專利名稱：：鼠傷寒沙門菌X3306lux及其在活體成像中的應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于微生物
技術領域：
，特別涉及鼠傷寒沙門菌X33061UX及其在活體成像中的應用。
背景技術：
：鼠傷寒沙門菌{Salmonella是一種重要的人畜共患病原菌，主要經水和食物傳播，可引起食物中毒、胃腸炎等腸道傳染病，其感染發病率居沙門菌感染的首位。X3306是攜帶毒力質粒pStSRIOO的鼠傷寒沙門菌強毒株，可作為標準毒株，應用于鼠傷寒沙門菌致病機制的研究。近年來，活體動物體內光學成像技術以其操作簡便及直觀性在生命科學研究中得以不斷發展。這種成像技術可以直接實時觀察標記的基因及細胞在活體動物體內的活動及反應。利用光學標記的細菌建立動物模型可以實時動態追蹤病原菌在動物活體內的感染過程，深入研究病原菌致病機制，進行藥物研究及篩選等。主要采用熒光(fluorescence)與生物發光(bioluminescence)兩種技術。熒光發光是通過激發光激發熒光基團到達高能量狀態后產生發射光。熒光技術操作簡便，信號較強，但應用于體內試驗時在受到激發光激發時生物體很多物質都會產生熒光，如皮膚、毛發和各種組織及食物等。特別是當被標記的靶點深藏于組織內部需要較高能量的激發光時也產生很強的非特異性熒光，且病原菌在動物體內有復雜的定位，熒光的激發光需要穿過組織到達靶點，發射光需要從體內出來，路徑較長。信號水平取決于激發光的強度、發光細胞的數量、靶點的深度、光線穿過的組織對其的吸收及散射等因素，使得熒光強度很難定量。生物發光是用熒光素酶(Iuciferase)基因標記。以熒光素酶作為體內報告源的生物發光是以酶和底物的特異作用而發光，特異性極強，因動物本身沒有任何自發光，使得生物發光具有極低的背景，極高的信噪比。生物發光成像相對于熒光成像，其最大的特點就是體內檢測的高靈敏度。因此，生物發光技術成為目前研究的熱點。細菌操縱子由熒光素酶基因和其底物合成酶基因組成，帶有這種操縱子的細菌會持續發光不需要外源性底物。近年來研究者們陸續將其克隆至多種載體導入病原菌中，應用生物發光技術和小動物成像系統監測病原菌感染過程。但以質粒為基礎的生物發光技術在無抗生素選擇下不穩定，不能用于體內的長期研究。對實驗小鼠注射抗生素來篩選攜帶完整發光質粒的沙門菌，會造成小鼠的耐藥性，且會在某種程度上干擾實驗結果。又因質粒的拷貝數不同，單細胞發光強度不穩定，無法以發光強度來定量檢測病原菌。2010年，KevinHowe構建質粒pBEN276,利用該質粒可將Zm操縱子克隆至細菌染色體(圖I),其生物發光信號可以用于精確定量，本發明由此在鼠傷寒沙門菌X3306基礎上構建了具有穩定生物發光性能的菌株X33061ux。
發明內容解決的技術問題本發明針對熒光標記的體內檢測特異性低，背景高，難定量等缺陷，及以往以基于質粒的生物發光檢測需外加篩選壓力和底物，且難以定量等不足，提供了一種可以穩定發光的鼠傷寒沙門菌X33061ux及其在活體成像中的應用。技術方案鼠傷寒沙門菌{Salmonellatyphimurium)X3306lux,該菌株已在國家知識產權局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2012年3月13日，保藏單位名稱中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCCNo.5895。鼠傷寒沙門菌typhimurium)X3306Iux在活體成像中的應用。鼠傷寒沙門菌(5^7^9/7(9773皿η·")X3306下文簡稱X3306;鼠傷寒沙門菌{Salmonellatyphimurium)X33O6Iux下文簡稱X33O6Iux0有益效果該鼠傷寒沙門菌具有穩定的生物發光性能，彌補了生物熒光的細菌檢測需激發光源且在體內特異性低，背景高，難定量等缺陷。經位點特異性重組，將管家基因E.coli/rr啟動子和操縱子插入宿主菌染色體中穩定表達(同時插入位點不破壞基因組基因功能，對細菌無不利影響)。操縱子在其上游連接的管家基因E.co7i/rr啟動子的調控下，組成性表達熒光素酶和底物，無需外加篩選壓力和底物維持細菌發光。并通過實驗檢測到細菌的數量與其發光強度成正比，且在小鼠活體內能持續檢測到細菌的生物發光。彌補了以往質粒標記的生物發光細菌需外加篩選壓力和底物，影響發光檢測，且單位細胞發光量不穩定等不足之處。熒光酶基因插入染色體中穩定表達，單位細胞的發光數量很穩定。加上生物發光技術極高的特異性和信噪比，即便標記細胞在動物體內有復雜的定位，亦可從動物體表的信號水平直接得出發光細胞的相對數量。可廣泛應用于體外細胞感染模型和體內實驗動物模型的建立。結合利用活體成像儀器可實時動態的持續監測鼠傷寒沙門菌在小鼠活體內的入侵、增殖及擴散情況。為鼠傷寒沙門菌及傷寒沙門菌致病機制的深入研究，藥物研究和篩選及相關疾病防治策略的研究等提供便利的工具。圖I為pBEN276質粒圖譜，tnsABCD為編碼Tn7轉座子的基因。操縱子luxCDABE編碼熒光素酶和底物，引入多克隆酶切位點Xhol和Notl，將其連接于Tn7轉座子側翼。Lux操縱子3’端連接Ε.coli管家基因frr的啟動子，啟動Zm操縱子的組成性表達。圖2為菌落生物發光檢測結果(I和2依次為X33061ux單菌落在whitelight和luminescence條件下成像，3和4依次為X3306單菌落在whitelight和luminescence條件下成像)。圖3為菌液生物發光檢測結果(1、2:whitelight模式成像X33061ux;3:whitelight模式成像X3306;4、5:luminescence模式成像X33061ux;6:luminescence模式成像X3306)。圖4為X33061ux發光性能穩定性檢測結果(光強與在無選擇壓力條件下傳代天數的關系)圖5為穩定發光菌在活體內信號檢測結果(1，2，3依次為將感染X33061UX的小鼠于whitelight模式成像，luminescence模式成像和merge圖像)。圖6為光子數與細菌數關系的發光檢測圖(I飛倍比稀釋X33061ux菌液；6X3306陰性對照)。圖7為光子數與細菌數關系圖(I5:10倍稀釋X33061ux菌液；6:X3306陰性對照)。具體實施例方式實施例I菌株具體構建及鑒定I、材料準備I.I質粒與菌株質粒PBEN276由法國自然資源研究所動物傳染病和公共健康病原菌研究實驗室PierreGermon教授惠贈。KevinHowe,AttilaKarsi,PierreGermon,et.al.DevelopmentofstablereportersystemcloningluxCDABEgenesintochromosomeofSalmonellaentericaserotypesusingTn7transposon[J].BMCMicrobiology2010,10:197鼠傷寒沙門菌typhimurium')X3306由美國亞利桑那州立大學生物科學學院ROYCURTISSIII教授惠贈。HIDEN0RIMATSUI,CHRISTOPHERM.BACOT,WENDYA.VirulencePlasmid-BornespvBandspvCGenesCanReplacethe90-KilobasePlasmidinConferringVirulencetoSalmonellaentericaSerovarTyphimuriuminSubcutaneouslyInoculatedMice[J].Journalofbacteriology,2001，15(183):4652-4658.1.2儀器與試劑儀器電轉儀(Bio-RadGenePulserIIsystem)為美國Bio-Rad產品；高速冷凍離心機Beckaman公司產品；柯達多模式小動物活體成像系統DXS4000pro；試劑質粒提取試劑盒QIAGENPlasmidMaxKit購自Qiagen公司。2方法2.1目的菌株的轉化2.I.I感受態細胞制備平板劃線法接種鼠傷寒沙門菌X3306至LB固體培養基，37°C倒置培養過夜。挑取個體圓潤有光澤的單菌落接種到3mLLB液體培養基，37°C，200r/min培養過夜。將培養物以1:100的比例接種到IOOmL生長培養基中，37°C，250r/min培養至0D600為0.3時取出培養物，立即冰浴30min。4°C,4000r/min離心lOmin，收集菌體。用4°C預冷的超純水洗三遍，以50μL預冷的超純水重懸，冰上放置待用。2.I.2電轉化方案將質粒PBEN276加入到50μL感受態細胞中，混合均勻后轉入預冷的Imm電極杯。再調節電壓、電阻及電容參數為2.5kV，400Ω，50μF，電擊后迅速加入30°C預熱的SOC培養基lmL。將電擊后的菌液轉移至試管，37°C，100r/min培養f3h。取100μL涂布于含40μg/mL氨芐青霉素的LB平板上，37°C培養過夜。2.2轉化子鑒定陽性克隆從含50μg/mLAmp的LB瓊脂平板上挑出接種至2mL含50μg/mLAmp液體LB培養基30°C，200rpm培養1416h，將菌液轉移至24孔板檢測生物發光。同時提取質粒進行酶切鑒定和PCR鑒定，并接種于SS固體培養基進行鼠傷寒沙門菌生化鑒定。2.3誘導轉座子重組將上述經鑒定的轉化子接種至含O.l%wt阿拉伯糖的LB液體培養基30°C，200rpm培養1416h。誘導后的菌液于無抗生素LB固體培養基平板上劃線，42°C培養1416h。各挑選6個單克隆接種于液體LB培養基42°C，200rpm培養1416h，菌液轉移至24孔板檢測生物發光。2.4篩選穩定表達Lux操縱子的克隆挑選出重組后能發光的菌液于含50μg/mLAmp固體LB培養基上劃線，同時在無抗生素培養基中繼續傳代37°C培養，定量檢測細菌發光情況。篩選出無抗生素抗性且多次傳代能穩定發光的菌落。菌株的培養增殖方法鼠傷寒沙門菌X3306Iux為兼性厭氧菌，在普通LB培養基中可生長，培養基成分蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，溶于IL水，pH=7±0.2，培養溫度37°C條件下可穩定增殖。菌種形態與生化特性檢測液體LB培養基37°C培養過夜細菌均勻渾濁。取一環菌液適當稀釋后革蘭染色鏡檢，該菌為革蘭陰性桿菌。用固體LB培養基37°C培養18h，形成乳白色菌落，表面光滑，邊緣整齊，直徑f3mm。SS培養基37V培養1824h上菌落形態為中等大小、圓形、光滑、乳白色、菌落中心黑色，硫化氫陽性。挑取單菌落接種于生化管37°C培養過夜，檢測生化特性，該菌不發酵乳糖和蔗糖，能發酵葡萄糖、甘露醇、麥芽糖。挑取單菌落接種于半固體瓊脂，37°C培養18^24h，細菌呈羽毛狀生長，動力陽性。單菌落生物發光檢測分區劃線法將鼠傷寒沙門菌X33061ux接種于LB平板，37°C，培養1416h。待長出單菌落后，將平板置于多模式活體成像儀中進行生物發光檢測。在生物發光檢測模式下，可見發光菌單菌落(鼠傷寒沙門菌X33061ux)，而普通細菌單菌落(鼠傷寒沙門菌X3306)不可見(圖2)。菌液生物發光檢測單菌落接種至液體LB培養基37°C，200rpm培養1416h，菌液轉移至24孔板檢測生物發光。生物發光模式下只可見發光菌(鼠傷寒沙門菌X33061ux)，普通細菌(鼠傷寒沙門菌X3306)不可見(圖3)。生物發光穩定性檢測將X33061uX單菌落接種至無抗生素液體LB培養基，每天傳代培養至12天，每3天收集菌液，以OD6tltl為標準稀釋至相同體積相同濃度，在活體成像儀中進行生物發光檢測，記錄發光強度。X33061ux具有穩定的生物發光性能(如圖4)。實施例2鼠傷寒沙門菌iSalmorwllaX33061ux活體成像1.細菌培養從固體LB瓊脂平板上挑選單克隆接種至LB液體培養基中，37°C，200rpm培養1416h至對數生長期。4000rpm，4°C，10min離心收集菌體，經生理鹽水洗兩遍(4000rpm，4°C，lOmin)后，用適量生理鹽水重懸，測0D600計算細菌濃度。用生理鹽水梯度稀釋待用。2.小鼠感染方法(腹腔注射或口飼感染)2.I腹腔注射感染選取8-12周BALB/C或C57BL小鼠，以50μL濃度105CFU/mL的菌液腹腔注射感染小鼠。2.2.口飼感染8-12周BALB/C或C57BL小鼠禁食禁水6h后，以50μL10%wt的NaHCO3灌胃，中和胃酸，以體積O.2mL濃度107CFU/mL的菌液灌胃感染小鼠，半小時后恢復喂食。3.活體成像方法以10%wt水合氯醛O.ImL經腹腔注射麻醉小鼠，待麻醉生效(約30min)后利用小動物成像儀成像。首先在白光(whitelight)條件下成像，只可見小鼠。然后在生物發光(luminescence)條件下成像,只可見發光菌。將兩次成像結果歸并(merge),可見發光菌感染后播散到的部位(圖5)。經光子量分析可計算發光菌在體內的增殖情況(圖6，7)。權利要求1.鼠傷寒沙門菌{Salmonellatyphimurium)X33061ux，該菌株已在國家知識產權局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2012年3月13日，保藏單位名稱中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCCNo.5895。2.鼠傷寒沙門菌typhimurium)X33061ux在活體成像中的應用。全文摘要鼠傷寒沙門菌X3306lux及其在活體成像中的應用，該菌株已在國家知識產權局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2012年3月13日，保藏單位名稱中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCCNo.5895。鼠傷寒沙門菌X3306是攜帶毒力質粒pStSR100的強毒株，可作為標準毒株，應用于鼠傷寒沙門菌致病機制的研究。X3306lux是在X3306基礎上構建的具有穩定生物發光性能的菌株。經位點特異性重組，將管家基因E.colifrr啟動子和Lux操縱子插入X3306染色體中穩定表達(同時插入位點不破壞基因組基因功能，對細菌無不利影響)。Lux操縱子在其上游連接的管家基因E.colifrr啟動子的調控下，組成性表達熒光素酶和底物，無需外加篩選壓力和底物維持細菌發光。文檔編號C12N1/20GK102757911SQ20121020624公開日2012年10月31日申請日期2012年6月21日優先權日2012年6月21日發明者儲元元,葉穎,李嫄淵,黃瑞申請人:蘇州大學