專利名稱：一種硬毛栓孔菌胞外多糖的發酵方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物發酵技術領域，具體涉及ー種硬毛栓孔菌胞外多糖的發酵方法及其應用。
背景技術：
硬毛栓孔菌是中藥和食品中用途廣泛的真菌之一，含有十分豐富的營養物質，它具有高蛋白、低脂肪、低膽固醇的特點，還富含有多種維生素和礦質元素等成分，如鉀、鈉、鈣、鐵、鋅、鎂、磷等。卷煙中添加一定的香料成分可以改善其吸食品質，目前很多天然提取物對煙草的加香作用引起了人們的重視。從硬毛栓孔菌菌絲體和發酵液中提取的多糖均具有極強烈的抑制癌細胞活性，抗氧化活性和免疫調節功能，是良好的免疫增強劑，可提高動物機體IgM的量等作用。目前很多天然提取物對煙草的加香作用引起了人們的重視，真菌多糖作為煙草添加剤，經高溫裂解或梅拉德反應將會產生一定的香氣。
發明內容
本發明的目的是提供一種硬毛栓孔菌胞外多糖的發酵方法，將硬毛栓孔菌胞外多糖添加在卷煙中達到加香的效果。本發明的技術方案是一種硬毛栓孔菌胞外多糖的發酵方法，氮源5. 5飛g/L胰蛋白胨，碳源50 55 g/L麥芽糖，接種量為3 5%，起始pH為5，溫度25 30で，攪拌發酵轉速140 160轉/分鐘，發酵6 10天。所述的硬毛栓孔菌胞外多糖的發酵方法優選為氮源5. 870 g/L胰蛋白胨，碳源53. 120g/L麥芽糖，接種量為4%，起始pH為5，溫度28°C，攪拌發酵轉速150 r/min,發酵8天。一種硬毛栓孔菌胞外多糖的應用，將硬毛栓孔菌胞外多糖添加在卷煙中，硬毛栓孔菌胞外多糖在卷煙煙絲中的添加質量分數為O. 02、. 1%。一種硬毛栓孔菌胞外多糖的應用，將硬毛栓孔菌胞外多糖添加在卷煙中，硬毛栓孔菌胞外多糖在卷煙煙絲中的添加質量分數優選為O. 04、. 6%。本發明的有益效果是本發明硬毛栓孔菌胞外多糖得率可達10. 0982g /し煙絲中硬毛栓孔菌胞外多糖添加量在O. 02% O. 10%內變動時，其在卷煙煙氣中的轉移率也從
I.58%到3. 39%逐漸增加；硬毛栓孔菌胞外多糖在卷煙中起到到了烘托香氣、増加煙氣濃度風格的作用，有助于提高卷煙的品質。
具體實施例方式實施例I
一種硬毛栓孔菌胞外多糖的發酵方法，氮源6 g/L胰蛋白胨，碳源55 g/L麥芽糖，接種量為5%，起始pH為5，溫度30で，攪拌發酵轉速160轉/分鐘，發酵10天。將硬毛栓孔菌胞外多糖添加在卷煙中，硬毛栓孔菌胞外多糖在卷煙煙絲中的添加質量分數為O. 1%。、
實施例2
一種硬毛栓孔菌胞外多糖的發酵方法，氮源5. 5 g/L胰蛋白胨，碳源50 g/L麥芽糖，接種量為3%，起始pH為5，溫度25で，攪拌發酵轉速140轉/分鐘，發酵6天。將硬毛栓孔菌胞外多糖添加在卷煙中，硬毛栓孔菌胞外多糖在卷煙煙絲中的添加質量分數為O. 02%。實施例3
一種硬毛栓孔菌胞外多糖的發酵方法，氮源5. 5飛g/L胰蛋白胨,碳源5(T55 g/L麥芽糖，接種量為3 5%，起始pH為5，溫度25 30で，攪拌發酵轉速14(Tl60轉/分鐘，發酵6^10天。將硬毛栓孔菌胞外多糖添加在卷煙中，硬毛栓孔菌胞外多糖在卷煙煙絲中的添加質量分數為O. 02、. 1%。實施例4
一種硬毛栓孔菌胞外多糖的發酵方法，氮源5. 870 g/L胰蛋白胨，碳源53. 120g/L麥 芽糖，接種量為4%，起始pH為5，溫度28°C，攪拌發酵轉速150 r/min，發酵8天。將硬毛栓孔菌胞外多糖添加在卷煙中，硬毛栓孔菌胞外多糖在卷煙煙絲中的添加質量分數優選為
O.04、. 6%。本發明菌株為硬毛栓孔菌，菌株保藏編號200800，購買自美國菌種保藏中心ATCC0單料煙絲云南宣威HClF ;散花成品煙重量O. 83g，煙支吸阻1050Pa，煙支規格84mmX 24. 5mm,濾嘴長30 mm ;重蒸酹(> 98%,索來寶科技有限責任公司);無水こ醇(北京化エ廠)、葡萄糖(索來寶科技有限責任公司)、氯化鈉(天津市大茂化學試劑廠)和硫酸(北京化エ廠)等均為分析純。Bruker TENSOR 27紅外光譜儀(FT-IR，德國)；CXG-1電腦恒溫層析柜(上海青浦瀘西儀器廠)；WaterS 2487紫外檢測器(美國water公司)；UV1700PC紫外可見分光光度計(Phenix公司);METTLER 4E200電子分析天平(上海沛歐分析儀器有限公司)；RE-52AA旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)；LM5+吸煙機(德國Borgwaldt)。I.硬毛栓孔菌發酵時間的確定
(I)斜面菌種培養配制改良的PDA固體培養基，改良的PDA固體培養基配方為250g/L 土豆，葡萄糖10g/L，蛋白胨4g/L，瓊脂2%，瓊脂的質量為土豆、葡萄糖和蛋白胨總質量的2%，分裝試管，滅菌后制備斜面，劃線接種硬毛栓孔菌后，在25 28で的條件下培養3飛天，冷凍保藏，得到硬毛栓孔菌株菌種；
從保存硬毛栓孔菌株菌種的試管中，使用接種鉤在試管斜面取出O. 5平方厘米的一塊，接種到PDA固體平板培養基中，PDA固體平板培養基的配方為葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，2%瓊脂，瓊脂的質量為葡萄糖和酵母粉總質量的2% ;接種時要使接種塊上包含盡量少的培養基，ー個平板接兩塊，放入恒溫培養箱，在25 28 V的條件下培養61天；
使用直徑O. 5cm的打孔器，從PDA固體平板培養基上取下兩片位于菌落邊緣的菌體，接種于液體種子培養基中(250ml三角瓶,50毫升培養液),液體種子培養基的配方為葡萄糖30g/L，蛋白胨3g/L，在25 28°C，140 160 r/min條件下培養3 5天，然后以4%的接種量將種子培養液接種于基礎培養基中培養，基礎培養基的配方為葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L ；每兩天測定一次菌絲和EPS含量，確定硬毛栓孔菌最佳發酵時間。當發酵到第8d時，發酵液中胞外多糖含量為2. 50g/L。2.發酵產硬毛栓孔菌胞外多糖的分離純化
硬毛栓孔菌發酵結束后，將50mL的發酵物通過真空抽濾法分離菌絲與發酵液，發酵液通過旋蒸儀濃縮至原體積的1/4-1/5,然后加入4倍體積的無水こ醇，4°C過夜。10000r/min離心lOmin，得沉淀為粗多糖；稱取O. Ig粗多糖，溶于IOmL蒸餾水，用苯酚硫酸法可測定計算發酵液中多糖含量(g/L)。Sevag法脫蛋白稱取Ig的粗多糖樣品，室溫下加入50mL蒸懼水溶解,加入1/4體積的氯仿一正丁醇(預先配制成體積比為4 I混合液)溶液，置于具塞容器中，充分振搖30 min后,經離心機1000r/min離心5 min,然后將水相與氯仿相分開。將水相再加入相當于其體積1/4的氯仿一正丁醇溶液，重復上述過程，共計重復二次。用硫酸-苯酚法對胞外多糖進行檢測。純化出的胞外多糖成分用旋轉蒸發儀濃縮至10mL，透析(透析袋分子量8000-14000Da)除去NaCl，得精制硬毛栓孔菌胞外多糖純品①和多糖純品②，真空冷凍干燥保存。3.硬毛栓孔菌胞外多糖的紅外和核磁分析
取多糖組分①和②各lmg，用溴化鉀(KBr)壓片后進行紅外(IR)分析。對硬毛栓孔菌 胞外多糖組分①和②進行紅外光譜監測得紅外光譜圖。從硬毛栓孔菌胞外多糖組分①和②的特征吸收波數可知，在3412CHT1有ー特征峰，因為O-H的伸縮振動在3600-3200 cnT1出現ー寬峰，在該糖中應存在-OH ;在波數2929CHT1處有ー特征峰，是C-H鍵的伸縮振動，是糖類的特征吸收；在I. 73 X IO3 cnT1和I. 25 X IO3 cnT1左右有吸收峰，說明有こ酰基的存在；多糖在1646 cnT1為C=O非対稱伸縮振動，在1646 cnT1和1085 cnT1左右存在吸收峰，說明有羧酸存在，為酸性多糖，在796 cm—1處存在吸收峰，為甘露糖結構；910和880 cm—1處有吸收峰，說明多糖①和②有α和β糖
苷鍵。由硬毛栓孔菌胞外多糖的1H-NMR可知δ 5. 00及5. 03的共振信號，即Cl質子區的信號峰在5. O以上，進ー步證明糖苷鍵為α型；中心在δ 3. 78處的重峰表明存在一個亞甲基CH2，δ 3. 85為CH3-0的質子氫信號，說明在硬毛栓孔菌胞外多糖中可能存在著甲氧基的取代。經過紅外光譜與核磁共振光譜分析可知，多糖①可能是ー種具有α-糖苷鍵的部分こ酰化的酸性多糖，多糖②可能是ー種具有β -糖苷鍵的酸性甘露聚糖，并具有甲氧基的取代。4.精制硬毛栓孔菌胞外多糖在煙氣中轉移率的測定
稱取0. Ig精制EPS溶于IOmL蒸餾水中，配成10mg/mL精制EPS儲備液；取不同體積精制胞外多糖儲備液(并加蒸餾水補充到0. 5mL，注射進散花成品煙中，使煙支中胞外多糖含量分別達到煙支質量的0. 02%,0. 04%,0. 06%,0. 08%,0. 1%，并做注射0. 5mL蒸餾水的空白對照，每組10支；放入恒溫恒濕箱(溫度22°C，濕度60%)平衡48 h ;然后用吸煙機對煙支進行抽吸；將抽吸后的劍橋濾片放入150mL三角瓶中，加入50mL無水こ醇超聲lh，倒掉こ醇，然后加入50mL無水こ醇超聲0. 5h,倒掉こ醇,再加入50mL蒸懼水超聲兩次,姆次Ih,合并濾液，用硫酸-苯酚法測定多糖含量，計算其在煙氣中轉移率在2. 3% 3. 3%之間變動，確定了硬毛栓孔菌胞外多糖在卷煙中使用的可行性。轉移率=(實驗組劍橋濾片上多糖量-対照組劍橋濾片上多糖量)/多糖添加量。多糖在煙氣中的轉移率隨其在多糖中濃度的増加而增カロ，在多糖添加量為0. 02%時，轉移率為I. 58%，在多糖添加量為0. 08%時，轉移率為3. 28%。而多糖添加量超過0. 08%達到0. 1%時，多糖在煙氣中的轉移率為3. 39%。5.精制硬毛栓孔菌胞外多糖在卷煙中的感官評價 表I硬毛栓孔菌胞外多糖在卷煙的感官評價結果
權利要求
1.一種硬毛栓孔菌胞外多糖的發酵方法，其特征在干氮源5. 5飛g/L胰蛋白胨，碳源50 55 g/L麥芽糖，接種量為3 5%，起始pH為5，溫度25 30で，攪拌發酵轉速140 160轉/分鐘，發酵6 10天。
2.根據權利要求I所述的硬毛栓孔菌胞外多糖的發酵方法，其特征在于氮源5.870g/L胰蛋白胨，碳源53. 120g/L麥芽糖，接種量為4%，起始pH為5，溫度28°C，攪拌發酵轉速150 r/min,發酵 8 天。
3.—種硬毛栓孔菌胞外多糖的應用，其特征在于將硬毛栓孔菌胞外多糖添加在卷煙中，硬毛栓孔菌胞外多糖在卷煙煙絲中的添加質量分數為O. 02、. 1%。
4.根據權利要求3所述的硬毛栓孔菌胞外多糖的應用，其特征在于將硬毛栓孔菌胞外多糖添加在卷煙中，硬毛栓孔菌胞外多糖在卷煙煙絲中的添加質量分數為O. 04、. 06%。
全文摘要
本發明公開了一種硬毛栓孔菌胞外多糖的發酵方法，氮源5.5~6g/L胰蛋白胨，碳源50~55g/L麥芽糖，接種量為3~5%，起始pH為5，溫度25~30℃，攪拌發酵轉速140~160轉/分鐘，發酵6~10天。本發明硬毛栓孔菌胞外多糖得率可達10.0982g／L。煙絲中硬毛栓孔菌胞外多糖添加量在0.02%～0.10%內變動時，其在卷煙煙氣中的轉移率也從1.58%到3.39%逐漸增加；硬毛栓孔菌胞外多糖在卷煙中起到到了烘托香氣、增加煙氣濃度風格的作用，有助于提高卷煙的品質。
文檔編號C12R1/645GK102690848SQ201210197839
公開日2012年9月26日 申請日期2012年6月15日 優先權日2012年6月15日
發明者楊琛琛, 毛多斌, 耿盧靖, 許春平 申請人:鄭州輕工業學院