專利名稱：一種柑橘的綠色組織特異啟動子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種柑橘緑色組織特異啟動子，尤其涉及綠色組織特異表達(dá)。
背景技術(shù)：
在轉(zhuǎn)基因研究中，啟動子是決定外源基因在轉(zhuǎn)基因植株表達(dá)的關(guān)鍵性元件。目前，轉(zhuǎn)基因研究中主要使用組成型啟動子。組成型啟動子驅(qū)動外源基因持續(xù)恒定在各個組織表達(dá)，造成植株物質(zhì)和能量的浪費(fèi)，產(chǎn)生了大量的異源蛋白質(zhì)或代謝產(chǎn)物并在植株體內(nèi)積累，打破了植株原有的代謝平衡；在可食用部分表達(dá)外源基因，還會帶來轉(zhuǎn)基因食品安全問題
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種柑橘的緑色組織特異啟動子，使用該柑橘緑色組織特異啟動子驅(qū)動外源基因只在綠色組織表達(dá)，而不是在全株表達(dá)，能避免過度消耗養(yǎng)分和能量，將其運(yùn)用于以種子、果實(shí)為主要收獲產(chǎn)物的作物中，讓抗除草剤、抗蟲等外源基因只在莖、葉等緑色部分表達(dá)而不在成熟的種子、果實(shí)等器官中表達(dá)，以提高轉(zhuǎn)基因作物的生物安全性。本發(fā)明之柑橘的綠色組織特異啟動子的序列為SEQ ID NO. I
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AC AA C TC T6ATC ATTG+TA A A 所述啟動子序列包含5個與組織特異表達(dá)相關(guān)的順勢作用元件GATA-box ;GATA-box使用方框標(biāo)注，TATA-box使用下劃線標(biāo)注，CAAT-box使用波浪線標(biāo)注。序列全長708bp。該啟動子在控制組織特異性表達(dá)的元件GATA-box以及其他順勢作用元件的調(diào)控下驅(qū)動外源基因在緑色組織特異表達(dá)，在其他組織不表達(dá)。使用本發(fā)明之柑橘綠色組織特異啟動子驅(qū)動外源基因只在綠色組織表達(dá)，而不是在全株表達(dá)，能避免過度消耗養(yǎng)分和能量，將其運(yùn)用于以種子、果實(shí)為主要收獲產(chǎn)物的作物中，讓抗除草剤、抗蟲等外源基因只在莖葉等緑色部分表達(dá)而不在成熟的種子、果實(shí)等器官中表達(dá)，以提高轉(zhuǎn)基因作物的生物安全性。
圖I為本發(fā)明帶有柑橘緑色組織特異啟動子序列表達(dá)載體的構(gòu)建示意 圖2為本發(fā)明實(shí)施例PBI121表達(dá)載體示意圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)ー步詳細(xì)說明。本實(shí)施例利用SEQ ID NO. I所示的綠色組織特異啟動子構(gòu)建表達(dá)載體，以PBI121質(zhì)粒(帶有組成型啟動子35S)為對照，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法分別轉(zhuǎn)化番茄。
本實(shí)施例具體包括以下步驟
(1)表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)SEQID NO. I和PBI 121載體序列設(shè)計帶有酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基的特異引物F :5 ' - TAAAGCTTTCATGACGACG -3 '和R :5 '-CGTCTAGATTTACAATGATCAGAG -3'，酶切位點(diǎn)分別為Hind III和Xba I;以糖橙基因組DN A為模板，P C R擴(kuò)增得到SEQ ID NO. 1，將P C R產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳純化回收，將回收產(chǎn)物連接到PGM-T easy載體，熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a并檢測，經(jīng)鑒定呈陽性的克隆測序驗(yàn)證；分別將獲得的正確陽性克隆菌和含PBI121質(zhì)粒的大腸桿菌接種到含有50mg/lAmp和50mg/lkan的LB液體培養(yǎng)基，37°C，180r/min,培養(yǎng)12h，分別提取質(zhì)粒；將獲得的兩種質(zhì)粒分別利用Hind III和Xba I雙酶切，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，含有綠色組織啟動子序列的質(zhì)?；厥招∑?，PBI121質(zhì)?；厥沾笃?。利用D N A連接酶將上述兩個片段連接，熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a并檢測，經(jīng)鑒定呈陽性的克隆測序驗(yàn)證；
(2)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化番茄制備農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)，從YEB平板上挑取農(nóng)桿菌EHA105單菌落，接種于含利福平25 mg/1的YEB液體培養(yǎng)基中，28で，220 rpm搖菌12h;取上述培養(yǎng)物O. 5 ml加入到50 ml含利福平25 mg/1的YEB液體培養(yǎng)基中，28で，280 rpm 搖4 h，使其0D_達(dá)到O. 5。將菌液冰浴30 min，然后在4で、6 000 rpm離心10 min，收集菌體，加入10 ml預(yù)冷的O. 15 mol/1 NaCl懸浮細(xì)胞。4 °C,6 000 rpm離心10 min ;棄上清，加I ml預(yù)冷的20 mmol/1 CaCl2重懸細(xì)胞，分裝于離心管中，一 70で保存?zhèn)溆?；取?gòu)建的表達(dá)載體質(zhì)粒和PBI 121質(zhì)粒各I μ 1(0. 5 I μ g)分別加入到100 μ I的EHA105感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈混勻，冰浴30 min;液氮中速凍I min，37で溫育3 5 min，融化細(xì)胞，カロ入Iml含50 mg/1 Kan的YEB液體培養(yǎng)基，28 V，125 rpm搖2 3 h ;收集菌體涂布于含50 mg/1 Kan的YEB平板28で培養(yǎng)2天；挑取單菌落，PCR鑒定，將陽性克隆保存于_70°C 備用；無菌苗的培養(yǎng)，番茄種子用75%酒精消毒30seC，接著在10%的次氯酸鈉溶液消毒30min，期間每隔5min搖動ー下，滅菌蒸餾水沖洗5次，接種于1/2 MS培養(yǎng)基；25°C黑暗條件下培養(yǎng)至發(fā)芽，轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)室，幼苗生長條件為25°C、16h光照/8h黑暗，光照強(qiáng)度1800Ix ;外植體準(zhǔn)備和農(nóng)桿菌培養(yǎng)，種子發(fā)芽后7d，將無菌苗的子葉和下胚軸用刀切下(葉帶有一小段葉柄，下胚軸約2cm)，置入預(yù)培養(yǎng)基中培養(yǎng)Id ;取轉(zhuǎn)入表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，活化，挑單菌落，于液體培養(yǎng)基(YEB培養(yǎng)基+ 100 mg/1 Kan)中，28で振蕩20 25 h，待菌液達(dá)到菌對數(shù)生長期(OD_ ^ O. 6)吋，5 000 rpm離心10 min，除去上清液，再用重懸培養(yǎng)基懸浮OD6cI. O即可用于侵染；轉(zhuǎn)化再生，將所述在預(yù)培養(yǎng)基中培養(yǎng)Id的材料浸入到準(zhǔn)備好的農(nóng)桿菌重懸液中浸泡30min,用無菌濾紙吸掉莖段上多余的菌液,轉(zhuǎn)入ー選培養(yǎng)基培養(yǎng)，轉(zhuǎn)移到一選 培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，26°C，光/暗周期16 h / 8h條件下，約14d，轉(zhuǎn)移到ニ選培養(yǎng)基，每2周繼代一次。再生芽生根、移栽，待再生芽長至Icm左右時，將芽切下，放入生根培養(yǎng)基中生根。2周后對生根良好、長至5cm左右的轉(zhuǎn)化苗進(jìn)行煉苗，移栽至一次性塑料杯中，成活后移栽至花盆中。通過化學(xué)組織染色分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)入帶有綠色組織特異啟動子表達(dá)載體番茄的葉和未成熟呈綠色的果實(shí)中能檢測到GUS基因，在花和成熟呈紅色的果實(shí)中則檢測不到。轉(zhuǎn)入PBI121表達(dá)載體的番茄在葉、花、未成熟呈綠色的果實(shí)和成熟呈紅色的果實(shí)中均能檢測到GUS基因。以上說明該啟動子為綠色組織特異啟動子。
權(quán)利要求
1.一種柑橘的緑色組織特異啟動子，其特征在于，所述啟動子具有SEQ ID NO. I所示的序列。
全文摘要
一種柑橘的綠色組織特異啟動子，其具有SEQIDNO.1所示的序列。使用本發(fā)明之柑橘綠色組織特異啟動子驅(qū)動外源基因只在綠色組織表達(dá)，而不是在全株表達(dá)，能避免過度消耗養(yǎng)分和能量，將其運(yùn)用于以種子、果實(shí)為主要收獲產(chǎn)物的作物中，讓抗除草劑、抗蟲等外源基因只在莖葉等綠色部分表達(dá)而不在成熟的種子、果實(shí)等器官中表達(dá)，以提高轉(zhuǎn)基因作物的生物安全性。
文檔編號C12N15/113GK102676530SQ20121020283
公開日2012年9月19日 申請日期2012年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月19日
發(fā)明者戴素明, 李榮華, 鄧子牛, 陶堅, 龍桂友 申請人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)