專利名稱：奶牛白細胞黏附缺陷癥焦磷酸測序檢測方法
技術領域：
本發明涉及奶牛白細胞黏附缺陷癥(BLAD)的檢測方法，特別涉及一種奶牛白細胞黏附缺陷癥焦磷酸測序(Pyrosequcing)檢測方法。
背景技術：
奶牛白細胞黏附缺陷癥(bovineleukocyte adhesion deficiency,BLAD)是一種發生于發生于荷斯坦(Holstein)奶牛的隱性遺傳性免疫缺陷疾病，由常染色體上⑶18基因單堿基突變(A —G)引起，病因為CD18基因表達缺陷，隱性基因純合時引起臨床發病，主要以嚴重的重復性感染，膿液形成減少，傷口愈合遲緩和白細胞增多為特征。近30年來，我國從美國、加拿大及澳大利亞等進口大量的活牛，其中大部分為荷斯坦牛，由于BLAD有害基因多以雜合的狀態存在，攜帶者并不發病，加之對此病沒有足夠的認識和重視，不可避免地引入大量潛在的BLAD攜帶者，而攜帶者表現正常，很難發現，一旦被發現時，其已經在畜群中進行了長時期的傳播，給我國養牛業和乳制品行業的發展帶來了重大的經濟損失。BLAD遺傳缺陷的發現已引起了各國奶牛育種協會和育種工作者的重視，美國、日本、丹麥、荷蘭等國已相應建立了種公牛遺傳缺陷基因的分子檢測方法和育種計劃，將BLAD造成的損失降低。我國擁有700萬頭以上的荷斯坦奶牛，由于缺乏簡便有效的BLAD隱性有害基因的檢測方法，無法開展常規檢測和大規模的普查統計，因此對我國牛群中BLAD的發病和攜帶情況尚不十分清楚，也就更談不上從牛群中凈化BLAD。在對BLAD CD18基因的分析中，現有方法主要有PCR-SSCP，PCR-RELP和RT-PCR等。PCR-RFLP即聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性(polymerasechain reaction-restriction fragment length polymorphism),因為 DNA 的多態性，不同的等位基因使DNA的限制性內切酶位點及數目發生改變，用限制酶切割基因組時，有些位點能切開，有些不能，使酶切后產生的片段數目和每個片段的長度不同，用瓊脂糖凝膠電泳判斷酶切位點是否有效，從而區別不同基因位點。王洪梅等(王洪梅，李建斌，許尚忠等。中國荷斯坦牛白細胞黏附缺陷癥檢測方法的研究進展[J].生物技術通報。2007，3:155-158)對濟南市11個奶牛場356頭奶牛及53頭Holstein種公牛進行了 BLAD的PCR-RFLP 檢測(Kehrli MEJr, Schmalstieg FC, Anderson DC, Van der Maaten MJ, HughesBJ,AckermannMR, Wilhelmsen CL,Brown GB,Stevens MG, Whetstone CA.Moleculardefinition ofthe bovine granulocytopathy syndrome: identification of deficiencyof theMac-l(CDllb/CD18)glycoprotein[J]. Am J Vet Res, 1990，51(11):1826-1836.)，TaqI酶切后，根據RFLP圖譜分為2個基因型，正常基因純合子切成2條片段，雜合子切成3條片段。共檢出3頭母牛攜帶者，占母牛群的0.84%，在Holstein種公牛中沒有發現隱性突變基因的攜帶者。Mukho等(Mukhopadhyaya P N, MehtaHH, Rathod R N. A method for the simulation of normal, carrier and affectedcontrolsfor PCR-RFLP screening of a genetic disease in dairy cattle[J]. MolCellProbes, 2000, 14(6) :381-384.)用PCR-RFLP法對CD18基因進行檢測，檢出結果與上述一致。應用PCR-RFLP技術，優點是價格便宜，技術簡便，適用于少量樣品的已知SNP(SingleNucleotide Polymorphisms,單核苷酸多態性)判斷。缺點是費時費力，試驗速度慢，靈敏性差，僅能檢測有酶切位點的片段。PCR-SSCP即聚合酶鏈式反應-單鏈構象多態性(polymerase chainreaction-single stranded conformation polymorphism)，是一種基于單鏈DNA構象差別的檢測方法。將DNA片段進行PCR擴增后，在變性劑或低離子濃度的作用下，使之成為單鏈DNA分子，單個堿基的改變使空間構象也發生改變，通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，將構象上有差異的分子區分開。李艷華等(李艷華，張勝利等。利用單鏈構象多態性檢測牛白細胞黏附缺陷癥方法的建立[J].中國獸醫學報，2007，29 (12) :1471-1474)對125頭荷斯坦種公牛的血液樣品進行了 SSCP分析，結果發現了 H1、H2、H3及H4四種單倍型，單倍型H1、H2、H3的個體是正常牛，H4是BLAD攜帶，即有害基因攜帶者(李艷華，韓廣文，張勝利等。牛白細胞黏附缺陷癥(BLAD)的檢測與單倍型分析[J].畜牧獸醫學報，2008，39 (9) : 1285-1288)，在125份牛血液樣品中，單倍型為H4的檢出I份，檢測出攜帶率是0.8%。并進行測序驗證， 測序結果表明，SSCP基因分型結果正確，且準確率達99%以上。PCR-SSCP可以檢測所有的點突變，在具體操作時要得到清晰一致的結果，需要對各種條件進行控制。馬金柱等(馬金柱，宋佰芬等。黑龍江省某牛場種公牛牛白細胞粘附缺陷病(BLAD)的調查[J].黑龍江八一農墾大學學報，2011，23(5) :35-37)用RT-PCR方法檢測了 106頭荷斯坦奶牛，結果發現I頭BLAD攜帶者，其余為健康牛。擴增的基因片段為575bp，用限制性內切酶酶切后，根據電泳酶切片段來進行診斷。BLAD病牛產生199、376bp 2個片段，健康牛產生106、199和270bp 3個片段，BLAD攜帶牛產生106、199、270和376bp 4個片段。Tajima等用此法也進行了檢測，健康牛產生3個片段，BLAD牛產生2個片段，而BLAD攜帶牛出現4個片段。Tajima等用另外I對引物擴增了大約600bp的片段，使用TaqI處理后健康牛產生100、200、300bp3個片段，BLAD牛產生200、400bp2個片段，而BLAD攜帶牛則出現 100、200、300、400bp 4個片段。Tammen等(Tammenl, Klippert H，KuczkaA,Treviranus A,Pohlenz J, Stober M, Simon D, Harlizius B. Animproved DNA testfor bovine leukocyte adhesion deficiency[J]. Res VetSci,1996，60(3):218-221)和Kriegesmann等也都分別對該試驗進行了改進，使擴增片段延長，酶切后也易于區分各個電泳帶。鐘誠等采用Northern印跡分析法對BLAD⑶18基因進行檢測，結果表明，正常牛的轉錄與患病牛犢的的轉錄，無論在印跡斑點大小和水平上，都無顯著差異。CN 102002527A公開了一種用于檢測牛CD18基因D128G突變的引物和特異性的Taqman MGB探針，利用這些引物和探針，采用實時熒光定量PCR技術，能夠快速靈敏地檢測待測牛CD18基因D128G突變位點基因型，從而準確篩查BLAD遺傳缺陷攜帶者。CN 100419088C公開了一種篩選⑶18基因正常的優良種牛的方法及其專用引物。其引物是由序列表中序列I和序列2的核苷酸序列組成的引物對。該方法是以待測牛的基因組DNA為模板，在由序列表中序列I和序列2的核苷酸序列所組成的引物對的引導下進行PCR擴增，檢測擴增片段自5’端第32位堿基為A、G還是N，擴增片段自5’端第32位堿基為A的種牛為⑶18基因正常的優良種牛；所述N為A和G的雜合體。
CN 10189951IA公開了一種應用AS-PCR檢測牛白細胞黏附缺陷的方法，其通過制備一種用于牛黏附缺陷檢測方法的特異性PCR引物，所述引物包括CD18基因擴增引物突變型擴增引物長度為500bp ;引物I :5’ AAGATGACGAGGAGCAGAA 3’，引物2 :5’ GTCCATCAGGTAGTACAGGC 3’ ；野生型擴增產物長度為818bp ;引物3 :5 ’ CAAGGGCTACCCCATCGA 3 ’，引物 4 :5 ’ CAGGACTGCGTGGCTAAA 3 ’。該引物可直接應用于在體外開展牛黏附缺陷的致病基因的篩選。上述提到的現有檢測BLAD的方法，有的檢測成本高，檢測時間長，有的操作繁瑣，檢測通量低，均不適合常規檢測和規模化檢測，難以在實際工作中應用。我國急需建立起快速、敏感、穩定、可靠的BLAD檢測方法，開展積極的BLAD致病基因篩查，從而阻斷BLAD致病基因的下傳。焦憐酸測序法(pyrosequencing)是由Ronagi (Ronagi M, UhlenM,Nylen P. Asequencing method based on real time pyrophosphate [J].Science, 1998，281 (5375) :363-365.)等建立的一種新的DNA序列分析方法，適用于對已知短序列的測序分析，其可重復性和精確性能與Sanger DNA測序法相媲美，而速度卻大大的 提高。該技術無需凝膠電泳，無需對DNA樣品進行任何特殊形式的標記和染色，因其快速、特異和敏感等優點被廣泛應用于多個領域，具有大通量、低成本、快速、直觀的特點。但是目前未見有關于用焦磷酸測序法檢測BLAD的報道，本發明擬在焦磷酸測序法的基礎上建立起方便且特異的BLAD檢測方法。
發明內容
本發明目的在于，提供奶牛白細胞黏附缺陷癥焦磷酸測序(Pyrosequcing)檢測方法，其具有方便、快速、敏感、穩定、特異、可靠的特點，適合BLAD CD18基因的常規檢測和規模化檢測，結果準確可靠，不僅能為BLAD檢測試劑盒的研發奠定基礎，而且可以掌握BLADCD18基因攜帶和發病情況，排除隱性有害基因的攜帶者，避免和降低優秀種公牛傳播擴散有害基因的風險，為防止和阻斷BLAD致病基因的下傳等作出貢獻。焦磷酸測序法是在同一反應體系中，DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶催化的酶級聯化學發光反應。反應底物為5’ -磷酰硫酸(APS)、熒光素(luciferin)，反應體系還包括待測序DNA單鏈和測序引物。它通過核苷酸和模板結合后釋放的焦磷酸引發酶級聯反應，促使熒光素發光并進行檢測。具體原理是在每一次測序反應中，加入一種核苷酸，若該核苷酸能與模板DNA配對，在聚合酶的作用下，摻入到引物鏈中，同時核苷酸中的焦磷酸基團(PPi)被釋放。ATP熒光素酶在APS存在的情況下催化PPi形成ATP，ATP驅動熒光素酶介導的熒光素向氧化熒光素的轉化，發出的可見光信號與ATP量成正比，峰值由pyrogram 反應，高度與反應中摻入的dNTP數目成正比。根據加入dNTP類型和熒光信號強度就可實時記錄模板DNA的核苷酸序列。焦磷酸測序法的反應過程主要包括以下步驟①特異性的測序引物與單鏈DNA模板相結合，然后加入酶混合物(DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶)和底物混合物(APS和熒光素)。②加入一種dNTP到①的反應體系中，如果其能與DNA模板的下一個堿基配對，則通過DNA聚合酶的作用，加在測序引物的3’末端，焦磷酸(PPi)被釋放，所釋放出來的PPi的量與和模板結合的dNTP的量成正比。③光信號由CCD攝像機檢測，并由pyrogram 反應為峰。每個光信號的峰高與反應中摻入的dNTP數目成正比。ATP熒光素酶在APS存在的情況下催化PPi形成ATP，ATP驅動熒光素酶介導的熒光素向氧化熒光素的轉化，同時產生光信號。④在Apyrase的作用·下，ATP和未摻入的dNTP發生降解，淬滅光信號并再生反應體系。⑤加入下一種核苷酸。基于上述焦磷酸測序法的原理以及本發明所要達到的目的，本發明采用如下技術方案奶牛白細胞黏附缺陷癥焦磷酸測序檢測方法，具體步驟如下(I)根據Genbank已發表的BLAD⑶18序列，設計針對SNP (單核苷酸多態性)位點的特異性PCR引物和測序引物上游引物CD18F1:5 ‘-GITGCGITCAATGTGACCTTC-3’，下游引物CD 18R2 :5 ‘-GGTCATCCACCATGGAGTAGG-3’，下游引物R2的5 ’端用生物素標記。引物所限定的目的片段大小為90bp。退火溫度62 °C。測序引物S2:5 ‘-TCCGGAGGGCCAAGG-3’。上述引物序列通過反復的預實驗確定，由此序列擴增出的PCR產物濃度較高(5uL PCR產物電泳檢測約有40-100ng)，不會出現較低濃度時擴增特異性差所導致的測序圖中出現干擾雜峰，最終不能分析出相應的基因型的問題。引物均由上海英駿生物技術有限公司合成。退火溫度在62°C時，所得到的PCR產物在電泳時可以得到單一信號較強的條帶，即在此退火溫度下沒有引物二聚體產生，還能保證得到目的產物的量最高，足夠用于測序反應。(2)初步建立奶牛白細胞黏附缺陷癥焦磷酸測序檢測方法I)取BLAD⑶18基因標準野生型質粒(以下簡稱A/A型質粒)、BLAD⑶18基因標準突變型質粒(以下簡稱G/G型質粒)、BLAD CD18野生型和突變型雙基因型雜合子質粒(以下簡稱A/G型質粒)各I y L分別作為模板，并用無菌水代替質粒DNA模板作為陰性對照，以步驟(I)設計的特異性PCR引物為引物，分別配置50ii L的PCR Mix反應體系。具體的PCR Mix 反應體系為25u L 2XPCR TaqMix、I y L上游引物CD18F1、I y L下游引物CD18R2、21^牛血液基因組0嫩、211^ ddH20。反應液配好后瞬時離心。PCR反應程序為95°C預變性 5min，95°C變性 15s、62°C退火 30s、72°C延伸 30s，45-50 個循環，72°C 5min。 優選地，所述上游引物和下游引物的量在50 ii L的PCR反應體系中為5-1Opmo I，在此范圍內可保證PCR反應充分進行且反應結束后體系中沒有生物素標記的游離引物，進而保證了后續的單鏈純化效率。優選地，所述PCR反應程序為50個循環。2) PCR反應結束后，產物經2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，經與標準DNAMarker條帶比較，發現除陰性對照外，以三種CD18標準質粒為模板的PCR產物均為90bp大小的DNA片段，與引物所限定的目的片段大小一致，進行后續實驗。3)按照標準操作分別對以三種CD18標準質粒為模板的PCR產物進行單鏈的分離純化和焦磷酸測序①從冰箱取出反應所需溶液，保證實驗操作前所有溶液都達到室溫；混勻Sepharose beads,混勻后立即將需要使用的sephare beads總量轉移到一個Eppendorf'管中備用，sephare beads總量以每個樣品3 ii L計算。②取3 ii L sepharose beads與47 ii L結合緩沖液混勻，得到50 ii L的混合物I。③將混合物I迅速加入到步驟(3)的PCR擴增產物(50 ii L反應體積)中，得到混合物II。④常溫下，將混合物II于PCR板中振蕩混勻10-15min，振蕩速率1300_1400rpm，以使sepharose beads與下游引物R25’端的生物素充分結合。⑤在PSQ板中預先加入45 ii L含有0. 3 ii M測序引物的退火緩沖液。 ⑥在真空準備工作臺中，分別加入180ml高純水、180ml 70%乙醇、180ml洗滌緩沖液和120ml變性緩沖液于四個樣品板中；打開真空準備工作臺的泵，將真空準備器于高純水中清洗至少30s。⑦將真空準備器移到步驟④中已經完成振蕩混勻的PCR板中，抓取結合有sepharose beads的PCR產物，先后在70%乙醇、變性緩沖液和洗滌緩沖液中洗5_10s ;將真空準備器放到含有測序引物的板上方，對準反應孔后再停掉面板上的抽真空開關，再將真空準備器放入PSQ Low反應板并搖動,釋放結合sepharosebeads的單鏈PCR產物。⑧單鏈PCR產物80°C放置2min，再取出冷卻到室溫。⑨應用Pyromark Q96焦磷酸測序儀和SNP試劑盒,依次在試劑倉中加入酶混合物(DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶)，底物混合物(底物APS和熒光素)和4種dNTPs (dATP、dTTP、dCTP、dGTP)，進行測序反應，經SNP軟件分析得到測序圖。優選地，所述Pyromark Q96焦磷酸測序儀在18_28°C的條件下運行。測序結果如圖I所示，圖中橫軸代表堿基，縱軸代表信號值。三種標準質粒的基因型分別為A/A，G/G和A/G。測序圖中，下邊所標字母第一個是E，沒有峰；第二個是S，有一個高度不等小峰；第三個是T，是程序特地設置的一個陰性對照峰，沒有峰；后面的G，C，T，A就是后面的序列，峰聞近似相等，表不序列為GCTA,和GenBank收錄的序列相同，說明測序是準確的。由圖中可以看出，焦磷酸測序結果信噪比高，能清晰顯示出所檢測片段的DNA序列，按照基因片段的序列，可迅速識別出基因型。由此建立起了 BLAD焦磷酸檢測方法。(3)奶牛血液樣品的提取及檢測I)將300份荷斯坦奶牛血液樣品用試劑盒方法分別提取DNA，具體方法如下①吸取300 U L新鮮血液，加入3倍體積紅細胞裂解液，顛倒混勻，放置5min，放置期間顛倒混勻幾次，10000r/min離心lmin，吸去上清，留下白細胞沉淀，加200 u L緩沖液GA，振蕩至徹底混勻；②加入20 ii L蛋白酶K溶液，混勻；③加入200111緩沖液68，劇烈顛倒混勻，701放置lOmin，溶液變清亮，簡短離心；④加入200 L無水乙醇，充分振蕩混勻15s，此時可能會出現絮狀沉淀，簡短離心；⑤將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000r/min離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；⑥向吸附柱CB3中加入500ii L緩沖液⑶，12000r/min離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；⑦向吸附柱CB3中加入700ii L漂洗液PW，12000r/min離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；⑧向吸附柱CB3中加入500 u L漂洗液PW，12000r/min離心30s，倒掉廢液；⑨將吸附柱CB3放回收集管中，12000r/min離心2min，倒掉廢液，將吸附柱CB3置于室溫放置數分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；⑩將吸附柱CB3轉入干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加IOOy L洗脫 液TE，室溫放置5min，12000r/min離心2min，將溶液收集到離心管中，管中為提取的牛血液基因組DNA，置于-20°C保存。2)將提取的300份奶牛血液樣品用步驟(2)建立起來的焦磷酸測序法進行檢測①以步驟(I)設計的特異性PCR引物為引物，配置50iiL的PCR Mix反應體系25 u L 2 XPCR TaqMixUu L上游引物CD18F1、1 y L下游引物CD18R2、2 y L牛血液基因組DNA、21iiL ddH20。反應液配好后瞬時離心。PCR反應程序為95°C預變性5min，95°C變性15s、62°C退火 30s、72°C延伸 30s，45-50 個循環，72°C 5min。②PCR反應結束后，產物經2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，以DL2000DNAMarker為標準，結果如圖2所示，圖中從左向右依次為Marker、陰性對照和目的產物。從圖中可以看出，擴增出的CD18序列的PCR產物大小近似90bp，與引物所限定的目的片段大小一致，并且電
泳條帶單一又具備一定的濃度。③用與步驟(2)3)相同的方法對300份荷斯坦奶牛血液DNA樣本分別進行單鏈的分離純化和焦磷酸測序，結果發現有A/A和A/G兩種基因型，分別對應正常個體和BLAD攜帶者。結果如圖2和圖3所示，圖中下邊所標字母第一個是E，代表酶，沒有峰；第二個是S，代表底物，有一個高度不等小峰；第三個是T，是程序特地設置的一個陰性對照峰，沒有峰；后面的G, C, T, A就是后面的序列，峰聞近似相等，表不序列為GCTAjP GenBank收錄的序列相同，說明測序是準確的。由圖中可以看出，焦磷酸測序結果信噪比高，能清晰顯示出所檢測片段的DNA序列，按照基因片段的序列，可迅速識別CD18基因型。本發明通過焦磷酸測序技術，檢測了 300頭荷斯坦奶牛BLAD⑶18基因的突變情況，統計結果顯示，基因型A/A的樣品294個，基因型A/G的樣品6個，正常個體及攜帶者的比例分別為98%和2%。為了驗證本發明方法的可靠性，進行了 300個樣本的重復性試驗3次，以觀察批量檢測BLAD的可靠性。結果表明，在3次重復試驗中，突變檢出率和重復率均為100%。從步驟(3)I)提取的300份荷斯坦奶牛血液樣品DNA中取出6例A/G基因型的樣品和隨機挑選的24例A/A基因型的樣品，共30例樣品委托北京諾賽公司進行普通基因測序分析，結果如下表I所示表I
權利要求
1.用于奶牛白細胞黏附缺陷癥焦磷酸測序檢測方法的引物，其特征在于，包括針對SNP位點的特異性PCR引物和測序引物，所述特異性PCR引物的序列為 上游引物 CD18F1 5 ‘-GTTGCGTTCAATGTGACCTTC-3’， 下游引物 CD18R2 5 ‘-GGTCATCCACCATGGAGTAGG-3’，且 5’ 端用生物素標記，測序引物 S2 :5 ‘ -TCCGGAGGGCCAAGG-3，。
2.奶牛白細胞黏附缺陷癥焦磷酸測序檢測方法，其特征在于，利用根據權利要求I所述的引物。
3.根據權利要求2所述的奶牛白細胞黏附缺陷癥焦磷酸測序檢測方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)用試劑盒方法提取奶牛血液樣本基因組DNA； (2)以步驟(I)獲得的基因組DNA為模板，以權利要求I所述的特異性PCR引物為引物，配置PCR Mix反應體系； (3)按照標準操作對步驟(2)獲得的PCR產物進行單鏈的分離純化和焦磷酸測序。
4.根據權利要求2或3所述的奶牛白細胞黏附缺陷癥焦磷酸測序檢測方法，其特征在于，所述步驟(I)的具體步驟為 ①吸取300μ L新鮮血液，加入3倍體積紅細胞裂解液，顛倒混勻，放置5min，放置期間顛倒混勻幾次，10000r/min離心Imin,吸去上清，留下白細胞沉淀，加200 μ L緩沖液GA,振蕩至徹底混勻； ②加入20μ L蛋白酶K溶液，混勻； ③加入200μ L緩沖液GB，劇烈顛倒混勻，70°C放置lOmin，溶液變清亮，簡短離心； ④加入200μ L無水乙醇，充分振蕩混勻15s，此時可能會出現絮狀沉淀，簡短離心； ⑤將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000r/min離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中； ⑥向吸附柱CB3中加入500μ L緩沖液⑶，12000r/min離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中； ⑦向吸附柱CB3中加入700μ L漂洗液PW，12000r/min離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中； ⑧向吸附柱CB3中加入500μ L漂洗液PW，12000r/min離心30s，倒掉廢液； ⑨將吸附柱CB3放回收集管中，12000r/min離心2min，倒掉廢液，將吸附柱CB3置于室溫放置數分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液； ⑩將吸附柱CB3轉入干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100μ L洗脫液TE，室溫放置5min，12000r/min離心2min，將溶液收集到離心管中，管中為提取的牛血液基因組DNA，置于-20°C保存。
5.根據權利要求2-4之一所述的奶牛白細胞黏附缺陷癥焦磷酸測序檢測方法，其特征在于，步驟(2)所述的PCR Mix反應體系為25yL 2XPCR TaqMix、I μ L上游引物CD18F1、Iμ L下游引物CD18R2、2 μ L牛血液基因組DNA、21 μ LddH20 ；PCR反應程序為95°C預變性5min，95°C變性 15s、62°C退火 30s、72°C延伸 30s，45-50 個循環，72°C 5min。
6.根據權利要求2-5之一所述的奶牛白細胞黏附缺陷癥焦磷酸測序檢測方法，其特征在于，所述PCR反應程序為50個循環。
7.根據權利要求2-6之一所述的奶牛白細胞黏附缺陷癥焦磷酸測序檢測方法，其特征在于，所述上游引物和下游引物的量在50μ L的PCR反應體系中為5-1OpmoI。
8.根據權利要求2-7之一所述的奶牛白細胞黏附缺陷癥焦磷酸測序檢測方法，其特征在于，所述步驟(3)的具體步驟為 ①從冰箱取出反應所需溶液，保證實驗操作前所有溶液都達到室溫；混勻Sepharosebeads,混勻后立即將需要使用的sephare beads總量轉移到一個Eppendorf管中備用，sephare beads總量以每個樣品3 μ L計算；②取3μ L sepharose beads與47 μ L結合緩沖液混勻,得到50 μ L的混合物I ; ③將混合物I迅速加入到步驟(3)的PCR擴增產物(50μ L反應體積)中，得到混合物II； ④常溫下，將混合物II于PCR板中振蕩混勻10-15min，振蕩速率1300_1400rpm，以使sepharose beads與下游引物R25’端的生物素充分結合； ⑤在PSQ板中預先加入45μ L含有O. 3 μ M測序引物的退火緩沖液； ⑥在真空準備工作臺中，分別加入180ml高純水、180ml70%乙醇、180ml洗滌緩沖液和120ml變性緩沖液于四個樣品板中；打開真空準備工作臺的泵，將真空準備器于高純水中清洗至少30s ； ⑦將真空準備器移到步驟④中已經完成振蕩混勻的PCR板中，抓取結合有sepharosebeads的PCR產物，先后在70%乙醇、變性緩沖液和洗滌緩沖液中洗5_10s ;將真空準備器放到含有測序引物的板上方，對準反應孔后再停掉面板上的抽真空開關，再將真空準備器放入PSQ Low反應板并搖動,釋放結合sepharose beads的單鏈PCR產物； ⑧單鏈PCR產物80°C放置2min，再取出冷卻到室溫； ⑨應用PyromarkQ96焦磷酸測序儀和SNP試劑盒，依次在試劑倉中加入酶混合物(DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶)，底物混合物(底物APS和熒光素)和4種dNTPs (dATP、dTTP、dCTP、dGTP)，進行測序反應，經SNP軟件分析得到測序圖。
9.根據權利要求8所述的奶牛白細胞黏附缺陷癥焦磷酸測序檢測方法，其特征在于，所述步驟⑨所述的Pyromark Q96焦磷酸測序儀在18_28°C的條件下運行。
全文摘要
本發明涉及奶牛白細胞黏附缺陷癥(BLAD)的檢測方法，特別涉及一種奶牛白細胞黏附缺陷癥焦磷酸測序(Pyrosequcing)檢測方法。主要是根據Genbank已發表的BLAD CD18序列，設計針對SNP位點的特異性PCR引物和測序引物，上游引物CD18F15‘-GTTGCGTTCAATGTGACCTTC-3’，下游引物CD18R25‘-GGTCATCCACCATGGAGTAGG-3’且5’端用生物素標記，測序引物S25‘-TCCGGAGGGCCAAGG-3’。本發明提供的奶牛白細胞黏附缺陷癥焦磷酸測序檢測方法具有方便、快速、敏感、穩定、特異、可靠的特點，適合BLAD CD18基因的常規檢測和規模化檢測。
文檔編號C12N15/11GK102732625SQ20121020605
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月18日 優先權日2012年6月18日
發明者周莉, 廖娟紅, 林祥梅, 賈廣樂 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院