專利名稱：一種新型非核糖體肽合成酶基因及其腺苷酰化結構域的克隆和表達的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種新型非核糖體肽合成酶基因及其包含的五個腺苷酰化結構域基因，尤其是一種來自南海深海沉積物微生物的新型非核糖體肽合成酶基因及其包含的五個腺苷酰化結構域基因。
背景技術：
非核糖體肽類是一大類由細菌或真菌的非核糖體肽合成酶合成的，具有生物活性的天然產物，并且在生物體內具有較好的抗酶解和抗化學降解特性。它的結構非常復雜，種類繁多。應用于臨床上的非核糖體肽類非常多，常見的有抗生素(達托霉素)、抗腫瘤(博來霉素)、抗真菌藥物或免疫抑制劑(環孢霉素)等。隨著細菌耐藥性的頻頻出現，抗生素類藥物的儲備越來越不足，人類對新型抗生素的需求越來越迫切，因此尋找新型非核糖體肽合成酶基因具有十分重要的意義。非核糖體肽類通常需要一系列后修飾過程。盡管其合成的模式和酶的催化方式都非常保守，但由于可利用的氨基酸底物非常豐富，非核糖體肽合成酶自身結構的多樣性，使它的種類遠遠超過以核糖體合成的肽類。非核糖體肽合成酶基因的操作潛力十分巨大，運用組合生物學技術對模塊進行重排或者改造，有望得到預期的多肽或者新的藥物。達托霉素就是一種新開發的脂肽類抗生素，對革蘭氏陽性細菌具有很強的抑制作用。組合抗生素已經成為傳統藥物的競爭者。
發明內容
本發明的第一個目的在于提供一種能夠產生非核糖體肽類的非核糖體肽合成酶基因，為組合生物學提供研究材料，為新藥的研發提供更多的候選化合物。為實現上述目的，本發明采取的技術方案為一種新型非核糖體肽合成酶基因，所述非核糖體肽合成酶基因命名為NRPSl 14，所述非核糖體肽合成酶基因的核苷酸序列如SEQID NO I所示。本發明的第二個目的在于提供一種所述新型非核糖體肽合成酶基因的制備方法，為實現此目的采取的技術方案為一種如上所述新型非核糖體肽合成酶基因的制備方法，包括以下步驟通過簡并引物序列篩選的方法，從南海深海沉積物大片段文庫中獲得7個陽性克隆子，挑選一個進行全長測序，然后運用生物信息學軟件對所得序列進行分析，即可獲得所述非核糖體肽合成酶基因。所述新型非核糖體肽合成酶基因NRPS114通過序列篩選的方法從南海深海沉積物文庫中獲得，NRPS114為一個17202bp大小的完整非核糖體肽合成酶基因，利用BLAST在線比對其核苷酸序列進行同源性搜索分析表明，所述新型非核糖體肽合成酶基因NRPS114與已知基因相似性很低，僅為30%左右。
本發明的第三個目的在于提供一種由上述所述非核糖體肽合成酶基因編碼的非核糖體肽合成酶，所述非核糖體肽合成酶與已發現的同類蛋白的模板排列順序不同，它含有5個模塊，共16個結構域，起始模塊中含有3個結構域，分別為腺苷酰化結構域、甲基轉移酶結構域和酰基載體蛋白結構域；第二模塊、第三模塊和第五模塊均為常規模塊，均含有縮合結構域、腺苷酰化結構域和酰基載體蛋白結構域；第四模塊含有兩個縮合結構域、一個腺苷酰化結構域和一個酰基載體蛋白結構域；末端模塊即第五模塊不含硫酯酶結構域。本發明的第四個目的在于提供一種含有如上所述新型非核糖體肽合成酶基因的重組質粒 pCClFOS Fosmid-NRPSl 14。所述重組質粒 pCClF0STMFosmid_NRPS114 保存于大腸埃希菌EPI300中。本發明的第五個目的在于提供一種重組質粒pET28a-A-2his，所述重組質粒 pET28a-A-2his 包括重組質粒 pET28a_Al_2his、pET28a_A2_2his、pET28a-A3-2hispET28a-A4-2his、pET28a_A5_2his，所述五個重組質粒分別含有如上所述的五個腺苷酰化結構域，所述五個重組質粒均采用以下方法制備所得分別根據五個腺苷 酰化結構域的序列設計引物，以權利要求4所述的重組質粒pCClF0S Fosmid-NRPS114為模板，進行PCR擴增，PCR產物經凝膠電泳并回收產物1，凝膠回收產物I經限制性內切酶雙酶切并回收產物2，質粒pET28a經雙酶切后與回收產物2連接，獲得連接產物，即得五個重組質粒 pET28a-Al-2his、pET28a_A2_2his、pET28a_A3_2his、pET28a_A4_2his 和pET28a_A5_2his。本發明的第六個目的在于提供一種表達菌株，所述表達菌株包括大腸桿菌 BL21-pET28a-Al-2his、 BL2l-pET28a-A2_2his、 BL2l-pET28a-A3_2his、BL21-pET28a-A4-2his、BL21-pET28a-A5_2his，所述五個大腸桿菌分別含有如上所述的五個腺苷酰化結構域基因，所述五個大腸桿菌均采用以下方法構建所得采用化轉法，分別將權利要求5中所得的五個重組質粒pET28a-Al-2his、pET28a-A2_2his、pET28a-A3-2his、pET28a_A4_2his、pET28a_A5_2his 轉化到大腸桿菌 BL21 感受態細胞中，將細菌懸浮液恢復培養并稀釋涂布于卡那霉素抗性平板上培養，挑取陽性轉化子，即得腺苷酰化結構域基因的表達菌株大腸桿菌BL21-pET28a-Al-2his、BL21-pET28a-A2_2his、BL21-pET28a-A3-2his、BL21-pET28a-A4-2his 和 BL21-pET28a-A5_2his。本發明的第七個目的在于提供一種腺苷酰化結構域的制備方法，所述方法包括以下步驟(I)重組質粒pET 28a-A-2his的構建根據5個腺苷酰化結構域基因的序列設計引物，以提取的質粒PCC1F0STM Fosmid-NRPSlH為模板，進行PCR擴增，PCR產物經凝膠電泳并回收產物1，凝膠回收產物I經限制性內切酶雙酶切并回收產物2，質粒pET28a經雙酶切后與回收產物2連接，獲得連接產物，即重組質粒pET 28a-A-2his ；(2)腺苷酰化結構域基因表達菌株的構建采用化轉法，將重組質粒pET28a-A-2his轉化到大腸桿菌BL 21感受態細胞中，將細菌懸浮液恢復培養并稀釋涂布于卡那霉素抗性平板上培養，挑取陽性轉化子；(3)腺苷酰化結構域的誘導表達將重組質粒轉化的大腸桿菌涂布于卡那霉素抗性平板上，37°C倒置培養過夜，挑取單克隆接種于卡那霉素抗性液體培養基，37°C振蕩培養過夜，按體積比I :50的比例轉接至新鮮的含有IOOy g/mL卡那霉素抗性的液體培養基，于37°C、200rpm 培養至 OD600=O. 5 O. 6 ;加入 O. lmmol/L IPTG, 16°C，140rpm 誘導培養 20h ;培養后經鎳柱低壓蛋白層析親和純化，即得重組腺苷酰化結構域。將所述新型腺苷酰化結構域基因A1、A2、A3、A4、A5在大腸桿菌原核表達系統中過量表達，采用所述方法得到的重組腺苷酰化結構域，具有較高的使氨基酸發生腺苷酰化的活性，為組合生物學的研究提供更多的基因操作材料，并在新藥的研發中具有巨大的應用前景。作為本發明所述一種腺苷酰化結構域的制備方法的優選實施方式，所述方法還包括以下步驟(4)目的蛋白的檢測取31^誘導后的菌液，10，000\8離心11^11，棄上清，用500 μ L水洗3次，用500 μ LlOmM咪唑裂解緩沖液重懸，超聲3s，停3s，連續超聲5min。菌體破碎液于4°C，12000 X g離心5min，分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳分析，分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度5%。
作為本發明所述一種腺苷酰化結構域的制備方法的優選實施方式，所述方法還包括以下步驟(5)目的蛋白的純化取2L在IPTG終濃度為O. lmM，16°C誘導表達20h的菌液，于4°C 8000 X g離心3min，收集菌體，水洗3次后用裂解緩沖液重懸，在300W功率下進行超聲破碎，超聲5s，停5s，連續超聲45min, 4°C 13000 X g離心20min,取上清，用O. 22 μ m濾膜過濾上清除掉雜質；將過濾后的上清總蛋白通入鎳柱中，收集流出液體；將收集到的液體重新上機，重復 I 次；分別用適量 20mM、50mM、100mM、120mM、140mM、160mM、180mM、200mM、250mM咪唑緩沖液上柱，收集流出液，用于SDS-PAGE蛋白電泳分析。其中，五個腺苷酰化結構域A1、A2、A3、A4、A5與pET28a( + )載體編碼2個六聯組氨酸標簽融合表達，預測相對分子質量分別約為106kDa、64kDa、63. 3kDa、61. 7kDa和63kDa。另外，本發明的最后一個目的在于提供一種采用如上所述方法制備得到的重組腺苷酰化結構域。所述重組腺苷酰化結構域包括Al、A2、A3、A4、A5，所述重組腺苷酰化結構域是腺苷酰化結構域基因A1、A2、43、A4、A5在大腸桿菌原核表達系統中表達后經鎳柱低壓蛋白親和層析的方法純化得到，所述Al、A2、A3、A4、A5具有腺苷酰化結構域保守的10個核心模序，即 L (S/T) YXEL, LKAGXAY (V/L) P (L/Y) D、LAYXXYTSG (S/T) TGXPKG, FDXS, NXYGPTE、GELXIXGXG (V/L) ARGYL, Y (R/K) TCDL、GRXDXQVKIRGXRIELGEIE、LPXYM (I/V) P、NGK (V/L) DR。本發明為組合生物學提供了研究材料，為新藥的研發提供了更多的候選化合物。
圖I為NRPSl 14主要ORF在基因上的排列圖。圖2為本發明所述含有非核糖體肽合成酶基因的南海深海沉積物克隆子序列的開放閱讀框分析結果。圖3為本發明所述腺苷酰化結構域A1、A2、A3、A4、A5的表達載體的構建全過程的瓊脂糖凝膠電泳圖譜。圖3中，a為5個腺苷酰化結構域PCR擴增、pCClFOS Fosmid_NRPS114及pET28a質粒的提取；b:pET28a和5個A結構域的雙酶切結果；c:5個A結構域的PCR產物純化結
果O圖4為腺苷酰化結構域的誘導表達檢測圖譜。圖4中，a :5個腺苷酰化結構域的誘導表達(上清)；b 5個腺苷酰化結構域的誘導表達(沉淀)。
圖5為Al結構域低壓蛋白層析純化結果。圖6為A2結構域低壓蛋白層析純化結果。圖7為A3結構域低壓蛋白層析純化結果。圖8為A4結構域低壓蛋白層析純化結果。圖9為A5結構域低壓蛋白層析純化結果。圖5、6、7、8和9中，M為Marker，I :未誘導；2 :誘導；3 :上清；4 :穿流；5 :20mM洗漆;6 :超濾蛋白。圖10為5個腺苷酰化結構域的Western Blot鑒定結果。
具體實施方式
·為更好的說明本發明的目的、技術方案和優點，下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步描述。實施例II、新型非核糖體肽合成酶基因NRPSl 14的獲得利用簡并引物通過序列篩選的方法，從南海深海沉積物文庫中獲得七個含有NRPS基因的克隆，選擇一個克隆進行全長測序，測序由北京華大基因有限公司完成，然后運用生物信息學軟件對所得序列進行分析，如附圖I和附圖2所示。該序列含有一個17202bp的完整非核糖體肽合成酶基因，命名為NRPSl 14。2、根據腺苷酰化結構域的序列設計引物A1F/A1R、A2F/A2R、A3F/A3R、A4F/A4R、A5F/A5R。3、PCR 擴增
反應體系如下IOx PCR buffer5 μL Mg2^2 LiL dNTPMixI μL Platinum taq0.2 ^iL
AF(10[imol/L)2 μ AR (10 μιηοΙ/L)2 pL pCC IFOS Fosmid'W/W 14I μ
dd H2O補齊至50 μL4、PCR程序如下
權利要求
1.一種新型非核糖體肽合成酶基因，其特征在于，所述非核糖體肽合成酶基因命名為NRPSl 14，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO I所示。
2.一種如權利要求I所述新型非核糖體肽合成酶基因的制備方法，其特征在于，包括以下步驟通過簡并引物序列篩選的方法，從南海深海沉積物大片段文庫中獲得7個陽性克隆子，挑選一個進行全長測序，然后運用生物信息學軟件對所得序列進行分析，即可獲得所述非核糖體肽合成酶基因。
3.一種由權利要求I所述基因編碼的非核糖體肽合成酶，其特征在于，所述非核糖體肽合成酶含有5個模塊，共16個結構域，起始模塊中含有3個結構域，分別為腺苷酰化結構域、甲基轉移酶結構域和酰基載體蛋白結構域；第二模塊、第三模塊和第五模塊均為常規模塊，均含有縮合結構域、腺苷酰化結構域和酰基載體蛋白結構域；第四模塊含有兩個縮合結構域、一個腺苷酰化結構域和一個酰基載體蛋白結構域；末端模塊即第五模塊不含硫酯酶結構域。
4.一種含有如權利要求I所述非核糖體肽合成酶基因的重組質粒PCC1F0S Fosmid-NRPSl14。
5.一種重組質粒pET28a-A-2his，其特征在于，所述重組質粒pET28a-A_2his包括分別含有如權利要求3中所述的五個腺苷酰化結構域的重組質粒pET28a-Al-2his、pET28a-A2-2his、pET28a_A3_2his、pET28a_A4_2his、pET28a_A5_2his，所述五個重組質粒均采用以下方法制備所得分別根據五個腺苷酰化結構域的序列設計引物，以權利要求4所述的重組質粒pCClF0S Fosmid-NRPS114為模板，進行PCR擴增，PCR產物經凝膠電泳并回收產物1，凝膠回收產物I經限制性內切酶雙酶切并回收產物2，質粒pET28a經雙酶切后與回收產物2連接，獲得連接產物，即得五個重組質粒pET28a-Al-2his、pET28a-A2_2his、pET28a-A3-2his、pET28a-A4-2his 和 pET28a_A5_2his。
6.—種表達菌株,其特征在于,所述表達菌株包括分別含有如權利要求3中所述的五個腺苷酰化結構域基因的五個大腸桿菌BL21-pET28a-Al-2his、BL21-pET28a-A2_2his、BL21-pET28a-A3-2his、BL21-pET28a-A4_2his、BL21-pET28a-A5_2his，所述五個大腸桿菌均采用以下方法構建所得采用化轉法，分別將權利要求5中所得的五個重組質粒 pET28a-Al-2his、pET28a-A2-2hispET28a-A3_2his、pET28a_A4_2his、pET28a-A5-2his轉化到大腸桿菌BL21感受態細胞中，將細菌懸浮液恢復培養并稀釋涂布于卡那霉素抗性平板上培養，挑取陽性轉化子，即得腺苷酰化結構域基因的表達菌株大腸桿菌 BL21-pET28a-Al-2his、BL21-pET28a-A2_2his、BL21-pET28a-A3_2his、BL21-pET28a-A4-2his和 BL21-pET28a-A5_2his。
7.一種腺苷酰化結構域的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 Cl)按照權利要求5所述內容構建重組質粒pET28a-A-2his ； (2)將步驟(I)中構建的重組質粒按照權利要求6所述內容構建腺苷酰化結構域基因表達載體大腸桿菌； (3)目的蛋白腺苷酰化結構域的誘導表達將步驟(2)中構建得到的大腸桿菌涂布于卡那霉素抗性平板上，37°C倒置培養過夜，挑取單克隆接種于含有IOOy g/mL卡那霉素的液體培養基，37°C振蕩培養過夜，按體積比I :50的比例轉接至新鮮的卡那霉素液體培養基，于 37°C、200rpm 培養至 OD6qq=O. 5 O. 6 ;加入 O. lmmol/L IPTG, 16°C，140rpm 誘導培養20h ;培養后經鎳柱低壓蛋白層析親和純化，即得重組腺苷酰化結構域。
8.如權利要求7所述的腺苷酰化結構域的制備方法，其特征在于，還包括以下步驟 (4)目的蛋白的檢測取3mL誘導后的菌液，10，000X g離心lmin，棄上清，用500 μ L水洗3次，用500 μ LlOmM咪唑裂解緩沖液重懸，超聲3s，停3s，連續超聲5min。菌體破碎液于4°C，12000 Xg離心5min，分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE電泳分析，分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度5%。
9.如權利要求8所述的腺苷酰化結構域的制備方法，其特征在于，還包括以下步驟 (5)目的蛋白的純化取2L在IPTG終濃度為O.ImM, 16°C誘導表達20h的菌液，于40C 8000 Xg離心3min，收集菌體，水洗3次后用裂解緩沖液重懸，在300W功率下進行超聲破碎，超聲5s，停5s，連續超聲45min, 4°C 13000 X g離心20min,取上清，用O. 22 μ m濾膜過濾上清除掉雜質；將過濾后的上清總蛋白通入鎳柱中，收集流出液體；將收集到的液體重 新上機，重復 I 次；分別用適量20禮、501111、1001111、1201111、1401111、1601111、1801111、2001111、2501111咪唑緩沖液上柱，收集流出液，用于SDS-PAGE蛋白電泳分析。
10.一種采用如權利要求7所述方法得到的重組腺苷酰化結構域。
全文摘要
本發明公開一種新型非核糖體肽合成酶基因，所述非核糖體肽合成酶基因命名為NRPS114，所述非核糖體肽合成酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示；同時，本發明還公開了所述非核糖體肽合成酶基因的制備方法，含有非核糖體肽合成酶基因的質粒pCC1FOSTM Fosmid-NRPS114，以及所述非核糖體肽合成酶基因中的5個腺苷酰化結構域的重組質粒pET28a-A-2his的表達載體。另外，本發明還公開了5種腺苷酰化結構域及其制備方法，將所述腺苷酰化結構域基因A1、A2、A3、A4、A5在大腸桿菌原核表達系統中過量表達，得到重組腺苷酰化結構域，具有較高的使氨基酸發生腺苷酰化的活性，為組合生物學的研究提供更多的基因操作材料，并在新藥的研發中具有巨大的應用前景。
文檔編號C12R1/19GK102719464SQ201210205929
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月20日 優先權日2012年6月20日
發明者何磊, 劉莉璇, 周世寧, 陸勇軍, 黃雅莉 申請人:中山大學