一種重組工程介導(dǎo)的大腸桿菌基因組點(diǎn)突變的方法

專利名稱：一種重組工程介導(dǎo)的大腸桿菌基因組點(diǎn)突變的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體是涉及一種高效的運(yùn)用重組工程手段實(shí)現(xiàn)大腸桿菌基因組點(diǎn)突變的方法。
背景技術(shù)：
大腸桿菌是遺傳學(xué)研究的最為透徹的微生物菌株，廣泛用于生物學(xué)的基礎(chǔ)研究。大腸桿菌同時(shí)也是工業(yè)生產(chǎn)中最重要的微生物菌株之一，是合成生物學(xué)和代謝工程的首選菌株。大腸桿菌在生產(chǎn)藥物、精細(xì)化工產(chǎn)品以及具工業(yè)催化價(jià)值的酶等方面有著廣泛的用途。這些實(shí)際的功能均與基因組上的基因密切關(guān)聯(lián)，因此闡述這些基因的功能和改善這些基因的品質(zhì)是發(fā)揮大腸桿菌功能的重要途徑。在諸多研究手段中，基因組的點(diǎn)突變(即基因位點(diǎn)的點(diǎn)突變)是關(guān)鍵的一種。
經(jīng)典的大腸桿菌基因組點(diǎn)突變的方法有兩種。均首先是通過(guò)重疊一延伸聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等方法將引入突變位點(diǎn)的基因克隆在載體上，突變位點(diǎn)兩側(cè)含有與基因組序列一致的同源片段(設(shè)為A和B)。第一種方法選擇的是含有溫度敏感型復(fù)制子的載體。大腸桿菌的生長(zhǎng)溫度是37° C，溫度敏感型復(fù)制子只能在30° C時(shí)進(jìn)行復(fù)制，在37° C時(shí)，含溫度敏感型復(fù)制子的質(zhì)粒因?yàn)椴荒軓?fù)制而失去。當(dāng)含有突變位點(diǎn)的含溫度敏感型復(fù)制子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌后，首先在30° C培養(yǎng)，通過(guò)抗性選擇得到質(zhì)粒游離于基因組的菌株，隨后提高培養(yǎng)溫度至37° C或42° C，迫使質(zhì)粒通過(guò)突變位點(diǎn)一側(cè)的同源片段(任為A或B)整合至基因組上，隨后在30° C之下進(jìn)行培養(yǎng)，篩選失去抗性(即失去質(zhì)粒的)菌株，此時(shí)菌株有兩種類型，一種類型是用于第一步整合的片段(A或B)再次用于發(fā)生同源重組，而得到回復(fù)至原株基因組的菌株；另外一種類型是第二個(gè)同源片段(第一次為A，則此時(shí)為B ;第一次為B,則此時(shí)為A)發(fā)生同源重組，而得到目的位點(diǎn)發(fā)生突變的突變株。第二種方法選擇的是含有不能在常規(guī)大腸桿菌中復(fù)制的復(fù)制子(如需要Pir蛋白才能復(fù)制的R6K復(fù)制子)和含有負(fù)篩選標(biāo)記的質(zhì)粒。一種典型的負(fù)篩選標(biāo)記是編碼6-果糖基轉(zhuǎn)移酶的sacB基因，含有此基因的菌株(在質(zhì)粒上或基因組上)不能在含10%的蔗糖培養(yǎng)基中生存。將克隆有突變位點(diǎn)和同源片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌后，由于質(zhì)粒不能復(fù)制，在抗性篩選之下，迫使突變位點(diǎn)一側(cè)的同源片段(任為A或B)整合至基因組上。隨后將菌株在負(fù)篩選的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，與第一種方法類似，如相同的同源片段再次發(fā)生同源重組，則得到原株基因型的菌株；如不同的同源片段方式重組，則得到目的位點(diǎn)發(fā)生突變的菌株。由此可見(jiàn)，這兩個(gè)經(jīng)典的方法的不足是1.因?yàn)樗璧耐雌屋^長(zhǎng)(一般需lkb)，故需要步驟煩瑣和耗時(shí)長(zhǎng)的基因克隆步驟；2.在最終菌株中發(fā)生突變的比例可能相差較大，即需要篩選較多的克隆才能得到正確的突變株。隨著重組工程方法學(xué)的興起，直接合成含突變位點(diǎn)的寡核苷酸，將之轉(zhuǎn)化大腸桿菌后篩再選點(diǎn)突變的菌株成為可能。重組工程一般使用來(lái)源于lambda噬菌體的三個(gè)基因。其中exo基因編碼5’->3外切酶，其作用于雙鏈DNA而得到3’端突出的DNA分子；bet基因編碼3’突出端的單鏈結(jié)合蛋白，同時(shí)促進(jìn)同源片段之間的同源重組；gam基因編碼抑制內(nèi)源性核酸酶的Gam蛋白，使得轉(zhuǎn)化的DNA分子免受菌株本身的核酸酶所降解，這三個(gè)基因共同行使重組酶的活性。重組工程突出優(yōu)點(diǎn)是可以催化短至36bp之間的同源片段(稱為同源臂)之間的同源重組而實(shí)現(xiàn)DNA的克隆和修飾。突變寡核苷酸的方法雖然簡(jiǎn)便，但迄今報(bào)道的突變率往往很低，在1%左右甚至更少，這就需要篩選大量的克隆才能得到正確的突變株。因此突變寡核苷酸的方法目前只具有基礎(chǔ)研究意義，目前難以推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
為克服上述不足，本發(fā)明申請(qǐng)?zhí)岢隽艘环N基于重組工程的大腸桿菌基因組的點(diǎn)突變方法。本方法的基本原理是首先通過(guò)重組工程的手段在基因組上引入含突變位點(diǎn)(單個(gè)或數(shù)個(gè)堿基)、30bp同源片段、兩側(cè)為歸巢核酸酶I-SceI酶切位點(diǎn)的卡那霉素抗性基因，隨后誘導(dǎo)表達(dá)的I-SceI作用于整合在基因組上的I-SceI酶切位點(diǎn)，促使30bp同源片段之間發(fā)生同源重組而將一個(gè)30bp同源片段、兩個(gè)I-SceI酶切位點(diǎn)和卡那霉素抗性基因去除，最 終得到不含有任何冗余序列的、發(fā)生點(diǎn)突變的大腸桿菌突變株。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案包括以下步驟(I)通過(guò)重疊-延伸聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得一個(gè)DNA修飾片段，所述DNA修飾片段依次由下列結(jié)構(gòu)組成基因組上靶位點(diǎn)(即待突變位點(diǎn))上游50bp序列一致的50bp同源臂、突變位點(diǎn)(即突變成功的位點(diǎn))、與靶位點(diǎn)下游30bp序列一致的30bp同源片段、兩側(cè)為兩個(gè)歸巢核酸酶I-SceI酶切位點(diǎn)的卡那霉素抗性基因、與祀位點(diǎn)下游50bp序列一致的50bp同
源臂；(2)將含重組酶基因和I-SceI基因的質(zhì)粒pLS134轉(zhuǎn)化至大腸桿菌MG1655中；所述的質(zhì)粒PLS134是將PCR擴(kuò)增的tetR-ptetA-1-SceI基因盒片段以NsiI酶切后，克隆至pBAD322的NsiI位點(diǎn)，得到重組克隆pLS133 ;再將exo，bet和gam三個(gè)重組酶基因從lambda噬菌體DNA中PCR擴(kuò)增后，以NcoI和XhoI酶切后，克隆至pLS133的NcoI和SaII位點(diǎn)，得到目的質(zhì)粒pLS134 ；(3)將步驟(I)得到的DNA修飾片段電轉(zhuǎn)化至以終濃度為O. 15%的L-阿拉伯糖誘導(dǎo)下表達(dá)Red重組酶基因的步驟(2)的大腸桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)重組酶介導(dǎo)的同源臂和大腸桿菌基因組上相同序列之間的同源重組，將所述DNA修飾片段中，左右50bp同源臂之間的片段整合至大腸桿菌基因組，在卡那霉素抗性篩選之下，獲得整合有突變位點(diǎn)、30bp同源片段和兩側(cè)為I-SceI酶切位點(diǎn)的卡那霉素抗性基因的卡那霉素抗性突變株；(4)將步驟(3)得到的菌株在含終濃度為20μ g/ml熱處理的氯四環(huán)素的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，熱失活的氯四環(huán)素誘導(dǎo)I-SceI酶的表達(dá)，I-SceI酶作用于整合在基因組上的I-SceI酶切位點(diǎn)，基因組發(fā)生雙鏈斷裂，促使菌株利用自身的重組功能催化30bp同源片段與靶位點(diǎn)下游30bp之間發(fā)生同源重組，從而將30bp同源片段、兩個(gè)I-SceI酶切位點(diǎn)及卡那霉素抗性基因消除，最終獲得發(fā)生點(diǎn)突變的大腸桿菌突變株。本發(fā)明中所述的靶位點(diǎn)，可以是一個(gè)或數(shù)個(gè)堿基，相應(yīng)地，突變位點(diǎn)也可以是一個(gè)或數(shù)個(gè)堿基。I-SceI基因來(lái)源于酵母，所編碼的I-SceI酶作用于18個(gè)堿基對(duì)的5’-TAGGGATAACAGGGTAAT-3’序列，在AC位點(diǎn)之間進(jìn)行切割。此18個(gè)堿基對(duì)的序列在大腸桿菌基因組中不存在，故I-SceI不會(huì)作用于大腸桿菌的基因組，也就不會(huì)影響大腸桿菌的生存。I-SceI基因克隆在ptetA啟動(dòng)子之下，ptetA啟動(dòng)子受tetR調(diào)節(jié)基因所控制，在四環(huán)素及其類似物存在時(shí)，TetR解除對(duì)ptetA啟動(dòng)子的抑制，ptetA啟動(dòng)子開(kāi)始啟動(dòng)I-SceI基因的表達(dá)。將PCR擴(kuò)增得到的tetR-ptetA-1-SceI基因盒片段以NsiI酶切后，克隆至低拷貝質(zhì)粒PBAD322的NsiI位點(diǎn)，得到重組克隆pLS133。重組酶基因選擇是來(lái)自于lambda卩遼菌體的exo,bet和gam,將這三個(gè)重組酶基因從lambda噬菌體DNA中擴(kuò)增，以NcoI和XhoI酶切后，克隆至pLS133的NcoI和SaII位點(diǎn)，得到目的質(zhì)粒PLS134。PLS134在L-阿拉伯糖誘導(dǎo)下表達(dá)red重組酶基因，在失活的氯四環(huán)素誘導(dǎo)下表達(dá)I-SceI。優(yōu)選實(shí)施例是對(duì)大腸桿菌基因組上的IacZ基因位點(diǎn)和nanA基因位點(diǎn)的點(diǎn)突變。IacZ為β -半乳糖苷酶基因，在MG1655基因組上的基因編號(hào)是b0344，突變的是單個(gè)位點(diǎn)，即開(kāi)放閱讀框的第70位堿基C突變?yōu)門，這使得第24位的氨基酸谷氨酰胺突變?yōu)榻K止密·碼子。nanA為神經(jīng)氨酸醛縮酶基因，在MG1655基因組上的基因編號(hào)是b3225，突變的是三個(gè)位點(diǎn)(盡管中間的一個(gè)堿基是一致的，但原理上來(lái)說(shuō)是三個(gè)堿基發(fā)生了突變)，即開(kāi)放閱讀框的第574-576堿基GAA突變?yōu)锳AC，這使得第192位的氨基酸谷氨酸突變?yōu)樘於０?。兩個(gè)點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)充分證明了本發(fā)明方法的可行性和較常規(guī)方法的優(yōu)越性。本方法非常簡(jiǎn)捷，無(wú)需克隆和測(cè)序，只涉及PCR、轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)等步驟，因此可以同時(shí)進(jìn)行多個(gè)位點(diǎn)的突變實(shí)驗(yàn)；方法也非常高效，第一步的重組酶催化的同源重組的效率在60%左右，第二步同源重組的效率可達(dá)100%，只要篩選幾個(gè)克隆就足以得到點(diǎn)突變菌株。本方法無(wú)需任何特殊的設(shè)備，整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期在一周之內(nèi)，有可能成為通用的大腸桿菌基因組點(diǎn)突變的方法，有著良好的基礎(chǔ)研究和實(shí)際應(yīng)用的經(jīng)濟(jì)前景。


圖I是本發(fā)明所采用的方法的示意圖。圖2MG16551acZ點(diǎn)突變和nanA點(diǎn)突變的原株和變株的基因型分析的凝膠電泳結(jié)
果OI. DL2000 分子量標(biāo)準(zhǔn)2. O, I. O, O. 75，O. 5，O. 25，O. Ikb ；2.以MG1655的基因組為模板，R1165和R1166擴(kuò)增得到595bp;3.以含IacZ點(diǎn)突變的卡那霉素抗性菌株的基因組為模板，Rl 165和Rl 166擴(kuò)增得到 1750bp ；4.以IacZ點(diǎn)突變變株的基因組為模板，Rl 165和Rl 166擴(kuò)增得到595bp ；5. DL2000 分子量標(biāo)準(zhǔn)2. O, I. O, O. 75，O. 5，O. 25，O. Ikb ；6.以MG1655的基因組為模板，R1175和R1176擴(kuò)增得到349bp;7.以含nanA點(diǎn)突變的卡那霉素抗性菌株的基因組為模板，Rl 175和Rl 176擴(kuò)增得到 1505bp ；8.以nanA點(diǎn)突變變株的基因組為模板，R1175和R1176擴(kuò)增得到349bp。圖3是MG1655原株和IacZ突變株突變位點(diǎn)區(qū)域的測(cè)序圖。圖的上部分和下部分分別為以R1165為測(cè)序引物，對(duì)MG1655和IacZ點(diǎn)突變變株的基因組為模板，R1165和R1166擴(kuò)增得到595bp進(jìn)行測(cè)序的結(jié)果。可見(jiàn)在測(cè)序圖譜中，在MG1655原株的第231位置處的堿基為C，而IacZ點(diǎn)突變變株的堿基為T，表明實(shí)現(xiàn)了 C突變?yōu)門。圖4是MG1655原株和nanA突變株突變位點(diǎn)區(qū)域的測(cè)序圖。圖的上部分和下部分分別為以R1175為測(cè)序引物，對(duì)MG1655和nanA點(diǎn)突變變株的基因組為模板，R1175和R1176擴(kuò)增得到349bp進(jìn)行測(cè)序的結(jié)果。可見(jiàn)在測(cè)序圖譜中，在MG1655原株的第131至133位置處的堿基為GAA，而nanA點(diǎn)突變變株的第131至133位置處的堿基為AAC，表明實(shí)現(xiàn)了 GAA突變?yōu)锳AC。
具體實(shí)施例方式在本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)，除非有另外說(shuō)明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。 下面結(jié)合具體的實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說(shuō)明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過(guò)程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。所用試劑的來(lái)源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明，其后所用相同試劑如無(wú)特殊說(shuō)明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。實(shí)施例中所用到的菌株和質(zhì)粒，均為已公開(kāi)的菌株和質(zhì)粒I. Escherichia coli MG1655?；蛐虵 LAM-rph-l,來(lái)自美國(guó)大腸桿菌保藏中心。2. Escherichia coli DH10B。 基因型 FlncrA Δ (mrr-hsdRMS-mcrBC)Φ80dlacZΔM15ΔlacX74deoR recAl araD139Δ (ara,leu)7697galU galK rpsLendAlnupG.。文獻(xiàn)Life Technologies, Inc. Focus, 1990,12:19。購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司。3. pST98_AS。 文獻(xiàn)Posfai G. , Kolisnychenko V. , Bereczki Z, BlattnerFR.Markerless gene replacement in Escherichia coli stimulated by adouble-strand break in the chromosome. Nucleic Acids Res. 1999，27(22):4409-15。來(lái) 自美國(guó) University of Wisconsin, Madison 的 Frederick Blattner 教授。4.pBAD322。文獻(xiàn)Cronan JE. A family of arabinose-inducible Escherichiacoli expression vectors having pBR322copy control. Plasmid. 2006，55(2):152-7。來(lái)自美國(guó) University of Illinois at Urbana-Champaign 的 John Cronan 教授。5. pKD4 和 Escherichia coli BW25141。文獻(xiàn)Datsenko KA, Wanner BL. One-stepinactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K_12using PCR products.Proc Natl Acad Sci U S A. 2000，97 (12) : 6640-5。來(lái)自美國(guó) Purdue 大學(xué) Barry Wanner的教授。本發(fā)明的方法示意圖如圖1，圖中各符號(hào)的意義如下。X為靶位點(diǎn)(即待突變位點(diǎn))；Y為突變位點(diǎn)(即突變成功的位點(diǎn))；A為靶位點(diǎn)上游50bp用于重組工程的同源臂序列；B為靶位點(diǎn)下游30bp序列；C為30bp序列下游的20bp序列；A，X，B和C序列在基因組上相連；I-SceI為歸巢核酸酶I-SceI基因；S為Ι-Scel的酶切位點(diǎn)；neo為卡那霉素抗性基因；5’ -neo為卡那霉素抗性基因的5’端；3’ -neo為卡那霉素抗性基因的3"端；Red表示重組工程；雙交叉號(hào)表示同源重組重組工程介導(dǎo)的同源重組；Kan表示卡那霉素篩選；雙箭頭表示B片段之間的同源重組；PCR表示聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；OE-PCR表示重疊一延伸聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。Pl至P8為PCR引物，Pl由A，Y，B和擴(kuò)增S位點(diǎn)和5’ -neo的序列所組成；P2為neo中間的一段序列；P3為P2的反向互補(bǔ)序列；P4由C和B的反向互補(bǔ)序列以及擴(kuò)增S位點(diǎn)和3’ -neo的序列所組成；P5為Pl前端約21個(gè)堿基的序列；P6為P2前端約21個(gè)堿基的序列。簡(jiǎn)要的實(shí)驗(yàn)過(guò)程是以含兩側(cè)為S位點(diǎn)的卡那霉素抗性基因的質(zhì)粒為模板，Pl和P2擴(kuò)增出A-Y-B-S-5’ -neo的片段，P3和P4擴(kuò)增出3’ -neo-S-B-C的片段，以這兩個(gè)片段為模板，P5和P6通過(guò)OE-PCR擴(kuò)增出A-Y-B-S-neo-S-B-C的重組工程修飾片段。將此約I. 2kb的片段點(diǎn)轉(zhuǎn)化至表達(dá)重組酶的大腸桿菌原株MG1655中，重組酶催化50bp同源臂(上游為A序列，下游為B+C序列)和基因組上相同序列之間發(fā)生同源重組，在卡那霉素的抗性篩選之下，修飾片段中兩個(gè)同源臂之間的序列取代了基因組上兩個(gè)同源臂之間的序列，靶位點(diǎn)X突變?yōu)閅，同時(shí)將30bp同源片段和兩側(cè)為I-SceI酶切位點(diǎn)的卡那霉素小基因組整合至基因組。P7為A上游相隔約150至300個(gè)堿基的序列，P8為C下游相隔約150至300個(gè)堿基的序列。以抗性菌株的基因組DNA為模板，P7和P8為引物，擴(kuò)增得到突變區(qū)域的片段，通過(guò)測(cè)序確證靶位點(diǎn)X突變?yōu)閅。將含卡那霉素抗性基因的突變株在含熱失活的氯四環(huán)素培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，熱失活的氯四環(huán)素誘導(dǎo)I-SceI的表達(dá)，隨后作用的S位點(diǎn)，導(dǎo)致大腸桿菌基因組發(fā)生雙鏈斷裂，迫使大腸桿菌利用自身的重組系統(tǒng)催化30bp同源片段之間的同源重組而將一段30bp同源片段、兩個(gè)S位點(diǎn)序列及其中間的卡那霉素抗性基因去除，最后獲得不含任何溶于序列的點(diǎn)突變變株。P7和P8用于原株和點(diǎn)突變變株的基因型驗(yàn)證，并以P7為測(cè)序引物對(duì)擴(kuò)增片段測(cè)序以確證驗(yàn)證突變的發(fā)生。實(shí)施例I.載體的構(gòu)建I.重組酶和I-SceI表達(dá)載體的構(gòu)建設(shè)計(jì)引物IPMl :5’ -GGGATGCATTTAAGACCCACTTTCACATTTAAG-3’，(SEQ ID NO. I)；IPM2 :5’ -GGGATGCATTTATTTCAGGAAAGTTTCGGAG-3’，(SEQ ID NO. 2)。以 pST98_AS 為模板，IPMl和IPM2擴(kuò)增得到I. 4kb的tetR-ptetA-I-Scel片段。將I. 4kb片段以NsiI酶切后，克隆至PBAD322的NsiI位點(diǎn)，得到重組克隆pLS133。設(shè)計(jì)引物IPM3 :5，-GGGCCATGGATATTAATACTGAAACTG-3，，(SEQ ID NO. 3) ；IPM4 5’ -GGGCTCGAGCTATCGCCATTGCTCCCCAAATAC-3'，(SEQ ID NO. 4)。以 HindIII 酶切的 lambda噬菌體DNA (購(gòu)自大連寶生物公司)為模板，IPM3和IPM4擴(kuò)增得到I. 9kb的red基因片段，將之以NcoI和XhoI酶切后，克隆至pLS133的NcoI和SaII位點(diǎn)，得到目的克隆pLS134。XhoI和SaII是同尾酶，酶切后可以連接克隆，連接后兩個(gè)酶切位點(diǎn)均消失。PLS134在L-阿拉伯糖誘導(dǎo)下表達(dá)Red重組酶，在失活的氯四環(huán)素誘導(dǎo)下表達(dá)I-SceI。以上質(zhì)粒的克隆宿主菌均為大腸桿菌DH10B，所有克隆均經(jīng)酶切和測(cè)序驗(yàn)證所得序列正確性。
2.抗性基因和I-SceI酶切位點(diǎn)的模板載體的構(gòu)建設(shè)計(jì)引物IPM5 :5’-GGAATCGATTAGGGATAACAGGGTAATTATGGACAGCAAGCGAACCGG-3 ' , (SEQ ID NO. 5) ;IPM6 :5’-GGGTCTAGAATTACCCTGTTATCCCTATCAGAAGAACTCGTCAAGAAG-3/，(SEQ ID NO. 6)。以 pKD4 為模板，IPM5 和 IPM6 擴(kuò)增 I. Ikb 的片段，以 ClaI 和 XbaI雙酶切后，與以ClaI和XbaI雙酶切的pKD4相連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BW25141的感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組克隆PLS135。pLS135即為克隆兩側(cè)含有I-SceI酶切位點(diǎn)的卡那霉素抗性基因的載體，此載體用做大腸桿菌基因組點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)中擴(kuò)增兩側(cè)兩個(gè)I-SceI酶切位點(diǎn)和卡那霉素抗性基因的模板。PLS135使用R6K復(fù)制子，因?yàn)镽6K復(fù)制子需要Pir蛋白才能行使復(fù)制的功能，而常規(guī)的大腸桿菌如MG1655不含Pir蛋白，以pLS135做模板就沒(méi)有質(zhì)粒背景的干擾，PCR產(chǎn)物可以直接沉淀回收。實(shí)施例2 IacZ基因開(kāi)放閱讀框的第70位堿基C突變?yōu)門I.表達(dá)Red重組酶基因的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化pLS134轉(zhuǎn)化至MG1655，以含50 μ g/ml的氨芐青霉素抗性進(jìn)行篩選。將所得菌株單菌落接種至3ml LB液體培養(yǎng)基中，37° C振蕩過(guò)夜，以1/50體積轉(zhuǎn)至50ml LB，振蕩培養(yǎng)至菌體0D_約為O. 2時(shí)，加入終濃度為O. 15%的L-阿拉伯糖以誘導(dǎo)重組酶，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600約為O. 4，將菌液倒入預(yù)冷的離心管，冰浴10分鐘，4° C，5000rpm離心5分鐘，棄上清。以冰冷的10%甘油洗滌沉淀兩次最后懸浮于200 μ I冰冷的10%甘油中，50 μ I每管分裝。
將溶解于雙蒸水的DNA加至50 μ I重組酶表達(dá)的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈混勻。將混合液轉(zhuǎn)移至冰上預(yù)冷的1_電轉(zhuǎn)杯中進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化。電轉(zhuǎn)化條件200 Ω，1800V，美國(guó)Bio-Rad公司Gene Pulser IIk電轉(zhuǎn)化儀。加Iml LB液體培養(yǎng)基至電轉(zhuǎn)杯，吹打混勻，將溶液轉(zhuǎn)移至一個(gè)無(wú)菌的I. 5ml離心管中，37° C振蕩培養(yǎng)60分鐘后，轉(zhuǎn)化液涂布在含相應(yīng)抗生素的抗性平板上，37° C培養(yǎng)。挑取單菌落，菌落PCR驗(yàn)證基因型，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序確證其突變。2. IacZ基因開(kāi)放閱讀框的第70位堿基C突變?yōu)門在此實(shí)施例中，靶位點(diǎn)為IacZ基因開(kāi)放閱讀框的第70位堿基C，突變位點(diǎn)為T，即將C突變?yōu)門。設(shè)計(jì)弓 I 物 R1161 5' - cactggccgicgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttaccT.4^ ( T
TAA TCGCCTTGCAGCACATCCCX Y IT. AACAAATAGGGGTTCCGCGC-3，, ( SEQ ID NO. 7),在此引物中，靶位點(diǎn)上游的50bp同源臂以小寫字母表示，突變位點(diǎn)以粗體字母表示，靶位點(diǎn)下游的30bp同源片段以斜體字母表示，擴(kuò)增引物以下劃線字母表示；Rl 162 :5，-GCTATTACGCCAGCTGGCGA AA(Ki(；(；(；AT(；n；CT(； CAAGGCUAUAAC,ITTCCTTAGTTCCTATTCCGAAG-3’，(SEQ ID NO. 8)，在此引物中，靶位點(diǎn)下游的 30bp 同源片段下游的20bp的反向互補(bǔ)序列以常規(guī)字母表示，靶位點(diǎn)下游的30bp同源片段的反向互補(bǔ)序列以斜體字母表示，擴(kuò)增引物以下劃線字母表示。R1161和R1162分別對(duì)應(yīng)圖 I 中的 Pl 和 P4。R1102 :5’-GCCTCGTCCTGCAGTTCATTC-3’，(SEQ ID NO. 9), R1103 5’ -GAATGAACTGCAGGACGAGGC-3’，(SEQ ID NO. 10)，Rl 102 為卡那霉素抗性基因中 326至346的21bp序列，Rl 103為Rl 102的反向互補(bǔ)序列。Rl 102和Rl 103分別對(duì)應(yīng)圖I 中的 P2 和 P3。R1163 :5，-CACTGGCCGTCGTTTTACAAC-3，，(SEQ ID NO. 11) ；R1164 5’ -GCTATTACGCCAGCTGGCGAAAG-3’，(SEQ ID NO. 12)，R1163 為 R1161 前端的 21bp 序列，R1164為R1162前端的23bp序列。R1163和R1164分別對(duì)應(yīng)圖I中的P5和P6。以pLS135為模板，R1161和R1102為引物，PCR擴(kuò)增得到O. 5kb的DNA片段，R1103和R1162為引物，PCR擴(kuò)增得到O. 8kb的DNA片段。凝膠回收O. 5kb和O. 8kb，合并作為模板，以R1163和R1164為引物，0E-PCR擴(kuò)增得到I. 3kb的DNA片段，電轉(zhuǎn)化至由上所得重組酶表達(dá)的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，在含50 μ g/ml的氨節(jié)青霉素和30 μ g/ml卡那霉素的抗性平板上篩選。設(shè)計(jì)引物R1165 :5’-AACCGCCTCTCCCCGCGCGTTG-3’，(SEQ ID NO. 13) ；R1166 5’ -CATCAACATTAAATGTGAGCG-3’，(SEQ ID NO. 14)，Rl 165 為靶位點(diǎn) C 上游 270bp 的序列，R1166為靶位點(diǎn)C下游203bp的序列。R1165和R1166分別對(duì)應(yīng)圖I中的P7和P8。隨機(jī)挑選5個(gè)抗性克隆，分別以之基因組為模板，R1165和R1166為引物，5個(gè)克隆均經(jīng)PCR擴(kuò)增得到I. 7kb的DNA片段。將此I. 7kb以R1165和R1166為測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序，序列分析表明其中的三個(gè)克隆發(fā)生了點(diǎn)突變。此時(shí)即得到IacZ點(diǎn)突變的、30bp同源片段以及兩側(cè)為I-SceI酶切位點(diǎn)的卡那霉素抗性基因整合至大腸桿菌基因組上的菌株。其中一個(gè)正確克隆的擴(kuò)增產(chǎn)物為圖2中的第3泳道。將含點(diǎn)突變的抗性菌株接種至含20 μ g/ml熱處理的氯四環(huán)素的3ml液體LB中培養(yǎng)20小時(shí)，稀釋10_6后，涂布LB平板。隨機(jī)挑選25個(gè)克隆同時(shí)劃線至含30 μ g/ml卡那霉素和不含抗生素的LB固體平板進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果顯示所有的克隆均沒(méi)有卡那霉素抗性，這表 明卡那霉素抗性基因區(qū)域已失去。以MG1655原株和任意挑取5個(gè)沒(méi)有抗性的克隆，以R1165和R1166為引物菌落PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增均得到595bp，MG1655原株和一個(gè)變株的擴(kuò)增結(jié)果分別為圖2中的第2和第4泳道。分別以Rl 165為測(cè)序引物對(duì)MG1655原株和一個(gè)變株的Rl 165和Rl 166的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序圖譜見(jiàn)圖3的上半部分和下半部分?？梢?jiàn)在測(cè)序圖譜中，在MG1655原株測(cè)序圖譜的第231位置處(即IacZ基因開(kāi)放閱讀框的第70位堿基)為C，而IacZ點(diǎn)突變變株的第231位置處(即IacZ基因開(kāi)放閱讀框的第70位堿基)為T，表明實(shí)現(xiàn)了 C突變?yōu)門，即點(diǎn)突變完成。實(shí)施例3nanA基因開(kāi)放閱讀框的第574-576堿基GAA突變?yōu)锳AC在此實(shí)施例中，靶位點(diǎn)為nanA基因開(kāi)放閱讀框的第574-576堿基GAA，突變位點(diǎn)為AAC,即將GAA突變?yōu)锳AC。設(shè)計(jì)弓 I 物 R1171 5' - agcagatccgtcgtgaacatcctgatcttgtgctctaraacggttacgacAAC^rCTTCGCCTCTGGTCTGCTGG(7 AACAAATAGGGGTTCCGCGC—3’，(SEQ ID NO. 15)，在此引物中，靶位點(diǎn)上游的50bp同源臂以小寫字母表示，突變位點(diǎn)以粗體字母表示，靶位點(diǎn)下游的30bp同源片段以斜體字母表示，擴(kuò)增引物以下劃線字母表示；R1172 5’ -GTACTGCCGATACCACCATCAGC (；('('(('( (；( 'AGACC 'AGAGCK 'GAAGATTC 'C TTAGTTCCTATTCCGAAG-3’，(SEQ ID NO. 16)，在此引物中，靶位點(diǎn)下游的30bp同源片段下游的20bp的反向互補(bǔ)序列以常規(guī)字母表示，靶位點(diǎn)下游的30bp同源片段的反向互補(bǔ)序列以斜體字母表示，擴(kuò)增引物以下劃線字母表示。R1171和R1172分別對(duì)應(yīng)圖I 中的 Pl 和 P4。R1102 :5’-GCCTCGTCCTGCAGTTCATTC-3’，(SEQ ID NO. 9), R1103 5’ -GAATGAACTGCAGGACGAGGC-3’，(SEQ ID NO. 10)，Rl 102 為卡那霉素抗性基因中 326至346的21bp序列。Rl 103為Rl 102的反向互補(bǔ)序列，Rl 102和Rl 103分別對(duì)應(yīng)圖
I中的 P2 和 P3。R1173 :5’-AGCAGATCCGTCGTGAACATC-3’，(SEQ ID NO. 17)；R1174 5’ -GTACTGCCGATACCACCATCAG-3’ (SEQ ID NO. 18)。R1173 為 R1161 前端的 21bp 序列，R1174為R1162前端的22bp序列，R1173和R1174分別對(duì)應(yīng)圖I中的P5和P6。以pLS135為模板，R1171和R1102為引物，PCR擴(kuò)增得到O. 5kb的DNA片段，R1103和R1172為引物，PCR擴(kuò)增得到O. 8kb的DNA片段(R1102和R1103與實(shí)施例2中的引物相同)。凝膠回收O. 5kb和O. 8kb，合并作為模板，以Rl 173和Rl 174為引物，OE-PCR擴(kuò)增得到I. 3kb的DNA片段，電轉(zhuǎn)化至由重組酶表達(dá)的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞(與實(shí)施例2相同)，在含50 μ g/ml的氨芐青霉素和30 μ g/ml卡那霉素的抗性平板上篩選。設(shè)計(jì)弓丨物R1175 :5’-TACAACATTCCAGCCCTGAG-3’，(SEQ ID NO. 19) ；R1176 5’ -GGAATACGCCCGTTTTGATC-3’，(SEQ ID NO. 20)，R1175 為靶位點(diǎn) GAA 上游 164bp 的序列，R1176為靶位點(diǎn)GAA下游161bp的序列。R1175和R1176分別對(duì)應(yīng)圖I中的P7和P8。隨機(jī)挑選5個(gè)抗性克隆，分別以之基因組為模板，R1175和R1176為引物，5個(gè)克隆均經(jīng)PCR擴(kuò)增得到I. 5kb的DNA片段。將此I. 5kb以R1175和R1176為測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序，序列分析表明其中的三個(gè)克隆發(fā)生了點(diǎn)突變。此時(shí)即得到nanA點(diǎn)突變的、30bp同源片段以及兩側(cè)為I-SceI酶切位點(diǎn)的卡那霉素抗性基因整合至大腸桿菌基因組上的菌株。其中一個(gè)正確克隆的擴(kuò)增產(chǎn)物為圖2中的第7泳道。將含點(diǎn)突變的抗性菌株接種至含20 μ g/ml熱處理的氯四環(huán)素的3ml液體LB中培養(yǎng)20小時(shí)，稀釋10_6后，涂布LB平板。隨機(jī)挑選25個(gè)克隆同時(shí)劃線至含30 μ g/ml卡那霉 素和不含抗生素的LB固體平板進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果顯示所有的克隆均沒(méi)有卡那霉素抗性，這表明卡那霉素抗性基因區(qū)域已失去。任意挑取5個(gè)沒(méi)有抗性的克隆，以R1175和R1176為引物菌落PCR，擴(kuò)增均擴(kuò)增得到349bp。MG1655原株和一個(gè)變株的擴(kuò)增結(jié)果分別為圖2中的第6和第8泳道。分別以Rl 175對(duì)MG1655原株和一個(gè)變株的Rl 175和Rl 176擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序圖譜見(jiàn)圖4的上半部分和下半部分?？梢?jiàn)在測(cè)序圖譜中，在MG1655原株測(cè)序圖譜的第131-134位置處(即nanA基因開(kāi)放閱讀框的第574-576堿基)為GAA，而nanA點(diǎn)突變變株測(cè)序圖譜的第131-134位置處(即nanA基因開(kāi)放閱讀框的第574-576堿基)為AAC，表明實(shí)現(xiàn)了 GAA突變?yōu)锳AC，即點(diǎn)突變完成。
權(quán)利要求
1.一種基于重組工程的大腸桿菌基因組點(diǎn)突變的方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)通過(guò)重疊一延伸聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得一個(gè)DNA修飾片段，所述DNA修飾片段依次由下列結(jié)構(gòu)組成與基因組上位點(diǎn)待突變靶位點(diǎn)上游50bp序列一致的左端50bp同源臂、突變位點(diǎn)、與靶位點(diǎn)下游30bp序列一致的30bp同源片段、兩側(cè)為兩個(gè)歸巢核酸酶I-SceI酶切位點(diǎn)的卡那霉素抗性基因和與靶位點(diǎn)下游50bp序列一致的右端50bp同源臂所組成； (2)將含重組酶基因和I-SceI基因的質(zhì)粒PLS134轉(zhuǎn)化至大腸桿菌MG1655中；所述的質(zhì)粒PLS134是將PCR擴(kuò)增的tetR-ptetA-1-SceI基因盒片段以NsiI酶切后，克隆至pBAD322的NsiI位點(diǎn)，得到重組克隆pLS133 ;再將exo，bet和gam三個(gè)重組酶基因從lambda噬菌體DNA中PCR擴(kuò)增后，以NcoI和XhoI酶切后，克隆至pLS133的NcoI和SaII位點(diǎn)，得到目的質(zhì)粒pLS134 ； (3)將步驟(I)得到的DNA修飾片段電轉(zhuǎn)化至以終濃度為O.15%的L-阿拉伯糖誘導(dǎo)下表達(dá)Red重組酶基因的步驟(2)的大腸桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)重組酶介導(dǎo)的同源臂和大腸桿菌基因組上相同序列之間的同源重組，將所述DNA修飾片段中，左右50bp同源臂之間的片段整合至大腸桿菌基因組，在卡那霉素抗性篩選之下，獲得整合有突變位點(diǎn)、30bp同源片段和兩側(cè)為I-SceI酶切位點(diǎn)的卡那霉素抗性基因的卡那霉素抗性突變株； (4)將步驟(3)得到的菌株在含終濃度為20μg/ml熱處理的氯四環(huán)素的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，熱失活的氯四環(huán)素誘導(dǎo)I-SceI酶的表達(dá)，I-SceI酶作用于整合在基因組上的I-SceI酶切位點(diǎn)，基因組發(fā)生雙鏈斷裂，促使菌株利用自身的重組功能催化30bp同源片段與靶位點(diǎn)下游30bp之間發(fā)生同源重組，從而將30bp同源片段、兩個(gè)I-SceI酶切位點(diǎn)及卡那霉素抗性基因消除，最終獲得發(fā)生點(diǎn)突變的大腸桿菌突變株。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所待突變位點(diǎn)和突變位點(diǎn)是一個(gè)或多個(gè)堿基。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，首先通過(guò)一個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)得到含左側(cè)50bp同源臂、突變位點(diǎn)、30bp同源片段、一個(gè)I-SceI酶切位點(diǎn)和5’端卡那霉素抗性基因的DNA片段，再通過(guò)另外一個(gè)PCR反應(yīng)得到3’端卡那霉素抗性基因、一個(gè)I-SceI酶切位點(diǎn)和右側(cè)50bp同源臂的DNA片段，在5’端卡那霉素抗性基因和3’端卡那霉素抗性基因之間含21bp的重疊序列；隨后通過(guò)重疊一延伸聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得兩側(cè)為50bp同源臂的含突變位點(diǎn)、30bp同源片段以及兩側(cè)為I-SceI酶切位點(diǎn)的卡那霉素抗性基因的融合DNA修飾片段。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，同源臂用于通過(guò)重組酶催化的同源重組將含突變位點(diǎn)的DNA修飾片段整合至大腸桿菌的基因組；右側(cè)的50bp同源臂為靶位點(diǎn)下游的50bp序列，此50bp序列的前30bp為同源片段；30bp同源片段用于同源重組以去除一段30bp序列、兩個(gè)I-SceI酶切位點(diǎn)及卡那霉素抗性基因的冗余序列，所得變株的基因組不含突變位點(diǎn)外任何序列。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，重組酶基因是來(lái)自于lambda噬菌體的exo，bet和gam基因，重組酶基因是克隆在受L-阿拉伯糖所誘導(dǎo)啟動(dòng)子之下；I-SceI基因克隆在受熱處理的氯四環(huán)素誘導(dǎo)的啟動(dòng)子之下。含重組酶基因和I-SceI基因的質(zhì)粒pLS134游離于大腸桿菌MG1655的基因組。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于重組工程的大腸桿菌基因組點(diǎn)突變的方法。本方法是先通過(guò)重疊－延伸聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得一個(gè)兩端為與靶位點(diǎn)兩側(cè)序列一致的各50bp同源臂，中間為突變位點(diǎn)、與靶位點(diǎn)下游序列一致的30bp同源片段、兩側(cè)為兩個(gè)歸巢核酸酶I-SceI酶切位點(diǎn)的卡那霉素抗性基因的修飾片段；然后將50bp同源臂之間的片段整合至大腸桿菌基因組，突變位點(diǎn)取代基因組上的靶位點(diǎn)，獲得卡那霉素抗性突變株。隨后熱失活的氯四環(huán)素誘導(dǎo)I-SceI酶的表達(dá)，催化30bp同源片段與靶位點(diǎn)下游30bp之間發(fā)生同源重組，從而將30bp同源片段、兩個(gè)I-SceI酶切位點(diǎn)及卡那霉素抗性基因消除，獲得發(fā)生點(diǎn)突變的大腸桿菌突變株。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102703424SQ20121020321
公開(kāi)日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月19日
發(fā)明者尚廣東, 張飛飛, 石牡丹, 蔣伏歡 申請(qǐng)人:南京師范大學(xué)