專利名稱：一種產胞外普魯蘭酶的方法及其專用微生物的制作方法
技術領域：
一種產胞外普魯蘭酶的方法及其專用微生物，屬于微生物發酵生產普魯蘭酶的技術領域。
背景技術：
普魯蘭多糖是麥芽三糖通過α-l，6-糖苷鍵連接而成的直鏈寡糖，而普魯蘭酶是指能夠高效水解普魯蘭多糖的ー類水解酶。根據普魯蘭酶對底物特異性及水解產物的種類，可以將普魯蘭酶分為4種類型I型普魯蘭酶(EC 3. 2. I. 41)、II型普魯蘭酶(EC3. 2. I. 41)、新普魯蘭酶(EC 3. 2. I. 135)和異普魯蘭酶(EC 3.2.1.57)。I型普魯蘭酶可 以水解普魯蘭多糖和支鏈寡糖中的α -I, 6-糖苷鍵生成麥芽三糖和直鏈寡糖；而能水解普魯蘭多糖中的α-1，6-糖苷鍵同時也能水解其它多糖中的α-1，4-糖苷鍵的為II型普魯蘭酶；新普魯蘭酶和異普魯蘭酶作用于普魯蘭多糖中α -I, 4-糖苷鍵分別產生潘糖和異潘糖。由于I型普魯蘭酶對α -1,6-糖苷鍵的特異性及可以將最小単位的支鏈分解，在淀粉制糖エ業中與糖化酶混合使用能最大限度地利用淀粉，因此，普魯蘭酶在以淀粉為原料的發酵エ業中有著廣泛的應用前景。普魯蘭酶與糖化酶并用時，在降低糖化酶用量一半的同時可以使DE值上升至高達98%，從而大大提高原料的利用率和葡萄糖的收率，例如應用在酒精エ業中，可以顯著提高淀粉的轉化率，降低生產成本。普魯蘭酶與β_淀粉酶混合使用時，幾乎可以全部將淀粉轉化為麥芽糖，從而可以生產出80%以上的超高麥芽糖漿，在α-糖苷酶的作用下，超高麥芽糖漿轉化為功能性異麥芽低聚糖，可以用于糖尿病人，肥胖病人以及兒童糖果中使用，有效地防止齲齒。在啤酒生產的糖化エ藝中，添加普魯蘭酶可以有效地提高麥汁中可發酵性糖的含量，提高麥汁的利用率、縮短糖化時間，生產出優級干啤酒。普魯蘭酶還可以用來生產具有穩定的凝膠性能、良好的韌性和增稠作用的直鏈淀粉，進而利用直鏈淀粉生產出可生物降解的薄膜或是作為添加劑或輔料用于食品エ業和紡織エ業中。此外，普魯蘭酶還存在較強的反向合成能力，在高底物濃度下可以將麥芽糖基等接枝到環糊精分子上，制備得到麥芽糖基環糊精等。由于普魯蘭酶在酒精、食品、環保產業上極其重要的用途，它將和淀粉酶、糖化酶ー樣成為ー個與國民經濟發展相關的重大產業。普魯蘭酶的生產和應用主要由諾維信和杰能科等國際公司所壟斷。從20世紀60年代Bender在出芽短梗霉{Aureobasidium的發酵液中發現普魯蘭酶到80年代初，普魯蘭酶的研究一直處于產酶微生物的篩選和酶學性質的鑒定方面。近幾年，國際上對普魯蘭酶的研究主要集中在普魯蘭酶在革蘭氏陰性細菌中的分泌機制。而國內針對普魯蘭酶的研究主要集中在普魯蘭酶生產菌的篩選、發酵優化及普魯蘭酶編碼基因的異源表達等方面，篩選獲得的產酶微生物主要包括產氣氣桿菌、蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等，以及高溫厭氧菌、嗜熱古細菌、海棲熱袍菌、深海古菌等極端微生物。但是其酶活較低，一般野生菌發酵普魯蘭酶活力均低于10 U/mL，且不能有效分泌至胞外，因而很難達到エ業化生產的要求。目前，尚沒有通過篩選利用黑座克雷伯氏菌發酵生產普魯蘭酶的報道。本發明篩選獲得產胞外普魯蘭酶的菌株黑座克雷伯^mebsiella variicolaXCTCC NO M 2012108，并通過發酵培養條件優化使該菌株產胞外普魯蘭酶的活力達到11 U/mL。
發明內容
( I)要解決的技術問題
本發明的目的是提供一種產胞外普魯蘭酶的方法及其專用微生物。本發明目的不僅僅在于通過微生物菌株發酵生產胞外普魯蘭酶，而是通過篩選獲得可以生產普魯蘭酶的新菌株，而且通過培養基成分及培養條件優化進一步提高野生菌株生產普魯蘭酶的能力，并進一歩考察該菌株所產普魯蘭酶的酶學性質，以開發其生產和應用價值。(2)技術方案 本發明首先從微生物出發，篩選能夠高效生產胞外普魯蘭酶的菌株。在此基礎上，對該菌種的培養基成分及培養條件進行優化，并考察以該菌種進行發酵生產的普魯蘭酶的酶學性質及水解普魯蘭的過程中產物的組成變化，進而確定普魯蘭酶的類型。—、產胞外普魯蘭酶菌株的篩選及分類鑒定 培養基
基本培養基支鏈淀粉 10 g/L，酵母粉 5 g/L, KH2PO4 3 g/L，MgSO4 ·7Η20 I g/L, NH4Cl
2g/L, pH 5. O0鑒別培養基紅色普魯蘭多糖10 g/L，蛋白胨10 g/L, KH2PO4 3 g/L，MgSO4 · 7H20I g/L, NH4Cl 2 g/L，瓊脂 20 g/L, pH 5. 0o初始發酵培養基可溶性淀粉10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，KH2PO4 5g/L, MgSO4 · 7H20 O. I g/L, NH4Cl 2 g/L, pH 5. 0。主要試劑
3，5-ニ硝基水楊酸購于國藥試劑公司
紅色普魯蘭購于美國Sigma-Aldrich公司
普魯蘭購于上海TCI試劑公司
酵母粉購于Oxiod
蛋白胨購于Oxiod
菌種的培養和篩選
將所采集的土壤樣品適量加入到基本培養基中于40°C、200 rpm的恒溫搖床上振蕩培養48小吋。取培養物進行適當稀釋之后，涂布于鑒別培養基的平板上，于37°C的培養箱中進行培養2天左右。將其上生成較大透明圈的菌落接種于發酵培養基中于上述條件下進行培養48小時左右，同時接種于斜面上進行菌種的保存。菌種在裝液量為10%的50 mL搖瓶中于30°C、150 rpm振蕩培養48小時。培養結束后，將發酵液于10000 rpm離心10分鐘后得發酵上清用于菌株胞外酶活的測定和產酶菌株的再次確認。普魯蘭酶測定方法
取100 μ L用100 mM、pH 5. O的醋酸緩沖適當稀釋的酶液與等體積的溶于100 mM、pH
5.O醋酸緩沖中的10 g/L普魯蘭相混合于50°C水浴中保溫30分鐘。加入DNS試劑300μ L搖勻，置于沸水中煮沸15分鐘，取出以流動水迅速冷卻后，于540 nm波長處，以O. 5 cm比色杯，測定反應液的吸光度值。酶活單位定義在上述指定的條件下，每分鐘催化分解普魯蘭多糖生成相當于Iμ mo I葡萄糖的還原糖所需的酶為I個酶活單位(U)。產酶菌株的分類鑒定
利用細菌基因組DNA提取試劑盒(VI0GENE公司)提取產酶菌株的基因組，以細菌的通用引物 27F (5，- AGAGTTTGATCMTGGCTCAG -3，)和 1492R (5，- TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3，)擴增其 16S rDNAoPCR 反應體系ddH20 37. 75 μ L，10 X Reaction Buffer 5 μ L，dNTP (2· 5 mmol/L)4 yL，引物 27F (20 pmol/μ L)1 yL，引物 1492R (20 pmol/μ L) I μ L，基因組 DNA I μ L, Taq DNA polymerase (5 U/ μ L) 0. 25 μ L。PCR 反應過程94 °C 預變性 5 min ；98°C 10 s，55°C 15 s，72°C 4 min，進行 30 個循環；72°C延伸10 min。利用3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit(上海申能博彩生物科技有限公司)純化PCR反應獲得的DNA片斷，純化后進行測序，并提交NCBI (登錄號為HM037179)對菌株進行分類鑒定。通過比對，結果顯示得到的產酶菌株為黑座克雷伯氏菌variicola ) CCTCC NO :M2012108。ニ、發酵培養基成分的優化 培養基成分優化
分別考察了碳源、氮源、磷源及硫酸鎂等對菌株產胞外普魯蘭酶的影響，并經過正交實驗最終確定所得菌株黑座克雷伯氏菌GWe/wieBa variicola) CCTCC NO M 2012108發酵培養基的成分為
優化發酵培養基可溶性淀粉10 g/L，蛋白胨15 g/L，酵母膏5 g/L，KH2PO4 5 g/L,MgSO4 · 7H20 0. I g/L, NH4Cl 0. 5 g/L, FeSO4 · 7H20 0. I g/L，用超純水配制，pH 6· 5。培養條件優化
分別考察了起始pH、裝液量、溫度、培養時間對轉化及菌體量的影響。最終確定了出發菌株黑座克雷伯氏菌{Klebsiella variicola ) CCTCC NO M2012108培養條件為起始pH5. 0 7. O,裝液量10 20%，搖床轉速100 300 rpm,培養溫度30 37°C，培養時間48 72小時。優化后，黑座克雷伯氏菌(Z/e/wieWa variicolaXCTCC NO M 2012108產胞外普魯蘭酶的能力達到11 U/mL。三、胞外普魯蘭酶的制備及其酶學性質 胞外普魯蘭酶酶液的制備
黑座克雷伯氏菌variicola ) CCTCC NO M 2012108接種于優化發酵培養基裝液量為10 20%的250 mL搖瓶中于3(T37°C、10(T300 rpm振蕩培養48 72小時。培養結束后，將發酵液于10000 rpm離心30分鐘，棄去細胞，得到的上清即為胞外普魯蘭酶的粗酶液，用于普魯蘭酶最適PH值、溫度的測定及普魯蘭多糖的水解。pH值對普魯蘭酶活性的影響
將普魯蘭酶的粗酶液超濾濃縮10倍后，取適量用不同pH的緩沖液進行稀釋至I U/mL左右，與溶于相同緩沖液、具有相同pH值的10 g/L的普魯蘭多糖溶液等體積混合后于50°C的水浴中保溫30分鐘后測定普魯蘭酶的活力，以確定其作用的最適pH值。以pH 5.0、50°C測定的普魯蘭酶酶活作為100%，計算不同pH對普魯蘭酶活力的影響。結果發現該普魯蘭酶在ρΗ5· (Γ7· O的范圍內保持90%以上的活力，當pH低于5. O時活力明顯下降。溫度對普魯蘭酶活性的影響
將普魯蘭酶的粗酶液超濾濃縮10倍后，取適量用100 mM、pH 5. O的醋酸緩沖液進行稀釋至I U/mL左右，與溶于相同緩沖液、具有相同pH值的10 g/L的普魯蘭多糖溶液等體積混合后于45 70°C的水浴中保溫30分鐘后測定普魯蘭酶的活力，以確定其作用的最適作用溫 度。以pH 5. 0、55°C測定的普魯蘭酶酶活作為100%，計算不同溫度對普魯蘭酶活力的影響。結果發現該普魯蘭酶在55°C時活力最高，當溫度高于55°C后普魯蘭酶的活力明顯下降。普魯蘭酶水解普魯蘭多糖的產物及其類型
將普魯蘭酶的粗酶液超濾濃縮10倍后，取適量用100 mM、pH 5. O的醋酸緩沖液進行稀釋至5 U/mL左右，與溶于相同緩沖液、具有相同pH值的10 g/L的普魯蘭多糖溶液等體積混合后于55°C的水浴中保溫，分別在0、10、20和30分鐘取樣后加入沸水浴中保持10分鐘滅活普魯蘭酶。冷卻后加入3倍體積的無水こ醇沉淀蛋白和未被水解的普魯蘭，離心去除沉淀后，利用高效液相色譜測定上清液中成分的變化情況。結果發現，隨著時間的延長，產物中麥芽三糖的量逐漸增加，因此確定黑座克雷伯氏菌variicola)CCTCCM2012108所產的普魯蘭酶為I型普魯蘭酶。高效液相色譜測定普魯蘭酶水解普魯蘭多糖上清液中成分的條件液相色譜柱Kromasil NH2，示差折光檢測器，流動相為こ臆/水(7 3)，流速I mL/min，進樣量50 μし黑座克雷伯氏菌(Z/e/wieBavariicola) CCTCC NO M 2012108
菌落形態為灰白到乳白色粘液菌落，表面光滑，有光澤，菌落不透明。菌體形態為短粗桿狀，大小O. 5 0. 8Xf 2 ym，単獨、成雙或短鏈狀排列。無芽孢，無鞭毛，有較厚的莢膜，革蘭氏陰性，不運動，氧化酶陰性，其生長不需要特殊的生長因子。生理生化特征表現為甲基紅試驗為陰性，VP試驗為陽性，可以發酵葡萄糖，L-阿拉伯糖、乳糖、D-甘露醇、鼠李糖、蔗糖、葡萄糖、棉籽糖和D-山梨醇，可以利用檸檬酸鹽等，脲酶試驗為陽性，精氨酸雙水解酶和鳥氨酸脫羧酶為陰性，賴氨酸膠羧酶為陽性。最適生長溫度為37°C左右，最適pH為
6.5 7. 5之間。(3)有益效果
本發明通過篩選得到一株具有產較高胞外普魯蘭酶的菌株黑座克雷伯氏菌{Klebsiella variicola ) CCTCC NO M 2012108。經過培養基組成和培養條件優化后，用該菌株進行發酵產胞外普魯蘭酶時可以獲得達到11 U/mL的普魯蘭酶。用該菌株所產胞外普魯蘭酶水解普魯蘭多糖時所得到的主要產物為麥芽三糖，從而確定該菌株所產的普魯蘭酶為I型普魯蘭酶。生物材料樣品保藏黑座克雷伯氏菌(J1 ebsi ella vari I cola ) SHN-1 ;保藏單位中國典型培養物保藏中心，簡寫CCTCCJii :中國武漢武漢大學，保藏編號CCTCC NO M2012108，保藏日期為2012年4月11日。
具體實施方式
實施例I
采用黑座克雷伯氏菌variicola) CClCC NO M 2012108發酵生產胞外普
魯蘭酶
黑座克雷伯氏菌variicola ) CCTCC NO M 2012108接種于優化發酵培養基裝液量為10%的250 mL搖瓶中于30°C、100 rpm振蕩培養48小吋。培養結束后，將發酵液于10000 rpm離心30分鐘，棄去細胞，得到的上清即為胞外普魯蘭酶的粗酶液。取100μ L粗酶液用100 mM、pH 5. O的醋酸緩沖適當稀釋的酶液與等體積的溶于100 mM、pH 5.0醋酸緩沖中的10 g/L普魯蘭相混合于50で水浴中保溫30分鐘，測得普魯蘭酶酶活為5U/mL ο實施例2
采用黑座克雷伯氏菌OWeZwieBa variicola) CClCC NO M 2012108發酵生產胞外普
魯蘭酶
黑座克雷伯氏菌variicola ) CCTCC NO M 2012108接種于優化發酵培養基裝液量為10%的250 mL搖瓶中于37°C、200 rpm振蕩培養72小吋。培養結束后，將發酵 液于10000 rpm離心30分鐘，棄去細胞，得到的上清即為胞外普魯蘭酶的粗酶液。取100μ L粗酶液用100 mM、pH 5. O的醋酸緩沖適當稀釋的酶液與等體積的溶于100 mM、pH 5.0醋酸緩沖中的10 g/L普魯蘭相混合于50°C水浴中保溫30分鐘，測得普魯蘭酶酶活為11U/mL ο
權利要求
1.一株產胞外普魯蘭酶的菌株，分類命名為黑座克雷伯氏菌variicola、SHN-I，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號CCTCC NO M 2012108。
2.—種用權利要求I所述菌株生產胞外普魯蘭酶的方法，其特征在于 出發菌株采用黑座克雷伯氏菌variicolaXCTCC NO M 2012108，經過菌株的培養和產酶條件的優化用于生產胞外I型普魯蘭酶；優化發酵培養基組成為可溶性淀粉10 g/L，蛋白胨15 g/L，酵母膏5 g/L, KH2PO4 5g/L, MgSO4 · 7H20 O. I g/L, NH4Cl 0. 5 g/L, FeSO4 · 7H20 0. I g/L，用超純水配制，pH 6. 5 ；培養條件為起始PH5. (Γ7. 0，接種在優化發酵培養基裝液量為10°/Γ20%的250 mL搖瓶中，于3(T37°C、10(T300 rpm振蕩培養48 72小時；培養結束后將發酵液于10000 rpm離心30 min，棄去細胞，得到普魯蘭酶的粗酶液； 經過培養基和培養條件優化，黑座克雷伯氏菌variicola) CCTCC NO M2012108生產胞外普魯蘭酶的酶活提高到11 U/mL。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于生產得到的為胞外I型普魯蘭酶。
全文摘要
一種產胞外普魯蘭酶的方法及其專用微生物，屬于微生物發酵生產普魯蘭酶的技術領域。本發明篩選得到一株產胞外普魯蘭酶的新菌種，分類命名為黑座克雷伯氏菌(Klebsiellavariicola)SHN-1，保藏編號CCTCC NOM2012108。以該菌株作為出發菌種，經過發酵培養基和產酶培養條件的優化，最終獲得的胞外普魯蘭酶酶活達到11U/mL。通過對黑座克雷伯氏菌(Klebsiellavariicola)CCTCC NOM2012108產胞外普魯蘭酶酶學性質的考察，確定了該普魯蘭酶的最適pH值為pH5.0、最適溫度為55℃，其水解普魯蘭類型為I型普魯蘭酶。本發明有助于了解產胞外普魯蘭酶菌種的生物多樣性，對于今后改善胞外普魯蘭酶的生產工藝、促進胞外普魯蘭酶的高效生產具有指導意義。
文檔編號C12N1/20GK102676437SQ201210187070
公開日2012年9月19日 申請日期2012年6月8日 優先權日2012年6月8日
發明者徐巖, 聶堯, 陳文波 申請人:江南大學