專利名稱：產生無限克隆的慢性淋巴細胞白血病細胞的方法
技術領域：
本發明屬于生物領域，具體地，涉及一種產生無限克隆的慢性淋巴細胞白血病細胞的方法。
背景技術：
慢性淋巴細胞白血病是一種相對少見的惡性腫瘤，大約占所有癌癥的0. 8%，它是一種影響B淋巴細胞系的惡性腫瘤，其特點是產生大量不成熟的淋巴細胞，這些細胞在骨髓內聚集，抑制骨髓的正常造血；并且能夠通過血液在全身擴散，導致病人出現貧血、容易出血、感染及器官浸潤等。慢性淋巴細胞白血病是一種進展緩慢、惰性的腫瘤，患者通常保持無癥狀達數月至數年。發病原因仍未明確。慢性淋巴細胞白血病慢性淋巴細胞白血病可以發生于任何年齡的人群，但以60歲以上的人群最常見，男性比女性更常見。 因為慢性淋巴細胞白血病進展比較緩慢，所以很多病人沒有癥狀，尤其在早期的病人，隨著疾病的進展，白血病破壞骨髓正常造血功能，浸潤器官，引起了明顯但非特異的癥狀。包含有貧血，表現為乏力、頭暈、面色蒼白或活動后氣促等；反復感染且不易治好，主要由于缺少正常的白細胞，尤其是中性粒細胞；出血傾向容易出血、出血不止、牙齦出血、大便出血及月經不規則出血等，由于血小板減少引起；淺表淋巴結腫大、不明原因的消瘦及盜汗等。慢性淋巴細胞白血病是一種惰性的淋巴系統腫瘤，患者可以維持無癥狀長約數月至數年，不需要治療。但對于某些出現癥狀等需要治療，為了進一步研究可以用于治療或預防或抑制慢性淋巴細胞白血病藥物，在研發過程中進行藥物試驗、藥效試驗時，均需要大量的慢性淋巴細胞白血病細胞作為標本。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種產生無限克隆的慢性淋巴細胞白血病細胞的方法。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案是產生無限克隆的慢性淋巴細胞白血病細胞的方法，包括下述步驟
1)準備受過輻射的巨噬細胞分散在細胞培養器中；
2)從慢性淋巴細胞白血病病人的血樣中分離出外周血液單核細胞，將分離的外周血單個核細胞置于完全培養基中沖洗，沖洗后置于離心管中以1500RPM離心3分鐘；
3)將離心后的外周血單個核細胞重新分散于完全培養基中形成2*106個外周血單個核細胞/ml的完全培養基，該完全培養基包含50 V- g/ml的胰島素-反義c_myb-硫代磷酸寡脫氧核苷酸和5 u g/ml環孢菌素A ；
4)向步驟3)的完全培養基中添加皰疹病毒懸浮液；
5)在含5%二氧化碳的恒溫箱中，37°C下培養細胞4小時；
6)保溫后，將皰疹病毒感染后的細胞以3500-4000個細胞/ml重新分散在包含有18 u g/ml胰島素-反義c-myb-硫代磷酸寡脫氧核苷酸的完全培養基中，然后分散于包含受過輻射的巨噬細胞的細胞培養器中；
7)在含5%二氧化碳的恒溫箱中，37°C下培養細胞；
8)每周一次,從每格中取出100V- I培養基,再添加100 V- I包含5 V- g/ml胰島素-反義c-myb-硫代磷酸寡脫氧核苷酸的新鮮培養基；
9)在感染后2-4周，用ELISA收集細胞培養器中的抗體產品，然后用雜交瘤細胞融合法產生并克隆出源于慢性淋巴細胞白血病細胞的雜交瘤細胞株。具體地，所述步驟I)中的巨噬細胞為J774A. I細胞。 所述步驟I)中受過輻射的輻射劑量為4200rad。所述步驟9)中雜交瘤細胞融合法的具體步驟為在感染后2-4周后，對HIV-1、丙型肝炎病毒和流感病毒結合和中和活性篩選抗體，選擇呈陽性的細胞培養器中的細胞與雜交瘤細胞株融合，經有限稀釋后獲得雜交瘤細胞株。本發明的有益效果是本發明提供一種產生無限克隆的慢性淋巴細胞白血病細胞的方法，該方法可以獲得大量的慢性淋巴細胞白血病細胞作為研究標本，在研究用于治療或預防或抑制慢性淋巴細胞白血病藥物時用于藥物試驗或藥效試驗。并且，可以通過研究獲得的雜交瘤細胞株研究或者提純抗體，可以對于制備防治慢性淋巴細胞白血病細胞的藥物或者抗體或者生物片段作出進一步研究。
具體實施例方式下面結合具體實施方式
對本發明作進一步的詳細描述，但本發明的實施方式不僅限于下述實施例。本實施例適用于產生無限克隆的B慢性淋巴細胞白血病細胞的方法具體步驟為 I、在皰疹病毒感染的24h前，準備受過輻射(輻射劑量為4200rad)的巨噬細胞(本實施
例選用的巨噬細胞為J774A. I細胞)分散在細胞培養器中，培養器為圓底薄板，受過輻射的巨噬細胞并以50000細胞每格(IOOug/格)分散在96格薄板上。2、從慢性淋巴細胞白血病病人的血樣中分離出外周血液單核細胞，將外周血單個核細胞置于完全培養基中，取300g置于15ml錐形離心管中，以1500RPM離心3分鐘。3、將離心后的外周血單個核細胞重新分散于完全培養基中，形成的細胞濃度為2*106個細胞/ml，該完全培養基包含50 u g/ml的胰島素-反義c-myb-硫代磷酸寡脫氧核苷酸和5 u g/ml環孢菌素A。4、添加皰疹病毒懸浮液
5、在含5% 二氧化碳的恒溫箱中，37°C下培養細胞4小時。6、保溫后，將細胞以3500-4000個細胞/ml重新分散在包含有18 y g/ml的胰島素-反義c-myb-硫代磷酸寡脫氧核苷酸的完全培養基中；
7、以3500-4000個細胞/格(100 iil/格)分散在96格包含受輻射的J774A. I細胞的薄板上。8、在含5% 二氧化碳的恒溫箱中，37°C下培養細胞。9、每周一次，從每格中取出100 ill培養基，再添加IOOiU包含5 ii g/ml胰島素-反義c-myb-硫代磷酸寡脫氧核苷酸的新鮮培養基。
10、當EBV病毒感染的細胞生長到足夠多(培養3周后)，用ELISA收集細胞培養器中的抗體產品，對HIV-I、丙型肝炎病毒和流感病毒結合和中和活性篩選抗體，選擇呈陽性的細胞培養器中的細胞與雜交瘤細胞株融合，經有限稀釋后可產生并克隆出源于慢性淋巴細胞白血病細胞的能產生IgM的雜交瘤細胞株。上述方法中，J774A. I為小鼠巨噬細胞株。一般一個巨噬細胞株(例如嚙齒目動物的巨噬細胞株)用作飼養細胞，實驗證明，J774A. I巨噬細胞株產生適合雜交瘤細胞的生長和克隆的生長因子。由J774A. I細胞制備的條件培養基已經廣泛用于強化巨噬細胞的生存能力，也同樣顯示J774A. I細胞株作為飼養細胞與T細胞、EBV病毒感染的B細胞聯合培養有助于在體外清除凋亡的細胞。根據上述方法，巨噬細胞株受到輻射以阻止飼養細胞的過度生長，最佳的Y輻射量為4200 Rad，然后受到輻射的細胞分散在培養器中(例如，當用96孔板時，大約每孔可分散50000個細胞(大約100 1/孔))。使用現有技術手段，可以使B慢性淋巴細胞白血病細胞的EBV病毒感染生效。例 如，可以從慢性淋巴細胞白血病病人的血樣中分離出外周血液單核細胞，然后這些細胞在完全培養基中沖洗，然后懸浮在包含例如環抱霉素A的完全培養基中，加入環抱霉素A來抑制任何EBV病毒B細胞特異性細胞毒素T細胞反應，通過測定EBV病毒B細胞的刺激潛力，實驗發現，5 y g/ml為環孢霉素A較好的濃度范圍。根據上述方法，產自B慢性淋巴細胞白血病細胞的有治療作用的抗體(例如抗HIV抗體、抗丙型肝炎抗體和抗流感抗體)或可以配制為一個成分(例如一種藥品成分)。上述方法中，完全培養基的制備需要用到的物質為1) 15. 2%熱滅活胎牛血清(FCS)、2) 1% 非必需氨基酸(NEAA)、3) ImM 丙酮酸鈉、4) 15mM HEPES 緩沖液，pH 為 7.3、5)2mM L-谷氨酰胺(Glu)、6) 100 U/ml 青霉素 G (Pen)
7)IOOu 1/ml 鏈霉素(Strep)。具體制備方法為
I、解凍一瓶FCS (500ml/瓶，-200C )，為了熱滅活在56°C下保溫30分鐘。2、冷卻，加入 31ml Glu+ Pen/ Strep (100X，IOOml/瓶，_2(TC )。3、將FCS-抗生素混合物分裝在兩個試管中，每個試管50ml，在_20°C冷凍。4、加入 IOOmlFCS-抗生素混合物于一瓶 RPMI 1640 中(500ml/ 瓶，4°C)。5、向瓶中加入 6.2ml HEPES 緩沖液(100X，IOOml/瓶，4°C )。6、加入 6. 2ml 丙酮酸鈉(100X，100ml/瓶，4°C )。7、加入 6.2ml NEAA (100X，100ml/瓶，4°C )。8、用0. 22 ii m的濾紙過濾完全培養基。9、總 CM :618. 6ml。如上所述，便可較好的實現本發明。
權利要求
1.產生無限克隆的慢性淋巴細胞白血病細胞的方法，其特征在于包括下述步驟 1)準備受過輻射的巨噬細胞分散在細胞培養器中； 2)從慢性淋巴細胞白血病病人的血樣中分離出外周血液單核細胞，將分離的外周血單個核細胞置于完全培養基中沖洗，沖洗后置于離心管中以1500RPM離心3分鐘； 3)將離心后的外周血單個核細胞重新分散于完全培養基中形成2*106個外周血單個核細胞/ml的完全培養基，該完全培養基包含50 V- g/ml的胰島素-反義c_myb-硫代磷酸寡脫氧核苷酸和5 u g/ml環孢菌素A ； 4)向步驟3)的完全培養基中添加皰疹病毒懸浮液； 5)在含5%二氧化碳的恒溫箱中，37°C下培養細胞4小時； 6)保溫后，將皰疹病毒感染后的細胞以3500-4000個細胞/ml重新分散在包含有18 u g/ml胰島素-反義c-myb-硫代磷酸寡脫氧核苷酸的完全培養基中，然后分散于包含受過輻射的巨噬細胞的細胞培養器中； 7)在含5%二氧化碳的恒溫箱中，37°C下培養細胞； 8)每周一次,從每格中取出100V- I培養基,再添加100 V- I包含5 V- g/ml胰島素-反義c-myb-硫代磷酸寡脫氧核苷酸的新鮮培養基； 9 )在感染后2-4周，用ELISA收集細胞培養器中的抗體產品，然后用雜交瘤細胞融合法產生并克隆出源于慢性淋巴細胞白血病細胞的雜交瘤細胞株。
2.根據權利要求I所述的產生無限克隆的慢性淋巴細胞白血病細胞的方法，其特征在于所述步驟I)中的巨噬細胞為J774A. I細胞。
3.根據權利要求I所述的產生無限克隆的慢性淋巴細胞白血病細胞的方法，其特征在于所述步驟I)中受過輻射的輻射劑量為4200rad。
4.根據權利要求I所述的產生無限克隆的慢性淋巴細胞白血病細胞的方法，其特征在于所述步驟9)中雜交瘤細胞融合法的具體步驟為在感染后2-4周后，對HIV-1、丙型肝炎病毒和流感病毒結合和中和活性篩選抗體，選擇呈陽性的細胞培養器中的細胞與雜交瘤細胞株融合，經有限稀釋后獲得雜交瘤細胞株。
全文摘要
本發明公開了一種產生無限克隆的慢性淋巴細胞白血病細胞的方法。該方法包括下述步驟1)準備受過輻射的巨噬細胞分散在細胞培養器中；2)外周血單個核細胞置于完全培養基中，離心；3)重新分散于完全培養基中；4)添加皰疹病毒懸浮液；5)培養；6)保溫后，將細胞重新分散在完全培養基中，然后分散于包含受過輻射的巨噬細胞的細胞培養器中；7)培養細胞；8)每周一次，更換新鮮培養基；9)在感染后2-4周，然后用雜交瘤細胞融合法產生并克隆出源于慢性淋巴細胞白血病細胞的雜交瘤細胞株。本發明可以通過研究獲得的雜交瘤細胞株研究或者提純抗體對制備防治慢性淋巴細胞白血病細胞的藥物或者抗體或者生物片段作出進一步研究。
文檔編號C12N5/10GK102732485SQ201210207208
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月21日 優先權日2012年6月21日
發明者丁兆, 朱仲玉 申請人:四川匯宇制藥有限公司