專利名稱：一種檉柳核纖孔菌胞外多糖的發酵工藝及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種檉柳核纖孔菌多糖的發酵エ藝及其在卷煙中的應用。
背景技術：
目前已知的天然多糖化合物約300多種，如真菌多糖、植物多糖、動物多糖、藻類多糖、細菌多糖等，其中關于真菌多糖的研究是目前的熱·點之一。檉柳核纖孔菌多糖是從真菌發酵液中分離出的，具有抗病毒、抗凝血、降血脂、抗腫瘤、免疫調節、延緩衰老等多種生物活性，真菌多糖現已被開發成多種藥物和功能性食品添加剤。卷煙中添加一定的香料成分可以改善其吸食品質，從檉柳核纖孔菌絲體和發酵液中提取的多糖均具有極強烈的抑制癌細胞活性，抗氧化活性和免疫調節功能。真菌多糖作為煙草添加剤，經高溫裂解或梅拉德反應將會產生一定的香氣。檉柳核纖孔菌屬于真核生物域，菌物界，真菌門，擔子菌亞門，層菌綱，非褶菌目，多孔菌科，木層孔菌屬，寬棱木層孔菌。子實體小至中等大，木質至木質，無柄側生或半平伏。菌蓋扁平，黃褐色至深灰褐色，后期變為灰黒色，有較寬的同心環棱。可供藥用，有文獻報道稱檉柳核纖孔菌有止血、止痛和防治痔瘡的作用，但未見胞外多糖的報道。目前已知的天然多糖化合物約300多種，如真菌多糖、植物多糖、動物多糖、藻類多糖、細菌多糖等，其中關于真菌多糖的研究是目前的熱點之一。真菌多糖是從真菌子實體、菌絲體、發酵液中分離出的，具有抗病毒、抗凝血、降血脂、抗腫瘤、免疫調節、延緩衰老等多種生物活性，因其進入體內后不會被消化、分解、吸收，能夠和細胞膜上的受體結合，從而能發生藥理活性，現已被開發成多種藥物和功能性食品添加剤。
發明內容
本發明的目的是提供一種發酵檉柳核纖孔菌產胞外多糖及其在卷煙中的應用。本發明的技術方案是一種檉柳核纖孔菌胞外多糖的發酵エ藝，氮源為5. 2^5. 4g/L胰蛋白胨，碳源為6(T65 g/L蔗糖，接種量為3、％，起始pH為8，溫度22 28で，轉速為120 180轉/分鐘，發酵10 15天。所述的檉柳核纖孔菌胞外多糖的發酵エ藝，優選氮源為5. 24 g/L胰蛋白胨，碳源為64. 09 g/L蔗糖，接種量為4%，起始pH為8，溫度25で，轉速為150轉/分鐘，發酵12天。—種檉柳核纖孔菌胞外多糖的的應用，將檉柳核纖孔菌胞外多糖添加在卷煙中，檉柳核纖孔菌胞外多糖在卷煙煙絲中的添加質量分數為O. οΓο. 1%。所述的檉柳核纖孔菌胞外多糖的的應用，將檉柳核纖孔菌胞外多糖添加在卷煙中，檉柳核纖孔菌胞外多糖在卷煙煙絲中的添加質量分數優選為O. 04、. 06%。本發明的有益效果本發明檉柳核纖孔菌胞外多糖得率達到O. 58 g/L以上。檉柳核纖孔菌胞外多糖加入到煙絲中間去，增加煙草加香的效率，以提高煙草的品質，降低有害物質。檉柳核纖孔菌胞外多糖不僅具有一定的減害，降低卷煙毒性的作用，而且具有生津降刺，改善ロ感，提高吸食品質的作用。
具體實施例方式實施例I
一種檉柳核纖孔菌胞外多糖的發酵エ藝，氮源為5. 2 g/L胰蛋白胨，碳源為60 g/L蔗糖，接種量為3 %，起始pH為8，溫度22で，轉速為120轉/分鐘，發酵10天。一種檉柳核纖孔菌胞外多糖的的應用，將檉柳核纖孔菌胞外多糖添加在卷煙中，檉柳核纖孔菌胞外多糖在卷煙煙絲中的添加質量分數為0.01%。實施例2
一種檉柳核纖孔菌胞外多糖的發酵エ藝，氮源為5. 4 g/L胰蛋白胨,碳源為65 g/L鹿糖，接種量為5%，起始pH為8，溫度28で，轉速為180轉/分鐘，發酵15天。
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一種檉柳核纖孔菌胞外多糖的的應用，將檉柳核纖孔菌胞外多糖添加在卷煙中，檉柳核纖孔菌胞外多糖在卷煙煙絲中的添加質量分數為O. 1%。實施例3
一種檉柳核纖孔菌胞外多糖的發酵エ藝，氮源為5. 2^5. 4 g/L胰蛋白胨，碳源為6(Γ65g/L蔗糖，接種量為3 5%，起始pH為8，溫度22 28 V，轉速為120 180轉/分鐘，發酵10 15天。一種檉柳核纖孔菌胞外多糖的的應用，將檉柳核纖孔菌胞外多糖添加在卷煙中，檉柳核纖孔菌胞外多糖在卷煙煙絲中的添加質量分數為O. οΓο. 1%。實施例4
一種檉柳核纖孔菌胞外多糖的發酵エ藝，氮源為5.24 g/L胰蛋白胨，碳源為64. 09 g/L蔗糖，接種量為4%，起始pH為8，溫度25 V，轉速為150轉/分鐘，發酵12天。一種檉柳核纖孔菌胞外多糖的的應用，將檉柳核纖孔菌胞外多糖添加在卷煙中，檉柳核纖孔菌胞外多糖在卷煙煙絲中的添加質量分數優選為O. 04 %。本發明菌株為檉柳核纖孔菌，菌株保藏編號WDCM133，購買自荷蘭真菌多樣化中心。I.所用培養基PDA固體培養基葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，2%瓊脂；改良PDA固體培養基250g/L土豆，葡萄糖10g/L，蛋白胨4g/L，2%瓊脂；基礎培養基葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L ;液體種子培養基(基礎培養基)葡萄糖30g/L，蛋白胨3g/L。2.檉柳核纖孔菌發酵時間的確定
斜面菌種培養配制改良的固體培養基，分裝試管，滅菌后制備斜面，劃線接種檉柳核纖孔菌后，于26°C培養4天，冷凍保藏即為檉柳核纖孔菌株菌種。從保存菌株的試管中，使用接種鉤在試管斜面取出O. 5平方厘米的ー小塊，接種到PDA固體平板中。接種時要使接種塊上包含盡量少的培養基，ー個平板接兩塊，放入恒溫培養箱，26°C培養7天。使用直徑O. 5cm的打孔器，從固體平板培養基上取下兩片位于菌落邊緣的菌體，接種于液體種子培養基中(250ml三角瓶，50毫升培養液)，在26°C，150r/min條件下培養4d ;然后以4%的接種量將種子培養液接種于基礎培養基中培養，每兩天測定一次菌絲和EPS含量，確定檉柳核纖孔菌最佳發酵時間為12d。
3.分離純化
檉柳核纖孔菌發酵結束后，將50mL的發酵物通過真空抽濾法分離菌絲與發酵液，發酵液通過旋蒸儀濃縮至原體積的1/4-1/5，然后加入4倍體積的無水こ醇，4°C過夜。IOOOOr/min離心lOmin，得沉淀為粗多糖；稱取O. Ig粗多糖，溶于IOmL蒸餾水，用苯酚硫酸法可測定計算發酵液中多糖含量。Sevag法脫蛋白稱取Ig的粗多糖樣品，室溫下加入50mL蒸懼水溶解,加入1/4體積的氯仿一正丁醇(預先配制成體積比為4 I混合液)溶液，置于具塞容器中，充分振搖30 min后,經離心機1000r/min離心5 min,然后將水相與氯仿相分開。將水相再加入相當于其體積1/4的氯仿一正丁醇溶液，重復上述過程，共計重復二次。用硫酸-苯酚法對胞外多糖進行檢測。純化出的胞外多糖成分用旋轉蒸發儀濃縮至10mL，透析(透析袋分子量8000-14000Da)除去NaCl，得精制檉柳核纖孔菌胞外多糖純品，真空冷凍干燥保存。4.精制檉柳核纖孔菌發酵多糖的抗氧化性的測定方法· (l)2ml多糖溶液及2ml濃度為0. lg/Ι的DPPH 50%こ醇溶液先后加入同一試管中，搖勻，25°C放置lh，以50%こ醇溶液為空白在517nm波長下測定其吸光度Ai。(2) 2ml濃度為O. lg/1的DPPH 50%こ醇溶液及2ml蒸餾水混合，搖勻，25°C放置Ih,以50%こ醇溶液為空白在517nm波長下測定其吸光度Ao。(3) 2ml多糖溶液及2m 50%こ醇混合，搖勻，25°C放置lh，以50%こ醇溶液為空白在517nm波長下測定其吸光度Aj。根據下列公式計算多糖對DPPH的清除率，即 清除率=[I-(Ai-Aj)/ Ao] X 100%
式中=Ai為加入抗氧化劑后DPPH溶液的吸光度；Ao為未加抗氧化劑時DPPH溶液的吸光度；Aj為多糖溶液在測定波長時的吸光度。引入Aj是為了清除多糖溶液本身顏色對測定的干擾。清除率越大，抗氧化活性越高。測試結果為檉柳核纖孔菌多糖對DPPH自由基的清除率明顯；在3 g/Ι的時候達到34. 66%。5.精制檉柳核纖孔菌胞外多糖在煙氣中轉移率的測定
稱取0. Ig精制EPS溶于IOmL蒸餾水中，配成10mg/mL精制EPS儲備液；取不同體積精制胞外多糖儲備液(并加蒸餾水補充到0. 5mL，注射進散花成品煙中，使煙支中胞外多糖含量分別達到煙支質量的0. 02%,0. 04%,0. 06%,0. 08%,0. 1%，并做注射0. 5mL蒸餾水的空白對照，每組10支；放入恒溫恒濕箱(溫度22°C，濕度60%)平衡48 h ;然后用吸煙機對煙支進行抽吸；將抽吸后的劍橋濾片放入150mL三角瓶中，加入50mL無水こ醇超聲lh，倒掉こ醇，然后加入50mL無水こ醇超聲0. 5h,倒掉こ醇,再加入50mL蒸懼水超聲兩次,每次Ih,合并濾液，用硫酸-苯酚法測定多糖含量，計算其在煙氣中轉移率在2. 3% 3. 3%之間變動，確定了檉柳核纖孔菌胞外多糖在卷煙中使用的可行性。轉移率=(實驗組劍橋濾片上多糖量-對照組劍橋濾片上多糖量)/多糖添加量。多糖在煙氣中的轉移率隨其在多糖中濃度的増加而增加，在多糖添加量為0. 36 mg/支時，轉移率為I. 58%，在多糖添加量為I. 44%吋，轉移率為0.48 mg/支。而多糖添加量超過I. 43%達到0.60 mg/支時，多糖在煙氣中的轉移率為I. 63%。6.精制檉柳核纖孔菌胞外多糖在卷煙中的感官評價 表I 檉柳核纖孔菌胞外多糖在卷煙的感官評價結果
權利要求
1.一種檉柳核纖孔菌胞外多糖的發酵エ藝，其特征在干氮源為5.2、. 4 g/L胰蛋白胨，碳源為60 65 g/L蔗糖，接種量為3 5%，起始pH為8，溫度22 28で，轉速為120 180轉/分鐘，發酵1(Γ15天。
2.根據權利要求I所述的檉柳核纖孔菌胞外多糖的發酵エ藝，其特征在于氮源為5.24 g/L胰蛋白胨，碳源為64. 09 g/L蔗糖，接種量為4%，起始pH為8，溫度25で，轉速為150轉/分鐘，發酵12天。
3.一種檉柳核纖孔菌胞外多糖的的應用，其特征在于將檉柳核纖孔 菌胞外多糖添加在卷煙中，檉柳核纖孔菌胞外多糖在卷煙煙絲中 的添加質量分數為O. οΓο. 1%。
4.根據權利要求3所述的檉柳核纖孔菌胞外多糖的的應用，其特征在于將檉柳核纖孔菌胞外多糖添加在卷煙中，檉柳核纖孔菌胞外多糖在卷煙煙絲中的添加質量分數為O.04、. 06%O
全文摘要
本發明公開了一種檉柳核纖孔菌胞外多糖的發酵工藝，氮源為5.2~5.4g/L胰蛋白胨，碳源為60~65g/L蔗糖，接種量為3~5%，起始pH為8，溫度22~28℃，轉速為120~180轉/分鐘，發酵10~15天。本發明檉柳核纖孔菌胞外多糖得率達到0.58g/L以上。檉柳核纖孔菌胞外多糖加入到煙絲中間去，增加煙草加香的效率，以提高煙草的品質，降低有害物質。檉柳核纖孔菌胞外多糖不僅具有一定的減害，降低卷煙毒性的作用，而且具有生津降刺，改善口感，提高吸食品質的作用。
文檔編號C12R1/645GK102690849SQ20121019784
公開日2012年9月26日 申請日期2012年6月15日 優先權日2012年6月15日
發明者楊琛琛, 毛多斌, 耿盧靖, 袁鷺, 許春平 申請人:鄭州輕工業學院