一種生產輔酶q10工程菌的構建方法、工程菌及其應用的制作方法

一種生產輔酶q10工程菌的構建方法、工程菌及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及生物【技術領域】，公開了一種生產輔酶Q10工程菌的構建方法、工程菌及其應用，該菌為類球紅細菌，拉丁文學名為Rhodobacter?sphaeroides；命名為NHU-ZDD菌株；保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏時間：2012年4月13日；保藏編號：CGMCC?No.5998。本發明提供一種通過對EMP途徑相關代謝途徑的改造，提高輔酶Q10產量的方法，能將輔酶Q10的合成能力提高約30%，適合輔酶Q10的大規模工業化生產。
【專利說明】一種生產輔酶Q10工程菌的構建方法、工程菌及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，尤其涉及一種生產輔酶QlO工程菌的構建方法、工程菌及其應用。
【背景技術】
[0002]輔酶Q是生物體內廣泛存在的脂溶性醌類化合物，不同來源的輔酶Q其側鏈異戊烯單位的數目不同，人類和哺乳動物是10個異戊烯單位，故稱輔酶Q10。
[0003]輔酶QlO是生物細胞呼吸鏈中的重要遞氫體，是一種良好的生化藥物，近年來已廣泛應用于各類心臟病、糖尿病、癌癥、急慢性肝炎、帕金森癥等疾病的治療。此外，在治療壞血病、十二指腸潰瘍、壞死性牙周炎以及促進胰腺功能和分泌等方面也有顯著效果。最近，研究者發現CoQlO具有抗衰老作用，從而將其應用擴展到化妝品和保健品領域，使其在國內外的需求進一步擴大。
[0004]輔酶QlO的制備方法主要有三種，即動植物組織提取法、化學合成法和微生物發酵法。動植物組織提取法中動植物輔酶QlO含量低，而且各種化學成份復雜，并受原料和來源限制，因此產品成本高，價格昂貴，規模化生產受到了一定限制。化學合成法技術上比較成熟，主要是以來源較豐富的茄尼醇為原料合成的，但其產物為順反異構體的混合物，生物活性低，合成生物活性高的CoQlO尚未達到工業化生產的程度。微生物發酵法合成的輔酶QlO成本低、無光學異構體，生物學活性高，大規模生產應用效果好。
[0005]常用的微生物包括紅螺菌，土壤桿菌，類球紅細菌，根瘤菌等。其中類球紅細菌培養簡單，是輔酶QlO高效的生產菌之一。輔酶QlO分子結構由兩部分組成:醌環部分和異戊二烯側鏈部分。醌環骨架由分支酸途徑合成，前體是對羥基苯甲酸。側鏈由異戊二烯途徑合成，側鏈的長短決定了輔酶Q的種類的不同。在類球紅細菌中，異戊二烯焦磷酸異構體二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)與9分子異戊二烯焦磷酸(IPP)依次在櫳牛兒基櫳牛兒基焦磷酸合成酶及聚十異戊二烯焦磷酸合酶的催化下生成聚十異戊二烯焦磷酸。十異戊二烯焦磷酸和對羥基苯甲酸縮合形成輔酶QlO的前體物，該前體物苯環經修飾之后形成目標產物輔酶Q10。在微生物中，合成IPP主要有兩條途徑，分別是真核生物的甲羥戊酸途徑(MVP)和原核生物中的非甲羥戊酸途徑(MEP)。在類球紅細菌中，IPP由MEP途徑合成。
[0006]目前國內相關研究主要集中在多基因表達強化大腸桿菌上。尚無專利有關于通過基因過表達強化類球紅細菌輔酶QlO的合成能力。

【發明內容】

[0007]本發明針對微生物發酵法生產輔酶QlO產量較低且生產成本較高等缺點，提供了一種能顯著提高輔酶QlO產量的生產輔酶QlO工程菌及其構建與應用方法。通過引用該方法，可以極大提高應用微生物發酵法生產輔酶QlO的產量，降低了輔酶QlO的生產成本。
[0008]為了解決上述技術問題，本發明提供了以下技術方案:
[0009]一種生產輔酶QlO的工程菌的構建方法，具體步驟如下:[0010]a.從類球紅細菌中提取基因組DNA ;
[0011]b.用聚合酶鏈式反應擴增出DXS和DDS的同源基因；
[0012]c.用擴增出的同源基因與廣宿主質粒連接，構建重組載體；
[0013]d.重組載體轉化至大腸桿菌S17-1中；
[0014]e.將S17-1與所述類球紅細菌接合轉移，即得敲除了基因DXS和DDS的工程菌。
[0015]作為優選，所述的DXS基因的核苷酸序列為SEQ ID N0.1所示，所述的DDS基因的核苷酸序列為SEQ ID N0.2所示。
[0016]作為優選，所述廣宿主質粒為克隆載體pBBRlMCS-2，所述質粒的啟動子為tac啟動子。
[0017]一株利用上述構建方法得到的用于生產輔酶QlO的工程菌，該菌為類球紅細菌，拉丁文學名為Rhodobacter sphaeroides ;命名為NHU-ZDD菌株；保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏時間:2012年4月13日；保藏編號=CGMCCN0.5998。
[0018]應用上述工程菌生產輔酶QlO的方法，具體步驟如下:
[0019]f.挑取NHU-ZDD菌株單克隆接種于含IOmL種子培養基的50mL搖瓶中，轉速為200rpm，在26-34°C培養23h，獲得一級種子；
[0020]g.將一級種子按1%的比例轉接至含20mL種子培養基的50mL搖瓶中，在26_34°C，200rpm的條件下培養23h，獲得二級種子；
[0021]h.將二級種子以1%的比例接種至含IOOmL發酵培養基的500mL中，在26_34°C，200rpm的條件下培養72h后，添加異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，誘導表達48h ；收集菌液；可通過常規方法提取輔酶Q10。
[0022]作為優選，所述的種子培養基每IOOmL中含有:(NH4)2SO40.25g，玉米漿0.05g，酵母提取物 0.14g，NaCl 0.2g，葡萄糖 0.3g，K2HPO40.05g, KH2PO4 0.05g, MgSO4 0.lg, FeSO40.01gjCoCl2 0.003g，MnSO40.0OOlg，CaCO30.8g，維生素 ΒΙΟ.1 μ g，維生素 K 0.1 μ g，維生素A0.15 μ g ;ρΗ 調節為 7.2。
[0023]作為優選，所述的發酵培養基每IOOmL種含有:(NH4)2SO40.3g，NaCl 0.28g，葡萄糖 4g，KH2PO4 0.15g，味精 0.3g，MgSO4 0.63g，玉米漿 0.4g，FeSO4 0.12g，CoCl2 0.005g，CaCO3 0.6g，維生素 B10.1 μ g,維生素 K 0.1 μ g,維生素 A 0.15 μ g ；ρΗ 調節為 7.2。
[0024]作為優選，所述異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的濃度為0.0Ol-lOmM。
[0025]所述類球紅細菌從河邊污泥中分離得到；大腸桿菌S17-1購自美國模式培養物集存庫，編號ATCC47055。
[0026]本發明由于采用了以上技術方案，具有以下顯著的技術效果:
[0027]本發明通過選擇MEP途徑中的關鍵酶DXS、DDS的過表達，完成對EMP途徑相關代謝途徑的改造。經過上述改造生產的工程菌，具有較高的輔酶QlO合成能力，相比現有用于生產輔酶QlO的類球紅細菌或類似菌種，該工程菌具有更高的輔酶QlO生產能力。將該工程菌應用于輔酶QlO的微生物發酵法生產，能夠在不改變原有的生產過程，工藝步驟，培養條件的情況下，使微生物發酵法生產輔酶QlO的生產能力在原有基礎上提高達30%，具有較高的應用價值和工業實用性。
[0028]保藏信息[0029]保藏名稱:類球紅細菌，拉丁文學名為Rhodobacter sphaeroides ;命名為NHU-ZDD菌株；
[0030]保藏時間:2012年4月13日；
[0031]保藏編號:CGMCCN0.5998 ；
[0032]保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
【具體實施方式】
[0033]下面結合具體實施例對本發明作進一步詳細描述:
[0034]實施例1生產輔酶QlO的工程菌的構建方法
[0035]一、重組質粒的構建
[0036]1.設計引物。用Primer5引物設計軟件設計引物序列。
[0037]克隆基因DXS，其中，
[0038]上游引物DXSF:
[0039]CATGCCATGGGCATGACCGACAGACCCTGCAC ；
[0040]下游引物DXSR: CGGGATCCCTCCTCCGGATCAGGCGCG ；
[0041]上游引物添加酶切位點Ncol，下游引物添加酶切位點BamHI。
[0042]克隆基因DDSF:
[0043]上游引物DDSF:
[0044]GAAGATCTGAGGAGACGGGATGGGATTGGACGAGGTT ；
[0045]下游引物DDSR:
[0046]CCCAAGCTTGAAAGGGATCAGGCGATGCG ；
[0047]在上游引物中包含酶切位點BglII和SD序列GAGGAGA，下游引物包含酶切位點
HindIII1
[0048]2.提取類球紅細菌基因組DNA (所用試劑均來自Biospin細菌基因組DNA提取試劑盒)
[0049]I)吸取0.5_4mL類球紅細菌(最多5父109個細菌)，13500印111離心I分鐘，盡可能
吸凈上清。
[0050]2)加入100 μ LEL Buffer,使用tip頭吹打均勻。
[0051]3) 37 °C溫育 40 分鐘。
[0052]4)加入 100 μ LRS Buffer,隨后加入 10 μ LPK Solution,充分混勻。
[0053]5)于56°C環境中溫浴15分鐘，然后移出。
[0054]6 )加 200 μ L GABuffer 并混合均勻。
[0055]7)于12000rpm離心I分鐘。將上清液轉移到一個新的1.5mL離心管。
[0056]8)加 400 μ L 的 BA Buffer,并混合均勻。
[0057]9)將混合液體轉移至Spin column。于1000Orpm離心I分鐘,并棄去接液管中液體。
[0058]10)向 Spin column 中加入 500 μ L 的 G Binding Buffer。于 1000Orpm 離心 30
秒，并棄去接液管中液體。
[0059]11)向 Spin column 中加入 500 μ L 的 Wash Buffer。于 1000Orpm 離心 30 秒，并棄去接液管中液體。
[0060]12)再向 Spin column 中加入 500 μ L 的 Wash Buffer。于 1000Orpm 離心 30 秒，并棄去接液管中液體。
[0061]13)再次將Spin column于1000Orpm離心I分鐘，并將Spin column轉移至一個新的1.5mL離心管。
[0062]14)向 Spin column 中加入 100 μ L Elution Buffer,并于室溫溫育 1 分鐘。
[0063]15)于12000rpm離心I分鐘,并棄去Spin column。1.5mL離心管中剩余液體即含
有基因組DNA。
[0064]3.進行PCR擴增DXS基因
[0065]用高保真酶PrimeSTAR(購自大連寶生物公司)擴增,采用標準反應體系:GC緩沖液25μL，水16μL，(dNTP混合液4 μL，上游引物DXSF 1.5μ L (10uM)，下游引物DXSR 1.5μ L(10uM)，所提取的基因組 DNA 1.5 μ L，PrimeSTAR 酶 0.5 μ L。
[0066]擴增程序為:30個循環，每個循環包含98 V變性10秒，60 V退火5秒，72 °C延伸2分鐘。
[0067]4.PCR產物和質粒進行酶切(所用試劑來自AxyPrep PCR清潔試劑盒)
[0068]將PCR產物取出，各加入150 μ L PCRA，然后均加入離心柱中，取一支空白離心柱加入 400 μ L 水，一起 13500rpm 離心1 分鐘，加入 BUFFER W2 700 μ L, 13500rpm 離心 I 分鐘，棄清液，再加入BUFFERW2 700 μ L，再13500rpm離心I分鐘。棄清液，再空離I分鐘，徹底甩干離心柱。加入34 μ L Eluent，然后取2支離心管。一支加入DXS34 μ L，另一只加入pBBRlMCS-234 μ LjNcoI 和 BamHI 各加入 1 μ L，加入 4μ L BUFFER。放入 37°C 水浴酶切 1.5小時。
[0069]5.電泳
[0070]1)制備1%瓊脂糖凝膠:稱取0.2g瓊脂糖置于錐形瓶中，加入20mL 1 X TAE,瓶口倒扣小燒杯。微波爐加熱煮沸3次至瓊脂糖全部融化，搖勻，即成1.0%瓊脂糖凝膠液。冷卻到65°C左右加入GelGreen染色劑3 μ L。
[0071]2)膠板制備:取電泳槽內的有機玻璃內槽(制膠槽)洗干凈，晾干，放入制膠玻璃板。取透明膠帶將玻璃板與內槽兩端邊緣封好，形成模子。將內槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。將冷卻到65°C左右的瓊脂糖凝膠液混勻小心地倒入內槽玻璃板上，使膠液緩慢展開，直到整個玻璃板表面形成均勻膠層。室溫下靜置直至凝膠完全凝固，垂直輕拔梳子，取下膠帶，將凝膠及內槽放入電泳槽中。添加IXTAE電泳緩沖液至沒過膠板l_2mm為止。
[0072]3)加樣:在點樣板上將第4步中酶切的PCR產物和質粒pBBRlMCS-2與上樣緩沖液混合，上樣緩沖液的最終稀釋倍數應不小于IX。用10 μ L微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內，每加完一個樣品，應更換一個加樣頭，以防污染，加樣時勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面。并加入10 μ L DNAmarker-D作為對照。
[0073]4)電泳:加樣后的凝膠板立即通電進行電泳，電壓100V，樣品由負極(黑色)向正極(紅色)方向移動，電壓升高，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍降低。當溴酚藍移動到距離膠板下沿約Icm處時，停止電泳。
[0074]5)電泳完畢后，取出凝膠，在紫外燈下觀察，顯示2kb處有明顯條帶。證實DXS的PCR擴增成功。[0075]6.割膠回收(所用試劑來自AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒)
[0076]I)割下對應條帶的膠。
[0077]2)將膠放入1.5mL離心管中，計算凝膠重量。(需提前記錄離心管重量)該重量作為一個凝膠體積(IOOmg=IOO μ L)。再加入3個凝膠體積的BUFF DE-A，混合后75°C加熱融化，約6-8分鐘，期間間斷混合。再加入0.5個BUFFER DE-A體積的BUFFER DE-B,混合均勻。
[0078]3)將混合液轉入DNA制備管。13500rpm離心I分鐘，棄濾液。加入500 μ L BUFFERffl, 13500rpm離心30秒，棄濾液。加700 μ LBUFFER W2, 13500rpm離心30秒，棄濾液。再加700 μ L BUFFER W2, 13500rpm離心I分鐘，棄濾液。然后再13500rpm離心I分鐘。將制備管置于潔凈的1.51^離心管中，在制備膜中央加入25 4 1^11^社，室溫靜置1分鐘，13500rpm離心I分鐘洗脫DNA。
[0079]7.T4連接酶連接，構建重組質粒
[0080]取割膠回收得到的DXS基因5.5 μ L，pBBRlMCS-2質粒3 μ L，T4連接酶(λ 5 μ L，T4連接酶BUFFER I μ L混合，22 °C水浴連接30分鐘。
[0081]8.PCR 擴增 DDS 基因
[0082]用高保真酶PrimeSTAR(購自大連寶生物公司)擴增,采用標準反應體系:GC緩沖液25 4 1^，水16 4 1^，(1見13混合液4 4 1^，上游引物005卩 1.5μ L (10uM)，下游引物 DDSR 1.5μ L(10uM)，所得基因組 DNA 1.5 μ L，PrimeSTAR 酶 0.5 μ L。
[0083]擴增程序為:30個循環，每個循環包含98°C變性10s，60 °C退火5s，72 °C延伸2min。
[0084]9.PCR產物和質粒進行酶切(所用試劑來自AxyPrep PCR清潔試劑盒)
[0085]將PCR產物取出，加入150 μ LPCRA，然后均加入離心柱中，取一支空白離心柱加入400 μ L水，一起13500rpm離心I分鐘，加入BUFFER W2700 μ L, 13500rpm離心I分鐘，棄清液，再加入Ι27(Κ)μ?，再13500rpm離心I分鐘。棄清液，再空離I分鐘，徹底甩干離心柱。加入34 μ L Eluent，然后取2支離心管。一支加入DDS 34 μ L，另一只加入已重組有DXS基因的口88町]\?^-234 4 1^重組載體，88111和出11(11111各加入BUFFER。放入37°C水浴酶切1.5小時。
[0086]10.電泳
[0087]I)制備1%瓊脂糖凝膠:稱取0.2g瓊脂糖置于錐形瓶中，加入20mL I X TAE,瓶口倒扣小燒杯。微波爐加熱煮沸3次至瓊脂糖全部融化，搖勻，即成1.0%瓊脂糖凝膠液。冷卻到65°C左右加入GelGreen染色劑3 μ L。
[0088]2)膠板制備:取電泳槽內的有機玻璃內槽(制膠槽)洗干凈，晾干，放入制膠玻璃板。取透明膠帶將玻璃板與內槽兩端邊緣封好，形成模子。將內槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。將冷卻到65°C左右的瓊脂糖凝膠液混勻小心地倒入內槽玻璃板上，使膠液緩慢展開，直到整個玻璃板表面形成均勻膠層。室溫下靜置直至凝膠完全凝固，垂直輕拔梳子，取下膠帶，將凝膠及內槽放入電泳槽中。添加IXTAE電泳緩沖液至沒過膠板l_2mm為止。
[0089]3)加樣:在點樣板上將第9步中酶切的PCR產物和pBBRlMCS-2質粒與上樣緩沖液混合，上樣緩沖液的最終稀釋倍數應不小于IX。用10 μ L微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內，每加完一個樣品，應更換一個加樣頭，以防污染，加樣時勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面。并加入10 μ L DNA marker-D作為對照。
[0090]4)電泳:加樣后的凝膠板立即通電進行電泳，電壓100V，樣品由負極(黑色)向正極(紅色)方向移動，電壓升高，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍降低。當溴酚藍移動到距離膠板下沿約Icm處時，停止電泳。
[0091]5)電泳完畢后，取出凝膠，在紫外燈下觀察，對比mark顯示Ikb處有明顯條帶。證實DDS的PCR擴增成功。
[0092]11.割膠回收(所用試劑來自AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒)
[0093]I)割下對應條帶的膠。
[0094]2)將膠放入1.5mL離心管中，計算凝膠重量。(需提前記錄離心管重量)該重量作為一個凝膠體積(IOOmg=IOO μ L)。再加入3個凝膠體積的BUFF DE-A，混合后75°C加熱融化，約6-8分鐘，期間間斷混合。再加入0.5個BUFFER DE-A體積的BUFFER DE-B,混合均勻。
[0095]3)將混合液轉入DNA制備管。13500rpm離心I分鐘，棄濾液。加入500 μ L BUFFERffl, 13500rpm離心30秒，棄濾液。加700 μ LBUFFER W2, 13500rpm離心30秒，棄濾液。再加700 μ L BUFFER W2, 13500rpm離`心I分鐘，棄濾液。然后再13500rpm離心I分鐘。將制備管置于潔凈的1.51^離心管中，在制備膜中央加入25 4 1^11^社，室溫靜置1分鐘，13500rpm離心I分鐘洗脫DNA。
[0096]12.T4連接酶連接，構建最終重組質粒
[0097]取割膠回收得到的DDS基因5.5yL，已重組DXS基因的pBBRlMCS-2重組質粒
3μ L，T4連接酶0.5 μ L，Τ4連接酶BUFFER I μ L混合，22°C水浴連接30分鐘。將擴增好的片段克隆至載體上DXS基因后面，獲得重組載體Ptac-DXS-DDS。基因DXS和基因DDS在同一個tac啟動子的控制下串聯表達。
[0098]二、重組質粒轉化到大腸桿菌S17-1
[0099]取出大腸桿菌S17-1感受態2管，冰浴10分鐘后加入重組載體Ptac_DXS_DDS。冰浴20分鐘，熱擊90秒，冰浴5分鐘，加入600 μ LLB培養基。37°C培養45分鐘后5000rpm離心5分鐘，棄300 μ L上清液，將剩余液體涂布到卡那平板上。
[0100]二、接合轉移
[0101]1.接種類球紅細菌。
[0102]2.第二天晚上接種已轉化大腸桿菌S17-1的陽性克隆。
[0103]3.第三天早上轉接大腸桿菌S17-1，每管5mL LB培養基加入100 μ L菌液，并加入5μ L卡那霉素，放入37°C搖床培養。培養3-4小時。
[0104]4.取4mL類球紅細菌菌液和2mL大腸桿菌菌液，分裝至2mL離心管中，每管lmL。
[0105]5.5000rpm 離心 5 分鐘。
[0106]6.各棄上清，加入ImL新鮮LB培養基，輕輕重懸菌體。
[0107]7.5000rpm 離心 5 分鐘。
[0108]8.各棄上清，加入ImL新鮮LB培養基，輕輕重懸菌體。
[0109]9.按類球紅細菌和大腸桿菌的比例為100 =10,100 =20,100 =50,100:100的比例混勻菌液。
[0110]10.將混合液澆注于濾膜中心區域。
[0111]11.將LB平板小心移至32°C培養箱中培養過夜。
[0112]12用鑷子將濾膜轉移至2mL離心管中。
[0113]13.用700 μ L LB液體培養基將濾膜上的菌體沖洗下來并吹散。
[0114]14.分裝涂布到含NK的平板培養基上，每板350 μ L菌液。放入32°C培養箱中培養72小時。
[0115]四、接合轉移完檢驗是否為陽性克隆
[0116]1.挑取2個生長良好的菌落培養30-48小時。
[0117]2.轉接后2~4小時提取質粒(所用試劑來自AxyPrep質粒DNA小量試劑盒)。
[0118]1)取2mL菌液加入離心管。13400rpm離心I分鐘，棄上清。再加入2mL菌液，13400rpm離心I分鐘，棄上清。
[0119]2)加入250yL Buffer SI懸浮細菌沉淀。不留小的菌塊。需確認S I中已加入
RNaseA0
[0120]3)加250 μ L Buffer S2，溫和并充分上下翻轉4_6次混合均勻使菌體充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步驟不宜超過5分鐘。BufferS2需盡量減少與空氣的接觸。
[0121]4)加350 μ L Buffer S3。溫和并充分的上下翻轉混合6-8次，13400rpm離心14分鐘。
[0122]5)取上清液轉至制備管，置于2mL離心管中，13400rpm離心I分鐘，棄上清。
[0123]6)加入 500 μ L Buffer Wl, 13400rpm 離心 I 分鐘，棄上清。
[0124]7)加 700 μ L Buffer W2，13400rpm 離心 I 分鐘，棄上清。再加 700 μ L Buffer W2,13400rpm離心I分鐘，棄上清。需確認Buffer W2已加入無水乙醇。
[0125]8)然后13400rpm空離I分鐘，將制備管移入新的1.5mL離心管中，加入80 μ L已預熱到65度的Eluent，室溫靜置I分鐘，13400rpm離心I分鐘。
[0126]3.酶切后進行電泳檢測。證實為陽性克隆。
[0127]其中，所述平板培養基(每IOOmL):酵母提取物0.8g，FeSO40.01g, K2HPO4 0.13g，CoCl2 0.003g,NaCl 0.2g,MnSO4 0.0OOlgjMgSO4 0.025g，葡萄糖 0.3g，維生素 Β10.1 μ g，維生素K 0.1 μ g，維生素A 0.15 μ g，瓊脂粉1.5g ；pH調節為7.2。
[0128]實施例2: IPTG誘導表達
[0129]一、挑取NHU-ZDD菌株單克隆接種于含IOmL種子培養基的50mL搖瓶中，轉速為200rpm，在30°C培養23h，獲得一級種子；
[0130]二、將一級種子按1%的比例轉接至含20mL種子培養基的50mL搖瓶中，在30°C，200rpm的條件下培養23h，獲得二級種子；
[0131]三、將二級種子以1%的比例接種至含IOOmL發酵培養基的500mL中，在30°C，200rpm的條件下培養72h后，添加IPTG至終濃度ImM，(也可選0.0OlmM或IOmM)誘導表達48h。收集菌液。并采用常規方法提取其中的輔酶Q10。
[0132]種子培養基每IOOmL中含有:(NH4)2SO40.25g，玉米漿0.05g,酵母提取物0.14g，NaCl 0.2g，葡萄糖 0.3g, K2HPO4 0.05g, KH2PO40.05g, MgSO4 0.lg, FeSO4 0.01g, CoCl20.003g，MnSO4 0.0OOlg, CaCO3 0.8g，維生素 B10.1 μ g，維生素 K 0.I μ g，維生素 A0.15μ g ;ρΗ 調節為 7.2。
[0133]發酵培養基每IOOmL 種含有:(NH4) 2S040.3g，NaCl 0.28g，葡萄糖 4g，KH2PO40.15g，味精 0.3g，MgSO4 0.63g，玉米漿 0.4g，FeSO40.12g，CoCl20.005g，CaCO30.6g，維生素BI0.1 μ g,維生素 K 0.I μ g，維生素 A 0.15 μ g ；ρΗ 調節為 7.2。
[0134]實驗例:HPLC檢測比較菌株改造前后同等培養條件下輔酶QlO產量的對比，見表I:
[0135]表1菌株改造前后輔酶QlO產量對比
[0136]
【權利要求】
1.一種生產輔酶QlO的工程菌的構建方法，其特征在于，具體步驟如下: a.從類球紅細菌中提取基因組DNA; b.用聚合酶鏈式反應擴增出DXS和DDS的同源基因； c.用擴增出的同源基因與廣宿主質粒連接，構建重組載體； d.重組載體轉化至大腸桿菌S17-1中； e.將大腸桿菌S17-1與類球紅細菌接合轉移，即得工程菌。
2.根據權利要求1所述的生產輔酶QlO的工程菌的構建方法，其特征在于:所述的DXS基因的核苷酸序列為SEQ ID N0.1所示；所述的DDS基因的核苷酸序列為SEQ ID N0.2所/Jn ο
3.根據權利要求1所述的生產輔酶QlO的工程菌的構建方法，其特征在于:所述的廣宿主質粒為克隆載體PBBR1MCS-2 ;所述質粒的啟動子為tac啟動子。
4.一株利用如權利要求1-3任一所述的構建方法得到的工程菌，其特征在于:該菌為類球紅細菌，拉丁文學名為/Sot/oAacier sphaeroides ;命名為NHU-ZDD菌株；保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏時間:2012年4月13日；保藏編號:CGMCC N0.5998。
5.利用如權利要求4所 述的工程菌生產輔酶QlO的方法，其特征在于，具體步驟如下: f.挑取NHU-ZDD菌株單克隆接種于含IOmL種子培養基的50mL搖瓶中，轉速為200rpm，在26-34°C培養23h，獲得一級種子； g.將一級種子按1%的比例轉接至含20mL種子培養基的50mL搖瓶中，在26-34°C，200rpm的條件下培養23h，獲得二級種子； h.將二級種子以1%的比例接種至含IOOmL發酵培養基的500mL中，在26-34°C，200rpm的條件下培養72h后,添加異丙基-β -D-硫代批喃半乳糖苷,誘導表達48h,收集菌液；并提取輔酶Q10。
6.利用如權利要求5所述的生產輔酶QlO的方法，其特征在于:所述的種子培養基每IOOmL中含有=(NH4)2SO4 0.25g，玉米漿0.05g，酵母提取物0.14g, NaCl 0.2g，葡萄糖 0.3g, K2HPO4 0.05g, KH2PO4 0.05g, MgSO4 0.lg, FeSO4 0.01g, CoCl2 0.003g, MnSO40.0OOlg, CaCO3 (λ 8g，維生素 BI (λ I μ g，維生素 K (λ I μ g，維生素 A 0.15yg;pH 調節為7.2。
7.利用如權利要求5所述的生產輔酶QlO的方法，其特征在于:所述的發酵培養基每IOOmL 中含有:(NH4)2SO4 0.3g，NaCl 0.28g，葡萄糖 4g，KH2PO4 0.15g，味精 0.3g，MgSO40.63g，玉米漿 0.4g，FeSO4 0.12g，CoCl2 0.005g, CaCO3 0.6g，維生素 BI 0.1 μ g,維生素 K0.I μ g，維生素 A 0.15 μ g ；ρΗ 調節為 7.2。
8.利用如權利要求5所述的生產輔酶QlO的方法，其特征在于:所述異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的濃度為0.0Ol-lOmM。
【文檔編號】C12N1/20GK103509729SQ201210201673
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2012年6月15日 優先權日:2012年6月15日
【發明者】于洪巍, 石一軍, 陸文強, 王昌澤, 張建新 申請人:浙江新和成股份有限公司, 上虞新和成生物化工有限公司