專利名稱：一種豬流感病毒毒株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物病毒領(lǐng)域，涉及病毒新毒種，具體涉及ー種豬流感病毒毒株及其生物學(xué)特性。
背景技術(shù)：
2010年10月，漯河市某豬場(chǎng)豬群7頭I月齡豬只先后發(fā)病，其中一頭小豬在發(fā)病兩天后死亡，發(fā)病豬臨床癥狀為流鼻涕，發(fā)燒和咳嗽。采集發(fā)病豬的鼻拭子，并立即保存于含抗生素的DMEM培養(yǎng)液中，置于冰盒中并在24h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室。鼻拭子進(jìn)行漩渦震蕩高速離心處理，取上清接種10日齡雞胚尿囊腔接種。結(jié)果分離到ー株有血凝性的疑似流感病毒，經(jīng)分子鑒定后確定其為H1N2豬流感病毒。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明本發(fā)明的目的是提供ー種豬流感病毒毒株，分類命名豬流感病毒，拉丁文學(xué)名swine influenza virus,簡(jiǎn)稱SIV,保藏單位中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏單位簡(jiǎn)稱CCTCC，保藏單位地址武漢市武漢大學(xué)，保藏日期2012年5月15日，保藏編號(hào)CCTCCNO V201223o本發(fā)明的技術(shù)方案是ー種豬流感病毒毒株，豬流感病毒(swine influenzavirus), CCTCC NO :V201223。所述的豬流感病毒毒株具有下述特點(diǎn)
(1)所述毒株的核酸類型是單股負(fù)鏈RNA病毒，由大小不等的8個(gè)獨(dú)立節(jié)段組成，分別是PB2 基因片段長(zhǎng)度為 2341 bp，PBl 為 2341 bp，PA 為 2233 bp，HA 為 1777 bp，NP 為 1565bp, NA 為 1466 bp, M 為 1027 bp, NS 為 890 bp。
(2)所述毒株對(duì)脂溶劑こ醚、氯仿和酸敏感；屬于熱穩(wěn)定型毒株；血凝譜較廣，能凝集雞、豬、豚鼠、兔、小鼠、綿羊和牛的紅細(xì)胞。(3)對(duì)雞胚的致病カ較弱，其中EID5tl為10_5 86 ,ELD50為10_2 43 ;能夠感染MDCK細(xì)胞，造成細(xì)胞拉網(wǎng)脫落等病變；小鼠感染試驗(yàn)中未觀察到明顯臨床癥狀，感染后14天能從小鼠血液中檢測(cè)到抗體。(4)利用通用引物對(duì)所述毒株進(jìn)行PCR鑒定后，再進(jìn)行全基因組PCR擴(kuò)增并克隆測(cè)序，用philip3. 64分析軟件結(jié)果顯示該毒株為新型四源重組病毒，其中HA、NP和NS片段來(lái)源于經(jīng)典豬流感；NA和PBl片段來(lái)源于類人H3N2流感病毒；PB2推測(cè)來(lái)源于美洲禽流感；M基因來(lái)源于歐洲禽流感。所述的豬流感病毒毒株在制備疫苗的生產(chǎn)毒種中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明的H1N2豬流感病毒滅活后免疫豬只，可以給豬提供有效的的保護(hù)，可應(yīng)用在制備疫苗的生產(chǎn)毒種。
圖I為SIV通用引物電泳 圖2為亞型引物PCR產(chǎn)物電泳圖；M :DNA質(zhì)量分子標(biāo)準(zhǔn)；1-3 :SIV通用引物RT-PCR陽(yáng)性樣品；P :陽(yáng)性對(duì)照；N :陰性對(duì)照
圖3為SIV全基因組PCR產(chǎn)物電泳圖；Mark :DNA質(zhì)量分子標(biāo)準(zhǔn)；1_8 :PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS基因片段。
具體實(shí)施例方式2010年10月，漯河市某豬場(chǎng)7頭I月齡豬只發(fā)病，其中一頭小豬在發(fā)病兩天后死亡，發(fā)病豬臨床癥狀為流鼻涕，發(fā)燒和咳嗽，其發(fā)病表現(xiàn)與國(guó)內(nèi)報(bào)道的其他地區(qū)發(fā)病的豬流感癥狀大致相似，初歩判斷為豬流感。
采集發(fā)病豬的鼻拭子，并立即保存于含抗生素的DMEM培養(yǎng)液中，置于冰盒中并在24 h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室。鼻拭子進(jìn)行漩渦震蕩高速離心處理，取上清接種10日齡雞胚尿囊腔接種。結(jié)果分離到ー株有血凝性的疑似流感病毒，血凝試驗(yàn)排除雞新城疫和禽減蛋綜合征病毒。第3代尿囊液進(jìn)行有限稀釋克隆后其最高血凝價(jià)71og2 ;用特異性引物進(jìn)行分子鑒定后確定其為H1N2豬流感病毒。理化特性試驗(yàn)表明所述毒株經(jīng)過(guò)氯仿、こ醚和酸處理后，不能再感染雞胚，判斷其對(duì)脂溶劑敏感。病毒屬于熱穩(wěn)定型毒株；血凝譜較廣，能凝集雞、豬、豚鼠、兔、小鼠、綿羊和牛的紅細(xì)胞。該病毒對(duì)雞胚的致病カ較弱，其中EID5tl為10_5 86 ,ELD50為10_2 43 ;能夠感染MDCK細(xì)胞，造成細(xì)胞拉網(wǎng)脫落等病變；小鼠未觀察到明顯臨床癥狀，感染后14天能從小鼠血液中檢測(cè)到抗體。對(duì)所述毒株進(jìn)行全基因組PCR擴(kuò)增并克隆測(cè)序，用philip3. 64分析軟件結(jié)果顯示該毒株為新型四源重組病毒，其中HA、NP和NS片段來(lái)源于經(jīng)典豬流感；NA和PBl片段來(lái)源于類人H3N2流感病毒；PB2推測(cè)來(lái)源于美洲禽流感；M基因來(lái)源于歐洲禽流感。本發(fā)明中，毒株定名為A/swine/Henan/YIL/2010 (H1N2)株，簡(jiǎn)稱 SWHN/HL/10 株。I、流行病學(xué)調(diào)查2010年10月，漯河市某豬場(chǎng)7頭I月齡豬只先后發(fā)病，其中一頭小豬在發(fā)病兩天后死亡，發(fā)病豬臨床癥狀為高燒，流鼻涕，咳嗽，呼吸困難，并且具有傳染性，其發(fā)病表現(xiàn)與國(guó)內(nèi)外報(bào)道的其他地區(qū)發(fā)病的豬流感癥狀大致相似，初歩判斷為豬流感。采集患病豬的鼻拭子和病死豬的肺臟樣品，將樣品立即保存于含抗生素的DMEM培養(yǎng)液中，置于冰盒中并在24 h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室。2、病毒分尚將鼻拭子樣品潤(rùn)旋震蕩處理15秒,擠出液體,4 °C 5000 r/min尚心4 min，取上清，4°C作用過(guò)夜。采集病死豬的肺組織在無(wú)菌條件下剪碎并研磨，用PBS液(含鏈霉素和青霉素終濃度為3000 u g /mL，3000 IU/ mL)制成10%的勻漿，4で作用5 h，反復(fù)凍融3次，按上述條件離心，取上清。將上清經(jīng)尿囊腔接種擴(kuò)10日齡非免疫雞胚，0.2 mL/枚，每個(gè)樣品接種2枚，35 °C條件下孵育96 h,并保持一定的濕度，每隔8 h照胚，棄去24h內(nèi)死亡雞胚。收集24 96 h死亡和未死亡雞胚置4で冷卻過(guò)夜，次日無(wú)菌收集尿囊液。結(jié)果表明無(wú)菌檢驗(yàn)合格的病料接種雞胚后，96 h內(nèi)無(wú)雞胚死亡發(fā)生，對(duì)照組雞胚也全部健活。經(jīng)過(guò)3代雞胚盲傳以后，發(fā)現(xiàn)所收獲尿囊液具有血凝性，并且均與抗ND和EDS-76陽(yáng)性血清HI試驗(yàn)為陰性，第3代尿囊液進(jìn)行具有血凝活性的尿囊液接種的雞胚均表現(xiàn)出不同程度的全身出血變化，死亡胚與存活胚病變顯著，胚胎發(fā)育阻滯，胚體頭頸部、背部、大腿、翅膀及腹部出血明顯，嚴(yán)重者呈彌漫性出血。第3代尿囊液進(jìn)行有限稀釋克隆后其最高血凝價(jià)71og2。3、病毒PCR鑒定通用引物是根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的豬流感病毒的NP基因核苷酸序列用Clustal、DNAstar等生物軟件進(jìn)行同源性分析后，選出較為保守的核苷酸區(qū)域，應(yīng)用Primer 5. 0設(shè)計(jì)特異性引物根據(jù)NP基因設(shè)計(jì)合成，亞型引物參照Choi等設(shè)計(jì)的亞型引物合成。參照Invitrogen Trizol LS Reagent的說(shuō)明進(jìn)行,具體操作步驟如下取新鮮的病毒樣品250 U L加入裝有750 V- L Trizol的I. 5 mL RNase-free離心管中混合均勻，室溫靜置5min ;加入200 U L氯仿，渦旋混勻15 S，室溫靜置5 min ；4°C 12, 000 g/min離心15min,轉(zhuǎn)移上相至新管中，加入等體積異丙醇(約500 ii L),輕緩混勻，室溫放置15 min, 4 V12，000g/min離心10 min,棄上清,RNA在管側(cè)和管底形成膠狀沉淀；加入I mL RNase-free 75%こ醇，溫和顛倒混勻，4 V 7，500g/min離心5 min，棄上清，將離心管置于超凈臺(tái)風(fēng)干，加入20 UL DEPC處理過(guò)的雙蒸水溶解，最后分裝成小管，可置-70で保存?zhèn)溆谩T反應(yīng)體系按Takara公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。各成分加入后混勻離心，42で保溫I h，70で保溫15 min后冰上冷卻備用。PCR反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一種豬流感病毒毒株，其特征在于豬流感病毒(swine influenza virus), CCTCCNO V201223o
2.如權(quán)利要求I所述的豬流感病毒毒株在制備疫苗的生產(chǎn)毒種中的應(yīng)用。
全文摘要
發(fā)明公開(kāi)了一種豬流感病毒毒株，豬流感病毒(swineinfluenzavirus)，CCTCC NOV201223。本發(fā)明的豬流感病毒滅活后免疫豬只，可以給豬提供有效的保護(hù)，可應(yīng)用在制備疫苗的生產(chǎn)毒種。
文檔編號(hào)C12R1/93GK102766604SQ20121020282
公開(kāi)日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2012年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月19日
發(fā)明者寧長(zhǎng)申, 岳耀輝, 張?jiān)? 張龍現(xiàn), 胡慧, 菅復(fù)春 申請(qǐng)人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)