一種檢測Leber病調控子的試劑盒及用途的制作方法

專利名稱：一種檢測Leber病調控子的試劑盒及用途的制作方法
技術領域：
本發明屬生物技術領域，涉及一種與Leber病調控子相關的線粒體基因突變的檢測方法，特別涉及檢測線粒體tRNAMet A4435G突變的方法，還涉及用于檢測與Leber病調控子相關的線粒體DNA A4435G突變的試劑盒，以及上述方法或上述的試劑盒在檢測與Leber病調控子相關的線粒體DNA A4435G突變中的應用。
背景技術：
Leber 遺傳性視神經病變(Leber，s Hereditary Optic Neuropathy, LH0N,簡稱Leber病)是視神經病變的一種類型，主要累及視網膜、鞏膜篩板前部視乳頭黃斑束纖維，導致視神經退行性變的母系遺傳病，嚴重的影響著人們正常的生產、生活。根據國家衛生部(http://www. moh. gov. cn/)最新數據統計我國現有的低視力人口約有710萬,盲人約有500萬，占總人數的0. 4%，成為世界上視力損傷最嚴重的國家之一。其中，由視神經病變引起的約為55萬。1871年德國眼科醫生Theodor Leber首次報道該病的臨床癥狀、體征和遺傳特性。1972年Erickson等發現LHON的遺傳方式呈典型的母系遺傳特征。1988年WallaceDC等發現了第一個與LHON相關的線粒體基因組DNA (mitochondria DNA, mtDNA)突變位為、ND4 G11778A。目前已報道50多種線粒體DNA突變位點與LHON致病相關(http://WWW.mitomap. org/)，其中 tRNAMet A4435G 和 tRNAThr A15951G 等被稱為 “Leber 病調控子”。與線粒體DNA突變相關的Leber遺傳性視神經病變在早期臨床癥狀不明顯，早期的檢查常常會因此被耽誤，尤其在我國偏遠農村地區，這種情況普遍存在。因此，在高危人群和易感人群中開展mtDNA突變篩查，對于預防和控制與線粒體相關的LHON的發生有著極其重要的作用。自發現與mtDNA突變相關的疾病以來，檢測線粒體突變位點的檢測方法主要還是序列測定。直接測序法是鑒定突變的黃金標準，但該操作繁瑣，費用昂貴限制了它的廣泛應用。近年來，國內相繼報道了 Leber遺傳性視神經病變的基因診斷試劑盒及其檢測方法，以滿足對線粒體突變突變進行廣泛篩查的需要，如福建醫科大學于2005年申請了的基因診斷試劑盒及其檢測方法專利(專利號200510006097. 8)，該發明是根據90 %以上的Leber氏遺傳性視神經病變患者的線粒體DNA突變屬于3個原發性致病位點突變(G11778A、G3460A和T14484C)，設計和合成位點特異性PCR引物，直接以全血樣作PCR的DNA模板，利用等位基因特異性多重PCR技術，單管一次性PCR反應，同時檢測LHON患者的線粒體DNA的3個原發性致病突變位點，具有簡便快速、高效、費用低、特異性好、只需微量血液樣本等優點，為LHON患者的快速臨床基因診斷提供一種簡易、可靠的方法和試劑盒，具有巨大的普及推廣應用價值。但是該方法存在血液中直接PCR擴增的難度加大，實驗中采取的多重PCR的條件要求將會增加，檢測方法跟普通的方法沒有本質的區別。2006年杭州優思達生物科技有限公司建立一種以單核苷酸多態性核酸試紙快速檢測LHON線粒體DNA中G11778A位點突變的新方法(專利號200610003429. I)。在應用單核苷酸多態性核酸檢測試紙條進行多態位點或突變位點的檢測時，需要設計一條特異性延伸引物，這條引物的3’端堿基緊臨多態性堿基或突變堿基，其在DNA聚合酶的作用下開始延伸，帶有抗原標記與模板對應的雙脫氧單核苷酸(ddNTP)被連接到延伸引物上。雖然該方法能夠實現短時間內的檢測陽性位點，但PCR 擴增條件嚴格，存在假陰性的幾率大大增加。

發明內容
本發明的目的是提供一種檢測Leber病調控子相關的線粒體DNA突變的試劑盒，由引物序列、提取樣本基因組DNA的試劑、PCR擴增反應試劑、陽性標本對照、陰性標本對照以及使用說明書構成，其中，提取樣本基因組DNA的試劑主要由細胞裂解液和溶液I (主要成分是蛋白酶K)組成；PCR擴增反應試劑包括dNTP、10XPCR緩沖液、MgCl2、三蒸水和Taq酶，所述的引物序列外前向引物F: TGG CTC CTT TAA CCT CTC CA，外反向引物R: AAG GATTAT GGA TGC GGT TG;內前向引物 F: CCT ACC ACT CAC CCT AGC AT，內反向引物 R: AATCAG TGC GAG CTT AGC GC ;限制性內切酶包括限制性內切酶III ;陽性標本對照是含有線粒體序列第4435位點發生A>G突變的酶切樣本、陰性標本對照是不含有線粒體序列第4435位點發生A>G突變的酶切樣本。在上述試劑盒中，在PCR擴增反應試劑中添加用于提高延伸反應特異性的少許二甲基亞砜(0. 1-0. 2 y I為宜)。本發明的再一個目的是提供所述試劑盒在檢測與Leber病調控子相關的線粒體基因mtDNA A4435G突變中的應用。通過以下步驟實現
(1)基因組DNA的提取運用蛋白酶K消化裂解法，從少量的血液標本、帶毛囊的毛發、口腔粘膜刮片、血濾紙片或唾液的樣本中提取基因組DNA ;
(2)特異性PCR擴增使用Primer5. 0軟件和01igo7. 0軟件根據SEQ ID N0:5所示的人類線粒體基因序列設計引物包含突變位點的基因片段3777-4679，外前向引物F: TGGCTC CTT TAA CCT CTC CA (SEQ ID NO: 1)，外反向引物 R: AAG GAT TAT GGA TGC GGT TG(SEQ ID NO: 2);內前向引物 F: CCT ACC ACT CAC CCT AGC AT (SEQ ID NO: 3)，內反向引物 R: AAT CAG TGC GAG CTT AGC GC (SEQ ID N0:4)；
(3)酶切鑒定將上述PCR產物用限制性內切酶A^aIII對A4435G突變位點處進行酶切；
(4)突變檢測瓊脂糖凝膠電泳檢測，直接根據酶切PCR產物產生的DNA片段數量及DNA片段大小，檢測mtDNA是否發生A4435G突變。在上述檢測A4435G突變的方法的步驟(I)中，樣本來源于從毛細血管靜脈血標本、帶毛囊的毛發、口腔粘膜刮片、血濾紙片或唾液，根據取樣方式或被測樣本形式不同，對不同樣本進行相應的預處理，樣本預處理方法如下
(1)血標本或血濾紙片取20 200ill少量血標本(如一滴血)或Icm2的血濾紙片放A I. 5ml EP 管(Eppendorf 管)，加入 900 U I 紅細胞裂解緩沖液(20mmol/L Tris-HCl，pH
7.6)室溫靜置lOmin，充分裂解紅細胞，12000rpm離心lmin，收集白細胞沉淀；
(2)帶毛囊的毛發用70%乙醇洗帶毛囊的毛發I次，后再用蒸餾水沖洗毛發2次。在1.5ml EP管中分別放入2 4根毛發，毛囊置于EP管底部，用干凈的剪刀剪去毛發高于EP管的部分；
(3)口腔粘膜刮片或唾液收集唾液前，必須讓被收集者漱口。以除去口腔中過多的老化細胞、食物殘渣、牙膏、咖啡、煙等物質。半小時內不要喝水、進食、吸煙，然后開始收集口腔粘膜刮片或唾液，可視條件選擇如下方法收集唾液樣本①舌頭圍繞口腔刮取粘膜細胞，將約0. Iml唾液直接吐進EP管內生理鹽水漱口，吐進EP管內，吸取PBS溶液至裝有通過上述任一種方法收集的唾液樣本的EP管中，反復吹打后，12000rpm離心5min，除去上清，重復該過程一次用棉拭子反復刮拭面頰內壁6次，空氣中干燥，然后用滅菌過的鑷子小心撕去其外表面，放入EP管中將唾液吐在濾紙上，空氣中干燥后形成唾液斑，再用干凈的剪刀剪成大小約Icm2碎紙片置于EP管中。
在步驟(I)中經過上述預處理后，用細胞裂解液和蛋白酶K對上述樣本進行消化裂解，再鹽析法去除蛋白等雜質，異丙醇沉淀DNA，最后用高壓滅菌水或TE緩沖液溶解后于-20°C保存備用。在上述檢測方法的步驟(2)中，引物設計的指導思想是，針對A4435G位點存在的位置，利用巢式PCR擴增基因片段；針對4435位點設計內外巢式引物(參照圖I)。在上述檢測方法的步驟(3)中，針對特異性PCR擴增后，A4435G位點形成了新的酶切位點。其酶切位點是由mtDNA A4435G突變形成的，其中的限制性內切酶為犯a III ；
用以上設計的引物，以相應的被檢測樣本的DNA為模板，通過PCR外引物擴增后分別獲得明亮清晰的大小約903bp的恒定擴增帶，在使用內引物擴增出365bp擴增帶4435突變位點在擴增片段上。在上述檢測Leber病調控子突變的方法中，結合特異性PCR技術和酶切技術，每份DNA樣本分別用特異性引物即外/內引物于PCR反應管中進行巢式PCR擴增，然后進行突變位點處的酶切，通過PCR酶切后便可在幾小時內檢出Leber病調控子相關的mtDNA A4435G突變。理論上，基因組DNA樣本經PCR反應，即體系中僅加入針對突變型位點A4435G引物F#/R#后，擴增后以此產物為模板再在引物F@/R#下進行巢式PCR擴增，然后用限制性內切酶III進行酶切，就可進行檢測。也就是說，同DNA樣本經巢式PCR-酶切，從而使檢測結果更為準確、可信。用本發明的方法及其制備的體外檢測Leber病調控子相關的線粒體基因mtDNAA4435G突變試劑盒具有以下特點
I.傳統上獲得Leber遺傳性視神經病變患者基因組DNA的方法是從血液中提取，每人大約需要3 5ml。這種采血方法給很多被檢者尤其是嬰幼兒帶來了一些痛苦和傷害，而且在跨地區傳遞樣本時存在一定的風險和麻煩。本發明運用蛋白酶K消化裂解法，從少量的血液標本(如一滴血)、帶毛囊的毛發、口腔粘膜刮片血濾紙片或唾液等樣本中快速提取基因組DNA。該方法解決了傳統上從Leber遺傳性視神經病變患者血液中提取DNA的問題，減輕被檢者的痛苦；而且還解決了跨地區傳遞樣本的問題，血濾紙片、毛發以及口腔粘膜刮片(棉拭子)或唾液斑濾紙片等可以很容易的放在信封內，并可通過郵寄的方式跨地區傳遞。2.目前國內外有幾種線粒體相關的母系遺傳性疾病基因診斷方法，如直接測序法熒光定量PCR檢測方法、基因芯片檢測方法等，由于其自身的缺陷，如費時費力、操作繁瑣以及檢測費用偏高而不易在臨床進行推廣。與這些方法相比較，PCR-酶切技術則結合了特異性PCR技術及酶切技術兩者的優點，每份DNA樣本用特異性引物即引物F/R于PCR反應管中進行特異性巢式PCR擴增，通過巢式PCR-酶切便可在幾小時內同時檢出mtDNA A4435G突變。另外值得一提的是，本方法所用的引物均經過仔細設計。首先，正常和突變等位基因間不同的堿基在酶切過程中對特異性限制性內切酶形成的位點不同，因而大大提高了酶切的特異性；另外由正常對照和空白對照的產物可作為整個PCR反應的分子內控指標，從而避免假陰性結果的出現，提高檢測結果的穩定性。通過調整不同引物的濃度和比例以及對PCR反應條件進行優化，以確保結果的特異性和穩定性。3.應用本發明提供的試劑盒進行mtDNA A4435G突變檢測，成本較其他檢測方法更低；檢測流程簡便、快速，結果判讀直觀；對實驗設備及操作人員無特殊要求，適合在一般醫院、分子生物實驗室開展，便于在全國范圍內特別是欠發達地區實行Leber病調控子相關的mtDNA A4435G突變的大規模篩查和預防性檢查。4.本發明是針對目前檢測tRNAMet A4435G突變的方法所存在的缺點提出的一種快速、簡便、準確、經濟的LHON相關基因突變檢測方法。


圖I是本發明的基因特異性巢式PCR擴增方案示意圖。圖2是攜帶A4435G突變(WZL4家系)Leber遺傳性視神經病變家系系譜圖。圖3是本發明的基因特異性巢式PCR引物示意圖。圖4是基因特異性巢式PCR擴增酶切鑒定mtDNA A4435G突變的7%聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。
圖I和2中F#為特異性巢式PCR第一次擴增的正向引物；R#為特異性巢式PCR第一次擴增的反向引物，與F#配對使用；F#為特異性巢式PCR第二次擴增的正向引物，R內為特異性巢式PCR第二次擴增的反向引物，與F肖配對使用；A4435G表示為線粒體DNA第4435位，野生型為A，發生基因突變后為G。圖3中□為正常男性個體；〇為正常女性個體；■為發病男性個體；籲為發病女性個體；，為先證者；/為已死亡的個體；I為該家系的第一代成員；II為該家系的第二代成員；111為該家系的第三代成員。圖4中Rl表示野生型位點檢測的PCR擴增產物的電泳圖(正常對照者);R2表示先證者(WZL4- III -2)攜帶A4435G突變位點檢測的PCR擴增產物(未酶切)的電泳圖；R3為攜帶A4435G突變的先證者父親(WZL4- II -I) ;R4表示先證者攜帶A4435G突變位點檢測的PCR擴增產物酶切鑒定的電泳圖；R5為攜帶A4435G突變的先證者母親(WZL4- II -2)；R6-R12分別為母系成員攜帶A4435G突變并且LHON患者。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步說明，以使本領域的技術人員可以更好的理解本發明并能予以實施，但所舉實施例不作為對本發明的限定。實施例I攜帶線粒體基因A4435G突變和原發性G11778A突變的Leber遺傳性視神經病變家系的檢測，見圖I。I.檢測樣本
選擇I個攜帶A4435G突變的Leber遺傳性視神經病變家系(WZL4家系)。其家系圖見圖2。這個家系呈現典型的母系遺傳，發病者均以視力下降不能矯正為唯一的臨床癥狀，但是家系中每個成員的視力損傷程度從輕度到極重度不等。這個家系總人數為25人，其中母系成員數為14人，視力下降患者有8人。2.基因組DNA的提取
分別獲取這8名受檢者的血濾紙片(一滴血)，將血濾紙片用干凈的剪刀剪成大小約Icm2的碎紙片放入I. 5ml EP管(Eppendorf管),加入900 y I紅細胞裂解緩沖液(20mmol/L Tris-HCl，pH 7. 6)室溫靜置lOmin，充分裂解紅細胞，12000rpm離心lmin，收集白細胞沉淀；然后加入600 u I細胞裂解液，混勻后再加入溶液I，使得蛋白酶K的工作濃度為20 V- g/mlo充分混勻后55°C消化裂解,接著以鹽析法去除蛋白等雜質,異丙醇沉淀DNA,最后用高壓滅菌水或TE緩沖液溶解后于_20°C保存備用。3.引物設計
使用Primer 5. 0軟件和01igo7. 0軟件協助設計改良引物,根據已公開的人類線粒體基因劍橋參考序列(SEQ ID N0:5)進行設計，引物的設計方案(見圖3)如下
針對mtDNA 4435位點，保證引物設計的特異性，我們設計巢式PCR兩對引物F#/R外，F;它們長度、退火溫度相近便于實驗條件穩定，以增強特異性。由此設計出的4435位點的巢式PCR引物為外前向引物F外TGG CTC CTT TAA CCT CTC CA，外反向引物R外AAGGAT TAT GGA TGC GGT TG;內前向引物 F 內CCT ACC ACT CAC CCT AGC AT，內反向引物 R: AAT CAG TGC GAG CTT AGC GC。4.基因特異性巢式PCR擴增
根據上述設計的4條引物序列，通過人工合成(委托生物公司)獲得2對引物，以上述提取的被檢樣本基因組DNA為模板，進行基因特異性巢式PCR擴增和7%的聚丙烯酰胺凝膠電泳酶切鑒定。表I基因特異性巢式PCR擴增反應體系(TAKARA公司產品)
PCR擴増反應試劑所需量
10 X PCR緩沖液1^1
dHTP (200 nmol/L)0.8M-1
MgCl； (25 umol/L)0.8 M-1
Fj-! F *0.4 M-I
引物--
R R *o.4Hi
Taq 聚合酶(5 U/M-l)0.2M-1
模板MA20ng
二塞水 UP t0 一__10 M-1
巢式PCR循環參數使用外引物為94°C預變性5min，接著94°C變性30s，58°C退火30s，72 °C延伸30s，重復循環30次后，然后使用內引物94°C變性30s，55°C退火30s，72 °〇延伸30s，重復循環30次后，最后于72 °C再延伸5 min。PCR產物5 10 yl在7%的聚丙烯酰胺凝膠中電泳，經EB染色后在凝膠成像儀上觀察并照相記錄結果。5.結果
根據圖4可知，當先證者和正常對照樣本的基因組DNA分別經2對引物F#/R#，F內/R@巢式PCR酶切鑒定后，只產生一條365bp恒定擴增帶，經限制性內切酶酶切鑒定后，產生的恒定擴增帶被限制性內切酶切成兩段(參見圖4泳道R4)，證明先證者樣品含mtDNA A4435G突變；而經限制性內切酶酶切鑒定后，產生的恒定擴增帶沒有被限制性內切酶切成兩段(參見圖4泳道R1)，證明該樣品不含mtDNA A4435G突變。家系WZL4的先證者(WZ4L- III -2)的基因組DNA經2對引物F外/R外，、/1^進行巢式PCR后，出現了 I條365bp的恒定擴增帶(參見圖4泳道R2);而經限制性內切酶酶切后，出現了兩條分別為251bp和114bp條酶切條帶(參見圖4泳道R4)，證明了該樣品攜帶mtDNA A4435G突變。R3為攜帶A4435G突變的先證者父親(WZL4- II -I) ;R4表示先證者攜帶A4435G突變位點檢測的PCR擴增產物酶 切鑒定的電泳圖；R5為攜帶A4435G突變的先證者母親(WZL4- II -2) ;R6_R12分別為母系成員攜帶A4435G突變并且LHON患者。6.基因特異性巢式PCR擴增檢測方法可靠性的檢驗
經基因特異性巢式PCR擴增酶切鑒定后，我們在家系母系成員中檢測出攜帶A4435G突變陽性個體。進一步將這些標本的PCR擴增產物進行測序分析，測序結果與基因特異性巢式PCR擴增結果相吻合，說明使用本發明方法檢測線粒體基因A4435G突變的可靠性和穩定性。基因特異性巢式PCR技術與熒光定量PCR技術、測序及基因芯片技術相比具有如下優點(見表3)。表3本專利與其他相關專利技術指標對照
權利要求
1.一種檢測Leber病調控子相關的線粒體DNA突變的試劑盒，由引物序列、提取樣本基因組DNA的試劑、PCR擴增反應試劑、陽性標本對照、陰性標本對照以及使用說明書構成；其中，提取樣本基因組DNA的試劑由細胞裂解液和主要成分是蛋白酶K的溶液I組成；PCR擴增反應試劑包括dNTP、10XPCR緩沖液、MgCl2、三蒸Taq水和酶；引物序列是外前向引物 F: TGG CTC CTT TAA CCT CTC CA，外反向引物 R: AAG GAT TAT GGA TGC GGT TG;內前向引物 F: CCT ACC ACT CAC CCT AGC AT，內反向引物 R: AAT CAG TGC GAG CTT AGC GC;限制性內切酶包括限制性內切酶犯a III;陽性標本對照是含有線粒體序列第4435位點發生A>G突變的酶切樣本、陰性標本對照是不含有線粒體序列第4435位點發生A>G突變的酶切樣本。
2.根據權利要求I所述的一種檢測Leber病調控子相關的線粒體DNA突變的試劑盒，其特征在于，在上述試劑盒中，在PCR擴增反應試劑中添加0. 1-0. 2u I 二甲基亞砜。
3.權利要求I所述的一種檢測Leber病調控子相關的線粒體DNA突變的試劑盒在檢測與Leber病調控子相關的線粒體基因mtDNA A4435G突變中的應用。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，通過以下步驟實現· (1)基因組DNA的提取運用蛋白酶K消化裂解法，從少量的血液標本、帶毛囊的毛發、口腔粘膜刮片、血濾紙片或唾液的樣本中提取基因組DNA ; (2)特異性PCR擴增使用Primer5. 0軟件和01igo7. 0軟件根據SEQ ID NO: 5所示的人類線粒體基因序列設計引物包含突變位點的基因片段3777-4679，外前向引物F: TGGCTC CTT TAA CCT CTC CA，外反向引物 R: AAG GAT TAT GGA TGC GGT TG;內前向引物 F:CCT ACC ACT CAC CCT AGC AT，內反向引物 R: AAT CAG TGC GAG CTT AGC GC ； (3)酶切鑒定將上述PCR產物用限制性內切酶A^aIII對A4435G突變位點處進行酶切； (4)突變檢測瓊脂糖凝膠電泳檢測，直接根據酶切PCR產物產生的DNA片段數量及DNA片段大小，檢測mtDNA是否發生A4435G突變。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，在步驟(I)中，樣本來源于從毛細血管靜脈血標本、帶毛囊的毛發、口腔粘膜刮片、血濾紙片或唾液，根據取樣方式或被測樣本形式不同，對不同樣本進行預處理，樣本預處理方法如下 (1)血標本或血濾紙片取20 200ii I血標本或Icm2的血濾紙片放入I. 5mlEppendorf管，加入900 ill紅細胞裂解緩沖液室溫靜置lOmin，充分裂解紅細胞，12000rpm離心lmin，收集白細胞沉淀；所用緩沖液為20mmol/L Tris-HCl, pH 7. 6 ； (2)帶毛囊的毛發用70%乙醇洗帶毛囊的毛發I次，后再用蒸餾水沖洗毛發2次，在1.5ml Eppendorf管中分別放入2 4根毛發,毛囊置于Eppendorf管底部,用干凈的剪刀剪去毛發高于Eppendorf管的部分； (3)口腔粘膜刮片或唾液收集唾液前，必須讓被收集者漱口，以除去口腔中過多的老化細胞、食物殘渣、牙膏、咖啡、煙，半小時內不喝水、進食、吸煙，然后開始收集口腔粘膜刮片或唾液，選擇如下方法收集唾液樣本①舌頭圍繞口腔刮取粘膜細胞，將0. Iml唾液直接吐進Eppendorf管內！②生理鹽水漱口，吐進Eppendorf管內，吸取PBS溶液至裝有通過上述任一種方法收集的唾液樣本的Eppendorf管中，反復吹打后，12000rpm離心5min,除去上清，重復該過程一次用棉拭子反復刮拭面頰內壁6次，空氣中干燥，然后用滅菌過的鑷子小心撕去其外表面,放入Eppendorf管中；@將唾液吐在濾紙上，空氣中干燥后形成唾液斑，再用干凈的剪刀剪成Icm2碎紙片置于Eppendorf管中。
6.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，在步驟(I)中經過預處理后，用細胞裂解液和蛋白酶K對上述樣本進行消化裂解，再鹽析法去除蛋白等雜質，異丙醇沉淀DNA，最后用高壓滅菌水或TE緩沖液溶解后于_20°C保存備用。
全文摘要
本發明提供一種檢測Leber病調控子相關的線粒體DNA突變的試劑盒，由引物序列、提取樣本基因組DNA的試劑、PCR擴增反應試劑、陽性標本對照、陰性標本對照以及使用說明書構成，限制性內切酶包括限制性內切酶NlaⅢ；陽性標本對照是含有線粒體序列第4435位點發生A>G突變的酶切樣本。本發明的試劑盒可在檢測與Leber病調控子相關的線粒體基因mtDNAA4435G突變中的應用。本發明可確保檢測結果的特異性和穩定性，成本較其他檢測方法更低，是檢測流程簡便、快速，準確、經濟的LHON相關基因突變檢測方法。
文檔編號C12Q1/68GK102747152SQ20121020765
公開日2012年10月24日 申請日期2012年6月24日 優先權日2012年6月24日
發明者冀延春, 張娟娟, 管敏鑫, 肖云, 蔣萍萍 申請人:浙江大學