 TSF SBBL reverse:GATCTGGATCCCTCGAGggagccgagG將Pl和P2各取15 μ I于25°C退火，獲得hCD133 TSF KBL片段，將P3和P4各取15μ I 于 25°C退火，獲得 hCD133 TSF SBBL 片段。(3)人⑶133鋅指蛋白檢測載體的構建采用與實施例I相同的方法可獲得人CD133鋅指蛋白檢測載體pGL4/hCD13312XTSF/miniCMV 其結構見圖 3。3、在哺乳動物細胞293T中篩選人⑶133鋅指蛋白采用同實施例I相同的方法將表達嵌合型轉錄因子的載體SB1625/NLS-FLAG/p65ADL/hCD133ZFPl ;SB1625/NLS_FLAG/p65ADL/hCD133 ZFP2 ;SB1625/NLS_FLAG/p65ADL/hCD133 ZFP3 ;SB1625/NLS_FLAG/p65ADL/hCD133 ZFP4 ;SB1625/NLS_FLAG/p65ADL/hCD133 ZFP5 ;SB1625/NLS_FLAG/p65ADL/hCD133 ZFP6 ;SB1625/NLS_FLAG/p65ADL/hCD133ZFP7 ;SB1625/NLS-FLAG/p65ADL/hCD133 ZFP8 ;SB1625/NLS_FLAG/p65ADL/hCD133 ZFP9 ；SB1625/NLS-FLAG/p65ADL/hCD133 ZFP10 ；SB1625/NLS-FLAG/p65ADL/hCD133 ZFPll ；SB1625/NLS-FLAG/p65ADL/hCD133 ZFP12 ；分別與人 CD 133 鋅指蛋白檢測載體 pGL4/h⑶13312 X TSF/miniCMV和內參pRL-CMV共轉染到之前鋪好的293T細胞中；并且設置陰性對照 SB1625，pGL4/hCD13312XTSF/miniCMV，pRL-CMV 共轉染。轉染條件同實施例 1，48 小時后采用同實施例I相同的方法檢測熒光素酶的活性，結果見圖6。在圖6中，橫坐標代表我們克隆的人CD133的鋅指蛋白，縱坐標代表所測的實驗組的螢火蟲熒光素酶活性與對照組的比值。該步驟中用于轉染的哺乳動物細胞也可選擇HEK293，也可選擇Hela，也可選擇U87，還可選擇NIH3T3中的一種。由圖6可見，在篩選的10個鋅指蛋白中，有7個鋅指蛋白的的螢火蟲熒光素酶活性高于對照組 5 倍，因此 hCD133 ZFP2，hCD133 ZFP3, hCD133 ZFP4, hCD133 ZFP5, hCD133ZFP5，hCD133 ZFP6, hCD133 ZFP8, hCD133 ZFP9 為合格的鋅指蛋白。
實施例5以針對人CD133的鋅指蛋白，用于構建人工轉錄抑制因子為例，其步驟如下從NCBI上查找人⑶133的基因組序列NG011696，通過在線鋅指蛋白預測軟件ZiF-Predict (http://web. iitd. ac. in/ sundar/zifpredict/zifpred home, html)可獲得人⑶133基因組DNA中潛在的鋅指蛋白結合位點GGA GCC GAG。通過選中的靶位點上的鏈接進入對應的鋅指單元庫，依據結合能力選擇1-50個鋅指蛋白組成鋅指蛋白庫。詳細的方法該軟件的官方網站上有說明，在文獻中也有詳細的報道。其它步驟與實施例4相同，可獲得鋅指蛋白。實施例6以篩選針對人PGRN的鋅指蛋白，用于構建靶向人PGRN基因的鋅指核酸酶為例，其步驟如下
從NCBI上查找人PGRN的基因組序列NG 007886，通過在線鋅指蛋白預測軟件ToolGen (http://toolgen. co. kr/ZFNfinder/sws. cgi)分析人 PGRN 基因中潛在的鋒指蛋白結合位點和相應的鋅指蛋白。其它步驟與實施例I相同，獲得鋅指蛋白。實施例7 篩選靶向hPGRN的鋅指核酸酶將實施例I中篩選獲得的靶向hPGRN的鋅指蛋白與FokI組合構建成靶向hPGRN的鋅指核酸酶，用于實現對hPGRN基因的高效的基因打靶。具體步驟如下(I)FokI切割結構與的克隆根據已經報道的FokI兩種突變體的序列在上海生工合成FokI的兩種突變體FokIDD 和 FokIRR (Szcz印ek 等，PMID: 17603476)。同時在 FokI DD 的兩端引入 XhoI 和 XbaI位點，在FokI RR的兩端引入BamHI和SpeI位點。將FokI DD用Xhol/Xbal酶切與經過同樣酶切處理的 SB1625/NLS-FLAG 連接，獲得 SB1625/NLS_FLAG/FokI DD。將 FokI RR 用BamHI/Spel酶切，之后與經過同樣酶切處理的SB1625/NLS-HA連接，獲得SB1625/NLS-HA/FokI RR。連接、轉化、質粒提取條件與實施例I相同。FokI DD 的 DNA 序列如下CAGCTGGTTAAATCCGAGTTGGAAGAGAAAAAGTCTGAGCTCCGCCATAAGTTGAAATACGTGCCTCACGAGTATATCGAACTGATCGAGATCGCCAGAAACTCAACCCAAGACAGGATTTTGGAAATGAAAGTGATGGAGTTCTTTATGAAGGTCTATGGCTATAGGGGAAAGCACCTCGGCGGGAGCAGGAAGCCCGACGGCGCCATTTATACAGTCGGGTCTCCAATCGACTATGGGGTCATCGTTGACACTAAGGCCTATTCCGGGGGTTACAACCTCCCAATAGGGCAGGCTGACGAGATGCAGGACTACGTGGAGGAGAACCAAACAAGGAACAAGCATATAAACCCTAACGAGTGGTGGAAAGTATACCCTAGTTCTGTTACTGAGTTCAAGTTTCTCTTCGTGAGCGGACACTTCAAAGGAAATTACAAAGCTCAACTGACAAGACTGAATCATATTACTAACTGTAATGGTGCCGTCCTGTCAGTGGAGGAACTGCTGATTGGCGGAGAGATGATCAAGGCAGGCACCCTTACTCTCGAAGAAGTGCGGCGAAAGTTTAATAACGGTGAAATCAACTTCTGAFokI RR 的 DNA 序列如下CAGTTGGTGAAATCCGAGCTGGAGGAGAAAAAGTCAGAGCTGCGCCACAAACTCAAGTACGTGCCACACGAATACATTGAGCTGATCGAGATCGCCAGGAACTCCACGCAGGACAGAATCCTeGAGATGAAGGTAATGGAATTTTTCATGAAGGTGTACGGCTACAGAGGCAAGCATCTGGGAGGGTCCCGCAAGCCTGATGGAGCAATCTACACCGTCGGAAGCCCCATaGATTACGGGGTAATCGTCGATACCAAAGCATATAGTGGCGGATACAACCTGCCAATCGGCCAAGCCCGGGAAATGCAGCGATACGTGGAAGAAAACCAGACTAGGAACAAACACATTAACCCAAACGAATGGTGGAAAGTCTATCC
TAGCTCTGTGACGGAGTTCAAGTTTCTCTTTGTTTCCGGCCATTTCAAGGGGAATTACAAGGCTCAGCTGACAAGGC
TGAATCATATTACTAATTGTAACGGGGCCGTTCTCTCAGTGGAAGAGCTGCTGATTGGCGGAGAGATGATTAAAGCC
GGCACCCTTACCCTGGAAGAGGTTCGGCGGAAATTCAACAATGGCGAGATAAACTTTTGA(2)靶向hPGRN的鋅指核酸酶的構建從實施例I中選取符合標準的鋅指蛋白，左側和右側各一個，分別是hPGRN ZFPL2和hPGRNZFPR6。將pGEMT/hPGRN ZFPL2用XhoI和XbaI酶切，與經過同樣酶切處理的SB1625/NLS-FLAG/FokIDD載體連接。連接條件是2 μ I酶切純化片段，I μ 110ΧΤ4連接酶緩沖液，1μ I酶切載體，O. 5μ 1Τ4連接酶，5. 5μ I三蒸水。連接產物采用同樣的方法轉化、提取質粒DNA、酶切鑒定獲得陽性克隆，命名為SB1625/NLS-FLAG/hPGRN ZFPL2_FokI DD。
將pGEMT/hPGRN ZFPR6用BamHI和SpeI酶切，與經過同樣酶切處理的SB1625/NLS-HA/FokI RR載體連接。連接條件是'2 μ I酶切純化片段，I μ I 10ΧΤ4連接酶緩沖液，Ιμ 酶切載體，O. 5μ1 Τ4連接酶，5. 5μ I三蒸水。連接產物采用同樣的方法轉化、提取質粒DNA、酶切鑒定獲得陽性克隆，命名為SB1625/NLS-HA/hPGRN ZFPR6_FokI RR。(3)靶向hPGRN的鋅指核酸酶活力檢測a)單拷貝細胞系的建立該方法通過商業化的Flp-in系統建立單拷貝細胞系，首先對該試劑盒提供的pcDNA5/FRT進行改造，通過該載體上的NheI和ApaI位點插入一段多克隆位點Nhel-ClaI-BamHI-XbaI-ApaI,序列如下gctagcatcgatggatcctctagagggccc,該序列由上海生工合成。將獲得的載體命名為PCDNA5/FRTM。通過聚合酶鏈式反應擴增eGFP上下游兩個片段，以引物P1/P2擴增上游片段eGFPup,同時在上游的兩端引入ClaI和BamHI，以引物P3/P4擴增下游片段eGFP down，在下游片段的兩端引入BamHI和Xbal，引物序列如下Pl eGFP up ClaII for:AATCGATATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC ；P2 eGFP UP BamHI-KpnI reverse:AGGATCCTTGGTACCTTAGTTCACCTTGATGCCGTTCTTP3eGFP down BamHI for:AGGATCCTTCAAGATCCGCCACAACATCP4eGFP down XbaI reverse:ATCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCATG將上游和下游片段分別通過Clal/BamHI、BamHI/Xbal連入到pcDNA5/FRTM中，獲得 pcDNA5/FRTM/eGFP up-down。將實施例 I 中的 hPGRN KXBL 片段與經過 KpnI 和 BamHI 酶切處理的 pcDNA5/FRTM/eGFP up-down 載體，獲得 pcDNA5/FRTM/eGFP up-hPGRN TSF-down。將pOG44 載體(4yg)和 pcDNA5/FRTM/eGFP up-hPGRN TSF-down (8 μ g)共轉染到 Flp-In -293cells (5X 105cells)中，轉染 24h 后，加入 hygromycin 篩選,獲得穩定表達突變型eGFP的單拷貝細胞系293-eGFPhPGRN TSF0b)打靶載體的構建通過聚合酶鏈式反應擴增eGFP基因，不包含起始密碼子，引物序列如下PleGFP no ATG Sail for:GTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG ；P2eGFP XbaI reverse:ATCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCATG ；獲得的片段命名為eGFPF，將eGFPF片段與pGEMT載體連接，轉化，提取質粒并酶切鑒定測序，獲得陽性克隆命名為pGEMT/eGFPF。將pGEMT/eGFPF用SalI和XbaI酶切與經過同樣酶切處理的PUC19載體連接，轉化，提取質粒，酶切鑒定獲得陽性克隆pUC19/eGFPF。即打靶載體。c)鋅指核酸酶活力的檢測將pUC19/eGFPF(8 μ g)、SB1625/NLS_FLAG/hPGRN ZFPL2_FokI DD(2 μ g)、SB1625/NLS-HA/hPGRN ZFPR6_FokI RR(2 μ g)共轉染到 293-eGFP-hPGRN TSF細胞系(5X 105cells)中。96小時后在熒光顯微鏡下統計eGFP陽性克隆的個數。同時將pUC19/eGFPF (8yg)單獨轉染到293-eGFP-hPGRN TS F細胞系(5X 105cells)中，96小時后統計eGFP陽性克隆數做為陰性對照。結果見圖7。由圖7可見，與單獨轉染pUC19/eGFPF的細胞相比，共轉染pUC19/eGFPF和hPGRN鋅指核酸酶的細胞中eGFP陽性克隆的數量顯著增加，顯示篩選的靶向hPGRN的鋅指核酸酶具有良好的活性。圖8顯示了 eGFP陽性的細胞克隆。
權利要求
1.一種鋅指蛋白的快速篩選方法，其特征在于它是由下述步驟組成 (1)構建小型鋅指蛋白庫 通過在線鋅指蛋白預測軟件預測鋅指蛋白靶序列并組裝鋅指蛋白，選擇1-50個鋅指蛋白組成小型鋅指蛋白庫； (2)構建嵌合型轉錄因子和鋅指蛋白檢測載體 由N端的鋅指蛋白和C端的轉錄激活結構域形成融合蛋白，在鋅指蛋白的5 '端插入核定位信號，組裝成嵌合型轉錄因子，由鋅指蛋白靶序列和下游的啟動子核心元件組成嵌合型啟動子，在嵌合型啟動子的下游插入報告基因組成鋅指蛋白檢測載體； (3)在哺乳動物細胞中篩選鋅指蛋白 將嵌合型轉錄因子和鋅指蛋白檢測載體共轉染到哺乳動物細胞內作為實驗組，將鋅指蛋白檢測載體單獨轉染到哺乳動物細胞內作為對照組，實驗組的報告基因表達強度高于或等于對照組5倍的是合格的鋅指蛋白。
2.按照權利要求I所表述的鋅指蛋白的快速篩選方法，其特征在于所述的鋅指蛋白是由三個鋅指單元組裝而成，其組裝過程是以一條合成的模板鋅指蛋白的DNA序列為模板，通過聚合酶鏈式反應方法分別獲得三個鋅指單元，通過鋅指單元間的重疊聚合酶鏈式反應擴增獲得鋅指蛋白，模板鋅指蛋白的DNA序列為CCCCACGAGAGACCTTTCCAGTGCAGGATCTGTATGCGGAACTTCAGCCGCCAACAGAAGCTGGACACCCACACAAGGACCCATACTGGCGAAAAGCCCTTTCAATGTCGGATTTGCATGCGCAACTTTTCCCTCAGCCAGACACTGAAGAGGCACCTCCGGACACACACCGGAGAGAAACCATTCCAGTGTAGAATCTGCATGAGGAATTTCTCTCGCATGGACCACCTGGCCGGCCATCTGAGAACCCAT。
3.按照權利要求I所表述的鋅指蛋白的快速篩選方法，其特征在于所述的轉錄激活結構域是轉錄因子P65或VP16的轉錄激活結構域。
4.按照權利要求I所表述的鋅指蛋白的快速篩選方法，其特征在于所述的嵌合型轉錄因子在核定位信號的5'端、核定位信號和鋅指蛋白間、轉錄激活結構域的3'端之中的任意一個位置插入檢測標簽，檢測標簽從Flag、HA、His、myc的任意一種中選擇。
5.按照權利要求I所表述的鋅指蛋白的快速篩選方法，其特征在于所述的鋅指蛋白靶序列包含2-12次重復。
6.按照權利要求I所表述的鋅指蛋白的快速篩選方法，其特征在于所述的啟動子核心兀件是 miniCMV 或 TAL minipromoter ； miniCMV的DNA序列是GTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGA ；TAL minipromoter 的 DNA 序列是GCCGCCCCGACTGCATCTGCGTGTTCGAATTCGCCAATGACAAGACGCTGGGCGGGGTTTGTGTCATCATAGAACTAAAGACATGCAAATATATTTCTTCCGGGGACACCGCCAGCAAACGCGAGCAACGGGCCACGGGGATGAAGCAG。
7.按照權利要求I所表述的鋅指蛋白的快速篩選方法，其特征在于所述的報告基因是熒光素酶、綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、3 -半乳糖苷酶中的任意一種。
8.按照權利要求I或9所述的鋅指蛋白的快速篩選方法，其特征在于所述的哺乳動物細胞是 HEK293、293T、Hela、U87、NIH3T3 中的任意一種。
全文摘要
一種鋅指蛋白的快速篩選方法，通過在線鋅指蛋白預測軟件預測基因內潛在的鋅指蛋白靶序列及相應的鋅指，通過重疊聚合酶鏈式反應獲得鋅指蛋白庫。將鋅指蛋白與轉錄激活結構融合構建嵌合型轉錄因子，由鋅指蛋白靶序列和啟動子核心元件組成的嵌合型啟動子及其下游的報告基因組成鋅指蛋白檢測載體；將表達嵌合型轉錄因子的載體和鋅指蛋白檢測載體共轉染到哺乳動物細胞，進而通過報告基因表達的強弱反應鋅指蛋白與靶序列的結合能力。
文檔編號C12N15/63GK102850429SQ20121020795
公開日2013年1月2日 申請日期2012年6月21日 優先權日2012年6月21日
發明者夏海濱, 張偉鋒 申請人:陜西師范大學