專利名稱：鑒定雞性連鎖矮小基因的一種方法及其專用引物的制作方法
技術領域：
本發明涉及鑒定雞性連鎖矮小基因的一種方法及其專用引物。
背景技術：
自然界中，哺乳動物的性別屬于XY型，而鳥類屬于ZW型。造成雞矮小性狀的原因較多，而雞性連鎖矮小基因(sex-linked dwarf gene,簡稱dw基因)是目前已知的雞8種矮小基因中唯一對雞本身健康無害的突變。dw基因是雞性染色體上的生長激素受體(GHR)基因(Dw基因)3’ -非翻譯區(3’ -UTR)存在I. 7kb的缺失突變形成的等位基因。自1935年蘇聯學者BCHTAMKF發現該基因后，很多學者都對該基因的作用機理和遺傳特性進行了探討，并逐步應用于雞的育種實踐。dw基因位于Z染色體上，定位于肝壞死基因In和無翅基因wl之間，表現為隱性伴性遺傳，對正常基因Dw為隱性，只有矮小型基因純合子的公雞、和攜帶矮小基因的母雞才表現為矮小，明顯的外部特征是脛骨縮短20%左右，而ZllwZdw雜合子的公雞表型正常，不能與純合非矮小公雞(ZdwZdw)從表型上區分。人們希望從分子水平準確區分ZllwZdw與ZdwZdw基因型，但是，目前檢測dw基因的方法是在缺失片段兩端設計引物，通過檢測矮小和非矮小雞基因組片段的大小來進行判斷，在擴增過程中，由于該基因缺失片段較長，會導致模板對引物的競爭，從而導致在雜合子中只能檢測到缺失后的片段，而非缺失的完整片段難以檢測到，因而對于雜合子與純合非矮小公雞無法進行準確判斷，限制了這一技術在育種工作中的應用。
發明內容
本發明的目的是提供鑒定或輔助鑒定雞是否含有dw基因和/或Dw基因的成套引物對或引物對及其應用。本發明所提供的成套引物對或引物對，具體為下述I) -3)中的任一種I)用于鑒定或輔助鑒定雞是否含有dw基因和/或Dw基因的成套引物對，由檢測雞dw基因的引物對I和檢測雞Dw基因的引物對2組成；所述引物對I由序列表中序列I所示的引物和序列表中序列2所示的引物組成；所述引物對2由序列表中序列3所示的引物和序列表中序列4所示的引物組成；2)用于鑒定或輔助鑒定雞是否含有dw基因的引物對，為檢測雞dw基因的引物對
1;所述引物對I由序列表中序列I所示的引物和序列表中序列2所示的引物組成；3)用于鑒定或輔助鑒定雞是否含有Dw基因的引物對，為檢測雞Dw基因的引物對
2;所述引物對2由序列表中序列3所示的引物和序列表中序列4所示的引物組成。上述成套引物對或引物對在制備產品中的應用也屬于本發明的保護范圍，具體可為如下I、II和III中的任一種I、由檢測雞dw基因的引物對I和檢測雞Dw基因的引物對2組成的成套引物對在制備鑒定或輔助鑒定雞是否含有dw基因和/或Dw基因產品中的應用；所述引物對I由序列表中序列I所示的引物和序列表中序列2所示的引物組成；所述引物對2由序列表中序列3所示的引物和序列表中序列4所示的引物組成；II、檢測雞dw基因的引物對I在制備鑒定或輔助鑒定雞是否含有dw基因產品中的應用；所述引物對I由序列表中序列I所示的引物和序列表中序列2所示的引物組成；III、檢測雞Dw基因的引物對2在制備鑒定或輔助鑒定雞是否含有Dw基因的產品中的應用；所述引物對2由序列表中序列3所示的引物和序列表中序列4所示的引物組成。上述成套引物對或引物對的制備方法也屬于本發明的保護范圍，該方法具體可包括如下I) -3)中的任一步驟
I)以dATP，dTTP，dCTP和dGTP為原料制備序列表中序列I、序列2、序列3和序列4所示的4種單鏈DNA，得到所述引物對I和所述引物對2 ；2)以dATP，dTTP, dCTP和dGTP為原料制備序列表中序列I和序列2所示的2種單鏈DNA，得到所述引物對I;3)以dATP，dTTP, dCTP和dGTP為原料制備序列表中序列3和序列4所示的2種單鏈DNA，得到所述引物對2。含有上述成套引物對或引物對的試劑盒也屬于本發明的保護范圍，該試劑盒具體可為下述I)-3)中的任一種I)用于鑒定或輔助鑒定雞是否含有dw基因和/或Dw基因的試劑盒，所述試劑盒含有由檢測雞dw基因的引物對I和檢測雞Dw基因的引物對2組成的成套引物對；所述引物對I由序列表中序列I所示的引物和序列表中序列2所示的引物組成；所述引物對2由序列表中序列3所示的引物和序列表中序列4所示的引物組成；2)用于鑒定或輔助鑒定雞是否含有dw基因的試劑盒，所述試劑盒含有檢測雞dw基因的引物對I ;所述引物對I由序列表中序列I所示的引物和序列表中序列2所示的引物組成；3)用于鑒定或輔助鑒定雞是否含有Dw基因的試劑盒，所述試劑盒含有檢測雞Dw基因的引物對2 ;所述引物對2由序列表中序列3所示的引物和序列表中序列4所示的引物組成。上述試劑盒的制備方法也屬于本發明的保護范圍，該方法具體可包括如下I) -3)中的任一步驟I)以dATP，dTTP, dCTP和dGTP為原料制備序列表中序列I、序列2、序列3和序列4所示的4種單鏈DNA，得到所述引物對I和所述引物對2 ；2)以dATP，dTTP, dCTP和dGTP為原料制備序列表中序列I和序列2所示的2種單鏈DNA，得到所述引物對I;3)以dATP，dTTP, dCTP和dGTP為原料制備序列表中序列3和序列4所示的2種單鏈DNA，得到所述引物對2。本發明還提供了鑒定或輔助鑒定雞是否含有dw基因和/或Dw基因的方法，該方法包括如下步驟M)、N)或P):M)以待鑒定雞的基因組DNA或總RNA反轉錄得到的cDNA為模板，用檢測雞dw基因的引物對I和檢測雞Dw基因的引物對2進行多重PCR擴增，檢測得到的PCR擴增產物，根據PCR擴增產物確定待鑒定雞是否含有dw基因和/或Dw基因，或是否候選含有dw基因和/或Dw基因
若所述PCR擴增產物滿足如下ml)或m2)的條件，則確定所述待鑒定雞含有dw基因或候選含有dw基因，若所述PCR擴增產物不滿足如下ml)或m2)的條件，則確定所述待鑒定雞不含有dw基因或候選不含有dw基因；若所述PCR擴增產物滿足如下m3)或m4)的條件，則確定所述待鑒定雞含有Dw基因或候選含有Dw基因，若所述PCR擴增產物不滿足如下m3)或m4)的條件，則確定所述待鑒定雞不含有Dw基因或候選不含有Dw基因；若所述PCR擴增產物滿足如下m5)或m6)的條件，則確定所述待鑒定雞含有dw基因和Dw基因或候選含有dw基因和Dw基因，若所述PCR擴增產物不滿足如下m5)或m6)的條件，則確定所述待鑒定雞不含有dw基因和Dw基因或候選不含有dw基因和Dw基因ml)所述PCR擴增產物在瓊脂糖凝膠電泳顯示含有200bp_300bp的一個條帶；m2)所述PCR擴增產物含有247bp的片段；、
m3)所述PCR擴增產物在瓊脂糖凝膠電泳顯示含有500bp_600bp的一個條帶；m4)所述PCR擴增產物含有522bp的片段；m5 )所述PCR擴增產物在瓊脂糖凝膠電泳顯示為200bp_300bp的一個條帶和500bp-600bp 的一個條帶；m6)所述PCR擴增產物為247bp的片段和522bp的片段；N)以待鑒定雞的基因組DNA或總RNA反轉錄得到的cDNA為模板，用檢測雞dw基因的引物對I進行PCR擴增，檢測得到的PCR擴增產物，根據PCR擴增產物確定待鑒定雞是否含有dw基因，若所述PCR擴增產物滿足如下nl)或n2)的條件，則確定所述待鑒定雞含有dw基因或候選含有dw基因，若所述PCR擴增產物不滿足如下nl)或n2)的條件，則確定所述待鑒定雞不含有dw基因或候選不含有dw基因；nl)所述PCR擴增產物在瓊脂糖凝膠電泳顯示為200bp_300bp的一個條帶；n2)所述PCR擴增產物為247bp的片段；P)以待鑒定雞的基因組DNA或總RNA反轉錄得到的cDNA為模板，用檢測雞Dw基因的引物對2進行PCR擴增，檢測得到的PCR擴增產物，根據PCR擴增產物確定待鑒定雞是否含有Dw基因，若所述PCR擴增產物滿足如下pi)或p2)的條件，則確定所述待鑒定雞含有Dw基因或候選含有Dw基因，若所述PCR擴增產物不滿足如下pi)或p2)的條件，則確定所述待鑒定雞不含有Dw基因或候選不含有Dw基因；pi)所述PCR擴增產物在瓊脂糖凝膠電泳顯示為500bp_600bp的一個條帶；p2)所述PCR擴增產物為522bp的片段；所述引物對I由序列表中序列I所示的引物和序列表中序列2所示的引物組成；所述引物對2由序列表中序列3所示的引物和序列表中序列4所示的引物組成。本發明還提供了鑒定或輔助鑒定雞基因型的方法，該方法包括如下b) -d)中的任
一步驟b)以待鑒定雞的基因組DNA或總RNA反轉錄得到的cDNA為模板，用檢測雞dw基因的引物對I和檢測雞Dw基因的引物對2進行多重PCR擴增，檢測得到的PCR擴增產物，根據PCR擴增產物確定待鑒定雞的基因型是ZdwZdw、ZdwW、ZDwZDw、ZdwW和ZdwZllw這五種基因型中的哪一種、或候選為ZdwZdw、ZdwW、ZDwZDw、ZdwW和ZdwZllw這五種基因型中的哪一種若所述PCR擴增產物滿足如下bl)或b2)的條件，則確定所述待鑒定雞的基因型為ZdwZdw或ZdwW，或候選為ZdwZdw或ZdwW ;若所述PCR擴增產物滿足如下b3)或b4)的條件，則確定所述待鑒定雞的基因型為ZdwZdw或ZDwW，或候選為ZdwZdw或ZdwW ;若所述PCR擴增產物滿足如下b5)或b6)的條件，則確定所述待鑒定雞的基因型為ZdwZllw或候選為ZdwZllw bl)所述PCR擴增產物在瓊脂糖凝膠電泳顯示為200bp_300bp的一個條帶；b2)所述PCR擴增產物為247bp的片段；b3)所述PCR擴增產物在瓊脂糖凝膠電泳顯示為500bp_600bp的一個條帶；b4)所述PCR擴增產物為522bp的片段；b5 )所述PCR擴增產物在瓊脂糖凝膠電泳顯示為200bp_300bp的一個條帶和500bp-600bp 的一個條帶； b6)所述PCR擴增產物為247bp的片段和522bp的片段；c)以待鑒定雞的基因組DNA或總RNA反轉錄得到的cDNA為模板，用所述引物對I進行PCR擴增，檢測得到的PCR擴增產物，根據PCR擴增產物確定所述待鑒定雞的基因型為ZdwZdw或ZdwW,或候選為ZdwZdw或ZdwW ;或確定所述待鑒定雞的基因型為非ZdwZdw或非ZdwW,或候選為非ZdwZdw或非ZdwW 若所述PCR擴增產物滿足所述bl)或b2)的條件，則確定所述待鑒定雞的基因型為 ZdwZdw 或 ZdwW,或候選為 ZdwZdw 或 ZdwW ；若所述PCR擴增產物不滿足所述bl)或b2)的條件，則確定所述待鑒定雞的基因型為非ZdwZdw或非ZdwW,或候選為非ZdwZdw或非ZdwW ；d)以待鑒定雞的基因組DNA或總RNA反轉錄得到的cDNA為模板，用所述引物對2進行PCR擴增，檢測得到的PCR擴增產物，根據PCR擴增產物確定所述待鑒定雞的基因型為ZdwZdw或ZDwW，或候選為ZdwZdw或ZdwW ;或確定所述待鑒定雞的基因型為非ZdwZdw或非ZDwW，或候選為非ZdwZdw或非ZdwW 若所述PCR擴增產物滿足所述b3)或b4)的條件，則確定所述待鑒定雞的基因型為 ZdwZdw 或 ZDwW，或候選為 ZdwZdw 或 ZdwW ；若所述PCR擴增產物不滿足所述b3)或b4)的條件，則確定所述待鑒定雞的基因型為非ZdwZdw或非ZdwW或候選為非ZdwZdw或非ZdwW ；所述引物對I由序列表中序列I所示的引物和序列表中序列2所示的引物組成；所述引物對2由序列表中序列3所示的引物和序列表中序列4所示的引物組成。上述方法中，所有所述多重PCR擴增和所有所述PCR擴增的退火條件具體可為570C 30 秒。上述方法中，所有所述多重PCR擴增和所有所述PCR擴增的條件可為95°C預變性5分鐘；然后按照下列參數進行循環反應95°C預變性5分鐘；94°C變性30秒，57°C復性30秒，72°C延伸35秒，循環35次；循環反應結束后在72°C保持7分鐘。上述成套引物對或引物對、試劑盒、或方法在雞的育種中的應用也屬于本發明的保護范圍。其中，上述成套引物對中引物對I和引物對2均單獨包裝。上述方法中，247bp和522bp PCR產物的大小可采用測序、聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測。本發明在GHR基因缺失段內部設計檢測雞Dw基因引物對2，在GHR基因缺失段的上、下游設計檢測雞dw基因引物對1，這樣，利用多重PCR反應體系，利用缺失區段內部的引物和缺失區段兩端的引物進行同時擴增，這樣ZdwZdw或ZdwW基因型個體只能檢測到缺失后的片段，ZdwZdw或ZdwW基因型個體只能檢測到未缺失區段的擴增產物，而雜合子ZdwZllw個體則能同時檢測到這兩個片段。這一方法檢測手段操作簡單，檢測結果準確可信，適合在性連鎖矮小型雞育種工作中進行應用。
圖I為基因型為ZdwZdw的壽光雞公雞的凝膠電泳圖。圖2為基因型為ZdwZdw的明星C系公雞的凝膠電泳圖。圖3為由基因型為ZdwZdw的壽光雞公雞與基因型為ZdwW的明星C系母雞雜交后回交一代公雞性連鎖矮小型雜合子ZdwZllw的凝膠電泳圖。圖4為公雞性連鎖矮小型純合子ZdwZdw和公雞性連鎖矮小型雜合子ZdwZllw的制備流程圖。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例I、用于鑒定或輔助鑒定雞是否含有dw基因和/或Dw基因的試劑盒該試劑盒中的試劑由成套引物對和PCRmix組成。成套引物對由檢測雞dw基因的引物對I和檢測雞Dw基因的引物對2組成。引物對I由序列表中序列I所不的引物和序列表中序列2所示的引物組成；引物對2由序列表中序列3所示的引物和序列表中序列4所示的引物組成。該試劑盒中引物對I和引物對2分別單獨包裝。PCRmix (北京匯天東方科技有限公司)其中，檢測雞dw基因引物對I根據伴性矮小型雞GHR基因3’端缺失段的上游和下游設計；引物對I的正向引物在GHR基因3’端缺失段的上游90bp處設計，反向引物根據GHR基因的缺失段的下游157bp處設計。引物對I用于檢測雞性連鎖矮小突變等位基因dw基因。檢測雞Dw基因的引物對2在GHR基因的缺失段內部設計，引物對2的正向引物根據GHR基因缺失段內部的上游設計，反向引物根據GHR基因缺失段內部的下游設計。引物對2用于檢測雞非矮小等位基因Dw基因。引物對I和引物對2的具體序列及擴增產物大小如表I。表I本發明設計的PCR擴增弓丨物
權利要求
1.成套引物對或引物對，為下述I)-3)中的任一種 1)用于鑒定或輔助鑒定雞是否含有dw基因和/或Dw基因的成套引物對，由檢測雞dw基因的引物對I和檢測雞Dw基因的引物對2組成；所述引物對I由序列表中序列I所不的引物和序列表中序列2所示的引物組成；所述引物對2由序列表中序列3所示的引物和序列表中序列4所示的引物組成； 2)用于鑒定或輔助鑒定雞是否含有dw基因的引物對，為檢測雞dw基因的引物對I;所述引物對I由序列表中序列I所示的引物和序列表中序列2所示的引物組成； 3)用于鑒定或輔助鑒定雞是否含有Dw基因的引物對，為檢測雞Dw基因的引物對2;所述引物對2由序列表中序列3所示的引物和序列表中序列4所示的引物組成。
2.權利要求I所述的成套引物對或引物對在制備產品中的應用，其特征在于所述應用為如下I、II和III中的任一種 I、由檢測雞dw基因的引物對I和檢測雞Dw基因的引物對2組成的成套引物對在制備鑒定或輔助鑒定雞是否含有dw基因和/或Dw基因產品中的應用；所述引物對I由序列表中序列I所示的引物和序列表中序列2所示的引物組成；所述引物對2由序列表中序列3所示的引物和序列表中序列4所示的引物組成； II、檢測雞dw基因的引物對I在制備鑒定或輔助鑒定雞是否含有dw基因產品中的應用；所述引物對I由序列表中序列I所示的引物和序列表中序列2所示的引物組成； III、檢測雞Dw基因的引物對2在制備鑒定或輔助鑒定雞是否含有Dw基因的產品中的應用；所述引物對2由序列表中序列3所示的引物和序列表中序列4所示的引物組成。
3.權利要求I所述的成套引物對或引物對的制備方法，包括如下I)-3)中的任一步驟 1)以dATP，dTTP，dCTP和dGTP為原料制備序列表中序列I、序列2、序列3和序列4所示的4種單鏈DNA，得到所述引物對I和所述引物對2 ； 2)以dATP，dTTP，dCTP和dGTP為原料制備序列表中序列I和序列2所示的2種單鏈DNA，得到所述引物對I ; 3)以dATP，dTTP,dCTP和dGTP為原料制備序列表中序列3和序列4所示的2種單鏈DNA，得到所述引物對2。
4.試劑盒，其特征在于所述試劑盒為下述I)-3)中的任一種 1)用于鑒定或輔助鑒定雞是否含有dw基因和/或Dw基因的試劑盒，所述試劑盒含有由檢測雞dw基因的引物對I和檢測雞Dw基因的引物對2組成的成套引物對；所述引物對I由序列表中序列I所示的引物和序列表中序列2所示的引物組成；所述引物對2由序列表中序列3所示的引物和序列表中序列4所示的引物組成； 2)用于鑒定或輔助鑒定雞是否含有dw基因的試劑盒，所述試劑盒含有檢測雞dw基因的引物對I ;所述引物對I由序列表中序列I所示的引物和序列表中序列2所示的引物組成； 3)用于鑒定或輔助鑒定雞是否含有Dw基因的試劑盒，所述試劑盒含有檢測雞Dw基因的引物對2 ;所述引物對2由序列表中序列3所示的引物和序列表中序列4所示的引物組成。
5.權利要求4所述的試劑盒的制備方法，包括如下I)-3)中的任一步驟1)以dATP，dTTP，dCTP和dGTP為原料制備序列表中序列I、序列2、序列3和序列4所示的4種單鏈DNA，得到所述引物對I和所述引物對2 ； 2)以dATP，dTTP,dCTP和dGTP為原料制備序列表中序列I和序列2所示的2種單鏈DNA，得到所述引物對I ; 3)以dATP，dTTP,dCTP和dGTP為原料制備序列表中序列3和序列4所示的2種單鏈DNA，得到所述引物對2。
6.鑒定或輔助鑒定雞是否含有dw基因和/或Dw基因的方法，包括如下步驟M)、N)或P) M)以待鑒定雞的基因組DNA或總RNA反轉錄得到的cDNA為模板，用檢測雞dw基因的引物對I和檢測雞Dw基因的引物對2進行多重PCR擴增，檢測得到的PCR擴增產物，根據PCR擴增產物確定待鑒定雞是否含有dw基因和/或Dw基因，或是否候選含有dw基因和/或Dw基因 若所述PCR擴增產物滿足如下ml)或m2)的條件，則確定所述待鑒定雞含有dw基因或候選含有dw基因，若所述PCR擴增產物不滿足如下ml)或m2)的條件，則確定所述待鑒定雞不含有dw基因或候選不含有dw基因； 若所述PCR擴增產物滿足如下m3)或m4)的條件，則確定所述待鑒定雞含有Dw基因或候選含有Dw基因，若所述PCR擴增產物不滿足如下m3)或m4)的條件，則確定所述待鑒定雞不含有Dw基因或候選不含有Dw基因； 若所述PCR擴增產物滿足如下m5)或m6)的條件，則確定所述待鑒定雞含有dw基因和Dw基因或候選含有dw基因和Dw基因，若所述PCR擴增產物不滿足如下m5)或m6)的條件，則確定所述待鑒定雞不含有dw基因和Dw基因或候選不含有dw基因和Dw基因ml)所述PCR擴增產物在瓊脂糖凝膠電泳顯示含有200bp-300bp的一個條帶；m2)所述PCR擴增產物含有247bp的片段； m3)所述PCR擴增產物在瓊脂糖凝膠電泳顯示含有500bp-600bp的一個條帶； m4)所述PCR擴增產物含有522bp的片段； m5 )所述PCR擴增產物在瓊脂糖凝膠電泳顯示為200bp-300bp的一個條帶和500bp-600bp 的一個條帶； m6)所述PCR擴增產物為247bp的片段和522bp的片段； N)以待鑒定雞的基因組DNA或總RNA反轉錄得到的cDNA為模板，用檢測雞dw基因的引物對I進行PCR擴增，檢測得到的PCR擴增產物，根據PCR擴增產物確定待鑒定雞是否含有dw基因，若所述PCR擴增產物滿足如下nl)或n2)的條件，則確定所述待鑒定雞含有dw基因或候選含有dw基因，若所述PCR擴增產物不滿足如下nl)或n2)的條件，則確定所述待鑒定雞不含有dw基因或候選不含有dw基因； nl)所述PCR擴增產物在瓊脂糖凝膠電泳顯示為200bp-300bp的一個條帶； n2)所述PCR擴增產物為247bp的片段； P)以待鑒定雞的基因組DNA或總RNA反轉錄得到的cDNA為模板，用檢測雞Dw基因的引物對2進行PCR擴增，檢測得到的PCR擴增產物，根據PCR擴增產物確定待鑒定雞是否含有Dw基因，若所述PCR擴增產物滿足如下pi)或p2)的條件，則確定所述待鑒定雞含有Dw基因或候選含有Dw基因，若所述PCR擴增產物不滿足如下pi)或p2)的條件，則確定所述待鑒定雞不含有Dw基因或候選不含有Dw基因； Pl)所述PCR擴增產物在瓊脂糖凝膠電泳顯示為500bp-600bp的一個條帶； P2)所述PCR擴增產物為522bp的片段； 所述引物對I由序列表中序列I所示的引物和序列表中序列2所示的引物組成；所述弓丨物對2由序列表中序列3所示的引物和序列表中序列4所示的引物組成。
7.鑒定或輔助鑒定雞基因型的方法，包括如下b)-d)中的任一步驟 b)以待鑒定雞的基因組DNA或總RNA反轉錄得到的cDNA為模板，用檢測雞dw基因的引物對I和檢測雞Dw基因的引物對2進行多重PCR擴增，檢測得到的PCR擴增產物，根據PCR擴增產物確定待鑒定雞的基因型是ZdwZdw、ZdwW、ZDwZD\ ZdwW和ZdwZllw這五種基因型中的 哪一種、或候選為Zdwzdw、ZdwW、ZDwZDw、ZdwW和ZdwZllw這五種基因型中的哪一種 若所述PCR擴增產物滿足如下bl)或b2)的條件，則確定所述待鑒定雞的基因型為ZdwZdw或ZdwW,或候選為ZdwZdw或ZdwW ;若所述PCR擴增產物滿足如下b3)或b4)的條件，則確定所述待鑒定雞的基因型為ZdwZdw或ZDwW，或候選為ZdwZdw或ZdwW ;若所述PCR擴增產物滿足如下b5)或b6)的條件，則確定所述待鑒定雞的基因型為ZdwZllw或候選為ZdwZllw bl)所述PCR擴增產物在瓊脂糖凝膠電泳顯示為200bp-300bp的一個條帶；b2)所述PCR擴增產物為247bp的片段； b3)所述PCR擴增產物在瓊脂糖凝膠電泳顯示為500bp-600bp的一個條帶； b4)所述PCR擴增產物為522bp的片段； b5 )所述PCR擴增產物在瓊脂糖凝膠電泳顯示為200bp-300bp的一個條帶和.500bp-600bp 的一個條帶； b6)所述PCR擴增產物為247bp的片段和522bp的片段； c)以待鑒定雞的基因組DNA或總RNA反轉錄得到的cDNA為模板，用所述引物對I進行PCR擴增，檢測得到的PCR擴增產物，根據PCR擴增產物確定所述待鑒定雞的基因型為ZdwZdw或ZdwW,或候選為ZdwZdw或ZdwW ;或確定所述待鑒定雞的基因型為非ZdwZdw或非ZdwW,或候選為非ZdwZdw或非ZdwW 若所述PCR擴增產物滿足所述bl)或b2)的條件，則確定所述待鑒定雞的基因型為ZdwZdw 或 ZdwW,或候選為 ZdwZdw 或 ZdwW ； 若所述PCR擴增產物不滿足所述bl)或b2)的條件，則確定所述待鑒定雞的基因型為非ZdwZdw或非ZdwW,或候選為非ZdwZdw或非ZdwW ； d)以待鑒定雞的基因組DNA或總RNA反轉錄得到的cDNA為模板，用所述引物對2進行PCR擴增，檢測得到的PCR擴增產物，根據PCR擴增產物確定所述待鑒定雞的基因型為ZdwZdw或ZDwW，或候選為ZdwZdw或ZdwW ;或確定所述待鑒定雞的基因型為非ZdwZdw或非ZDwW，或候選為非ZdwZdw或非ZdwW 若所述PCR擴增產物滿足所述b3)或b4)的條件，則確定所述待鑒定雞的基因型為ZdwZdw 或 ZDwW，或候選為 ZdwZdw 或 ZdwW ； 若所述PCR擴增產物不滿足所述b3)或b4)的條件，則確定所述待鑒定雞的基因型為非ZdwZdw或非ZdwW或候選為非ZdwZdw或非ZdwW ； 所述引物對I由序列表中序列I所示的引物和序列表中序列2所示的引物組成；所述弓丨物對2由序列表中序列3所示的引物和序列表中序列4所示的引物組成。
8.根據權利要求6或7所述的方法，其特征在于所有所述多重PCR擴增和所有所述PCR擴增的退火條件為57°C 30秒。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于所有所述多重PCR擴增和所有所述PCR擴增的條件為95°C預變性5分鐘；然后按照下列參數進行循環反應95°C預變性5分鐘；94°C變性30秒，57°C復性30秒，72°C延伸35秒，循環35次；循環反應結束后在72°C保持7分鐘。
10.權利要求I所述的成套引物對或引物對、權利要求4所述的試劑盒、或權利要求6-9中任一所述的方法在雞的育種中的應用。
全文摘要
本發明公開了鑒定雞的性連鎖矮小基因的一種方法及其專用引物。本發明所提供的用于鑒定或輔助鑒定雞是否含有dw基因和/或Dw基因的成套引物對，由檢測雞dw基因的引物對1和檢測雞Dw基因的引物對2組成；所述引物對1由序列表中序列1所示的引物和序列表中序列2所示的引物組成；所述引物對2由序列表中序列3所示的引物和序列表中序列4所示的引物組成。本發明通過在GHR基因缺失片段內部設計引物，利用多重PCR反應體系，將缺失區段內部的引物和缺失區段兩端的引物進行同時擴增。這一方法檢測手段操作簡單，檢測結果準確可信，適合在性連鎖矮小型雞育種工作中進行應用。
文檔編號C12Q1/68GK102747077SQ20121020769
公開日2012年10月24日 申請日期2012年6月18日 優先權日2012年6月18日
發明者吳常信, 肖凡, 葛雅瓊, 鄧學梅, 魏霞 申請人:中國農業大學