專利名稱：一種應(yīng)用自誘導培養(yǎng)基和雙溫度調(diào)控策略生產(chǎn)胞外普魯蘭酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種應(yīng)用自誘導培養(yǎng)基和雙溫度調(diào)控策略生產(chǎn)胞外普魯蘭酶的方法，屬于微生物發(fā)酵生產(chǎn)普魯蘭酶的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
普魯蘭酶(pullulanase，EC 3. 2. I. 41)是專ー性分解普魯蘭、淀粉、支鏈淀粉和相應(yīng)分支低聚糖中α-1，6-糖苷鍵的ー種脫支 酶。與其他普魯蘭水解酶相比，普魯蘭酶特異地水解普魯蘭中α-1，6-糖苷鍵，生成以麥芽三糖為主的末端產(chǎn)物。該性質(zhì)決定了它在改善淀粉酶對淀粉的作用效果、提高淀粉利用率、降低糧耗、提高產(chǎn)品質(zhì)量及開發(fā)新的產(chǎn)品方面有著相當巨大的價值，在淀粉加工エ業(yè)、食品、洗滌劑、紡織等中有著重要的用途和良好的市場前景。普魯蘭酶最早是Bender在出芽短梗霉的發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)并對其酶學性質(zhì)做了研究。此后，科研工作者從自然界中分離得到了大量產(chǎn)普魯蘭酶的微生物及植物。這些來源的酶性質(zhì)差別較大，如來源于planticola，最適pH在5. O,最適溫度在40°C ;而來源于植物的普魯蘭酶(稱R-enzyme),最適的pH和溫度分別是5. 6和37°C。盡管如此，從普魯蘭酶的發(fā)現(xiàn)到20世紀70年代末，普魯蘭酶的研究一直處于產(chǎn)酶微生物的篩選和酶學性質(zhì)的鑒定上，并沒有出現(xiàn)普魯蘭酶的規(guī)?；a(chǎn)。直到20世紀80年代初，丹麥諾維信公司從馬來西亞的土壌中篩選到一株可以產(chǎn)普魯蘭酶的芽孢桿菌(ガadVAAs acidopulIulytics、。該菌株所生產(chǎn)的普魯蘭酶具有耐熱耐酸的特性(60°C，pH4.5)比較適合于淀粉糖化エ業(yè)的需要。此后，諾維信公司投入巨資對該普魯蘭酶進行研究，并于1983年在日本和歐洲市場同時推出商品化的普魯蘭酶(商品名為PiOmozyme)。目前，諾維信公司占據(jù)了中國乃至世界的普魯蘭酶市場。直到1995年杰能科公司利用地衣芽孢桿菌異源表達了 Bacillus deramificans的普魯蘭酶,其酶學性質(zhì)與ガ.acidopullulytics普魯蘭酶相近,從而使杰能科成為了普魯蘭酶的第二大生產(chǎn)商。由于普魯蘭酶エ業(yè)化生產(chǎn)菌株較少，我國在普魯蘭酶上的研究主要集中在產(chǎn)普魯蘭酶菌株的篩選、誘變及優(yōu)化等方面，效果均不太理想。如1998年山東大學肖敏等人從白酒發(fā)酵現(xiàn)場分離得到一株產(chǎn)普魯蘭酶的微生物，其生產(chǎn)的普魯蘭酶耐熱性較差，當溫度大于50°C后迅速失活，但是pH穩(wěn)定性較好，在中性和微酸性條件下可于冰箱中長期保存。2001年唐寶英等人從土壤中分離得到一株產(chǎn)普魯蘭酶的芽孢桿菌，其產(chǎn)普魯蘭酶有較好的酶學性質(zhì)(75°C，pH 4. 6)，但是野生菌株的產(chǎn)酶能力不高，只有1.6 U/mL，經(jīng)過誘變育種最終才使其產(chǎn)酶水平提高到8. 8 U/mL。近年來隨著分子生物學發(fā)展，人們開始利用基因工程手段表達外源普魯蘭酶基因，如2006年夏子芳等利用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達海棲熱袍菌的普魯蘭酶基因，但僅獲得胞內(nèi)酶活；2008年張明炎等將來源于ガaciBiAs Iicheniformis的普魯蘭酶編碼基因克隆到大腸桿菌中進行表達，但是最終的酶活也只有5. 6 U/mL ；2010年，王淑軍等利用大腸桿菌的表達系統(tǒng)實現(xiàn)了來源于深海古菌sicuIi HJ21的普魯蘭酶編碼基因的異源表達，但是異源表達的效果較差，且僅獲得胞內(nèi)酶活。綜上所述，在普魯蘭酶的微生物發(fā)酵生產(chǎn)過程中，不論是野生菌還是工程菌，主要存在的問題就是胞外酶活較低，造成了普魯蘭酶的生產(chǎn)成本上升，形成エ業(yè)化生產(chǎn)的障礙。自誘導(auto-induction)是最早由紐約厄普頓的布魯克黑文國家實驗室的Studier等提出的ー種利用培養(yǎng)基中碳源轉(zhuǎn)換而誘導外源基因表達的方法，即首先以葡萄糖為碳源支持大腸桿菌生長至飽和，待葡萄糖消耗殆盡，培養(yǎng)基中另ー種成分乳糖在Iac Y與lac Z的基因產(chǎn)物透過酶(lactose permease)和β -半乳糖苷酶(β-galactosidase)的協(xié)助下，乳糖穿過細胞膜并部分轉(zhuǎn)化為異乳糖開啟T7表達系統(tǒng)的方法。乳糖除了作為誘導物之外，其代謝產(chǎn)物葡萄糖和半乳糖(半乳糖在gal操縱子的作用下也將轉(zhuǎn)化成葡萄糖)也可作為細菌生長的碳源。與傳統(tǒng)的IPTG (異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)誘導方法相比，在接種之后自誘導表達過程不需要對細胞的生長情況進行監(jiān)測，從而減少了在培養(yǎng)過程中對培養(yǎng)物的處理，極大地方便了高通量篩選。而且，以價格低廉、無毒的乳糖替代價格高昂的IPTG可以大大地降低生產(chǎn)的成本，在重組蛋白的發(fā)酵生產(chǎn)中有著重要的意義。此外，針對重組蛋白的誘導分泌表達，采用雙溫度分階段調(diào)控策略已成功用于葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶分泌 蛋白的活性表達，如先在37°C條件下培養(yǎng)增加菌體量，然后降低溫度到25°C減緩重組蛋白的合成速率以促進其分泌至胞外。然而，目前自誘導培養(yǎng)基主要應(yīng)用于核磁共振分析的同位素標記重組蛋白的表達，尚無將自誘導培養(yǎng)基用于重組普魯蘭酶發(fā)酵生產(chǎn)的報道。而且，將自誘導培養(yǎng)方式和雙溫度調(diào)控的聯(lián)合策略用于重組普魯蘭酶發(fā)酵生產(chǎn)也鮮有報道。本發(fā)明將自誘導培養(yǎng)基和雙溫度調(diào)控方式成功應(yīng)用于普魯蘭酶基因工程菌的培養(yǎng)和酶蛋白表達，與傳統(tǒng)的LB培養(yǎng)基和IPTG誘導方法相比，胞外重組普魯蘭酶的發(fā)酵酶活從 11 U/mL 提升到 70 U/mL。
發(fā)明內(nèi)容
( I)要解決的技術(shù)問題
本發(fā)明的目的是提供一種應(yīng)用自誘導培養(yǎng)基和雙溫度調(diào)控策略生產(chǎn)胞外普魯蘭酶的方法。本發(fā)明目的不僅僅在于通過微生物菌株發(fā)酵生產(chǎn)胞外普魯蘭酶，而是將普魯蘭酶基因在大腸桿菌中重組表達，而且利用自誘導培養(yǎng)基和雙溫度調(diào)控方式進ー步提高重組大腸桿菌生產(chǎn)胞外普魯蘭酶的能力和產(chǎn)量，從而開發(fā)新型重組普魯蘭酶的生產(chǎn)エ藝和應(yīng)用價值。(2)技術(shù)方案
本發(fā)明首先將來源于黑座克雷伯氏菌(variicola) CCTCC NO M 2012108的普魯蘭酶基因在大腸桿菌中進行重組表達，在此基礎(chǔ)上，將自誘導培養(yǎng)基和雙溫度調(diào)控方式用于重組菌的培養(yǎng)和重組普魯蘭酶的發(fā)酵生產(chǎn)。一、普魯蘭酶基因的獲得
黑座克雷伯氏菌GWeZwieWa variicola ) CCTCC NO M 2012108培養(yǎng)基可溶性淀粉10 g/L，蛋白胨 15 g/L，酵母膏 5 g/L，KH2PO4 5 g/L，MgSO4 · 7H20 O. I g/L，NH4Cl 0. 5 g/L, FeSO4 · 7H20 0. I g/L, pH 6. 5。將黑座克雷伯氏菌(Z/e/wieBa variicola) CCTCC NO M 2012108菌種接種于培養(yǎng)基裝液量為10%的250 mL搖瓶中，于37°C、200 rpm振蕩培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束后，將菌體離心并用生理鹽水洗漆兩次，收集細胞利用基因組DNA提取試劑盒Genomic DNA ExtractionMiniprep System (VI0GENE 公司)提取基因組。合成引物I :5’_ CGG CTA GCA TGC TCA GAT ATA CCT GTC ATG G -3’，合成引物2 :5，_ CCG GAA TTC CGT TTA CTG CTC ACC GGC G -3’。引物 I 含有MeI 限制性酶切位點，引物2含有EcoRl限制性酶切位點。PCR 反應(yīng)體系ddH20 37 μ L，10 X Reaction Buffer 5 μ L,dNTP(25 mmol/L)0. 5yL，引物 I (50 pmol/μ L) I yL，引物 2 (50 pmol/μ L) I μ L，基因組 DNA 5 μ L，Taq DNA polymerase (5 U/μ L) 0. 5 μ L。PCR 反應(yīng)過程94°C 預(yù)變性 5 min ；98°C 10 s，55°C I min，72°C 4 min，進行 30個循環(huán)；72°C延伸10 min。利用3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit(上海申能博彩生物科技有限公司)純化DNA片斷。DNA溶液中加入1/10體積的こ酸鈉溶液(3 mol/L, pH 5. 2)和2倍體積無水こ醇，-20°C沉淀I小時。12000 rpm于4°C離心30 min。加入75%こ醇500 μ L洗滌，12000
rpm于4°C離心30 min，無菌操作臺吹干后溶于適量TE緩沖液中，立即使用或_20°C保存。ニ、含有普魯蘭酶基因的重組大腸桿菌的構(gòu)建 目的基因及質(zhì)粒pET28a(+)的酶切
利用質(zhì)粒提取試劑盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit (北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司)提取質(zhì)粒pET28a(+)。按照水、緩沖液、PCR產(chǎn)物或質(zhì)粒DNA、酶的順序加到Eppendorf管中，蓋好管蓋，振蕩使液體充分混勻，置于離心機內(nèi)離心2 s使液體集中于管底，37°C水浴3 h，在管中加入1/10的Loading Buffer或?qū)⒐苤糜?5°C保溫10 min，終止酶切反應(yīng)。酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析并切膠回收目的片段，濃縮。反應(yīng)體系組成10XHBuffer 4 μ L, DNA 10 μ L，NheI 2 μ L，EcoRI 2 μ L,ddH20將體系補足40 μし目的基因與質(zhì)粒pET28a(+)的連接
將外源基因與質(zhì)粒pET28a(+)連接，反應(yīng)體系組成如下質(zhì)粒pET28a(+) 0.8 yL，外源基因4. 2 μ L，Ligation Solution 5 μ L，ddH20將體系補足10 μし混合連接液，將其置于16°C培養(yǎng)箱中連接12 h。利用限制性內(nèi)切酶NheI和EcoRI對擴增得到的CCTCC NO M 2012108普魯蘭酶編碼基因與載體pET28a(+)進行雙酶切處理，處理后DNA片斷通過粘性末端連接獲得帶有目的基因片斷的重組質(zhì)粒pET28a(+)-pul A ；
重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌
在100 μ L大腸桿菌^: cWi BL21(DE3)感受態(tài)細胞懸液中加入10 μ L連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰浴中靜置30 min。轉(zhuǎn)入42°C水浴中，熱擊90 S?？焖俎D(zhuǎn)移至冰浴中，冷卻2min。加入700 μ L LB液體培養(yǎng)基，37°C 100 rpm搖床溫育培養(yǎng)I h。培養(yǎng)后菌液3000rpm離心2 min,棄上清600 μ L，剩余菌液混勻后涂布到含有50 μ g/mL卡那霉素的LB平板上，37°C倒置培養(yǎng)。獲得含有目的普魯蘭酶基因的重組大腸桿菌萬.coli BL21 (DE3)/pET28a (+)-pul A。
誘導表達培養(yǎng)
LB培養(yǎng)基胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L, NaCl 10 g/L, pH7. O。需要時使用前加入卡那霉素(50 μ g/mL),固體培養(yǎng)基添加I. 5%瓊脂粉。挑取陽性克隆單菌落接種于3 mL含50 μ g/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C, 200 rpm振蕩培養(yǎng)過夜。取I mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于50 mL含50 μ g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37で、200 rpm振蕩培養(yǎng)至OD6tltl約為O. 6。向培養(yǎng)物中加入誘導物IPTG至終濃度(Tl mmol/L，在培養(yǎng)溫度3(T37°C下進行誘導培養(yǎng)12小時。培養(yǎng)結(jié)束后，將發(fā)酵液于10000 rpm離心10分鐘后得發(fā)酵上清用于菌株胞外酶活的測定。利用LB培養(yǎng)基和IPTG誘導方式，獲得胞外重組普魯蘭酶活力為11 U/mL。普魯蘭酶測定方法
取100 μ L用100 mM、pH 5. O的醋酸緩沖適當稀釋的酶液與等體積的溶于100 mM、pH5. O醋酸緩沖中的10 g/L普魯蘭相混合于50で水浴中保溫30分鐘。加入DNS試劑300μ L搖勻，置于沸水中煮沸15分鐘，取出以流動流動水迅速冷卻后，于540 nm波長處，以O(shè). 5cm比色杯,測定反應(yīng)液的吸光度值。酶活單位定義在上述指定的條件下，每分鐘催化分解普魯蘭多糖生成相當于Iμ mo I葡萄糖的還原糖所需的醒為I個酶活単位(U)。三、重組大腸桿菌的自誘導培養(yǎng)和雙溫度調(diào)控發(fā)酵產(chǎn)酶
自誘導培養(yǎng)基α-乳糖10 -20g /L，葡萄糖0.5-1 g /L，甘油5 g /L，KH2PO4 6.8g /L, MgSO4 O. 24 g/L，蛋白胨 10 g /L，Na2HPO4 · 12H20 17. 9 g/L，Na2SO4 O. 71 g/L，NH4Cl2.67 g/L,痕量元素溶液200 yL/L,用超純水配置。痕量元素溶液
50 μ M FeCl3, 20 μ M CaCl2 · 2Η20,10 μ M MnCl2 · 4Η20,10 μ M ZnSO4 · 7Η20, 2 μ MCoCl2 · 6Η20, 2 μ M CuCl2, 2 μ M NiCl2, 2 μ M Na2Mo7O24, 2 μ M Na2SeO3, 2 μ M H3B4O7,用超純水配置。將重組大腸桿菌^:coli BL21 (DE3) / pET28a (+)-pul A 于含有 50 μ g/mL 卡那霉素的LB固體培養(yǎng)上過夜活化培養(yǎng)，從固體平板上挑取單個菌落接種于3 mL含有50 μ g/mL卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中于37°C，200 rpm振蕩培養(yǎng)，隨時監(jiān)測培養(yǎng)基中0D_的變化情況。待OD6tltl達到2 3吋，按5% 10%接種量接種于50 mL含50 μ g/mL卡那霉素的自誘導培養(yǎng)基中。將接種之后的自誘導培養(yǎng)基于37°C，200 rpm培養(yǎng)2 4小時后，將培養(yǎng)的溫度降低到25°C繼續(xù)培養(yǎng)48 72小吋。培養(yǎng)結(jié)束后，10000 rpm離心去除菌體，收集發(fā)酵上清液為普魯蘭酶的粗酶液。自誘導培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件的優(yōu)化
分別考察了碳源、氮源及培養(yǎng)基添加物對工程菌^: coli BL21/pET28a(+)-pulA生 長及分泌重組普魯蘭酶的影響，最終確定了發(fā)酵生產(chǎn)胞外普魯蘭酶的優(yōu)化自誘導培養(yǎng)基組成
α-乳糖 20 g/L，葡萄糖 I g/L，甘油 5 g/L, KH2PO4 6.8 g/L, MgSO4 O. 24 g/L，蛋白胨，10 g/L, Na2HPO4 · 12H20 17. 9g/L, Na2SO4 0. 71 g/L, NH4Cl 2. 67 g/L, Tween-80 9 g/L,痕量元素溶液200 μ L/Lo分別考察了起始pH、裝液量、溫度、培養(yǎng)時間對胞外酶活的影響，最終確定了工程菌^: coli BL21/pET28a(+)-pulA產(chǎn)酶的培養(yǎng)條件為起始ρΗ5· O，裝液量10% 20%，培養(yǎng)溫度為37°C先培養(yǎng)4小時后，再轉(zhuǎn)入25°C培養(yǎng)56小吋。采用優(yōu)化自誘導培養(yǎng)基和雙溫度發(fā)酵條件后，胞外普魯蘭酶酶活可以達到6(Γ70U/mL ο(3)有益效果
成功克隆了黑座克雷伯氏菌variicola ) CCTCC NO M 2012108普魯蘭酶編碼基因，該基因全長3309 bp，編碼1102個氨基酸殘基，其基因的核苷酸序列為SEQ IDNO :1，其氨基酸組成為SEQ ID NO :2。將黑座克雷伯氏菌(Z/e/wieBa variicola) CCTCC NO M 2012108普魯蘭酶編碼基因插入表達載體pET28a(+)中并轉(zhuǎn)化入相應(yīng)表達宿主萬.coli BL21(DE3)中成功構(gòu)建帶有目的基因的重組菌株^: coli BL21 (DE3) / pET28a (+)-pul A。將自誘導培養(yǎng)基和雙溫度調(diào)控方式用于重組大腸桿菌^: coli BL21 (DE3)/pET28a(+)-pul A的培養(yǎng)和普魯蘭酶的發(fā)酵產(chǎn)酶，優(yōu)化自誘導培養(yǎng)基和雙溫度發(fā)酵條件后，胞外普魯蘭酶酶活可以達到6(T70 U/mL。這些工作為重組大腸桿菌生產(chǎn)胞外普魯蘭酶的能カ和產(chǎn)量的提高提供了有效策略，對于今后開發(fā)新型重組普魯蘭酶的生產(chǎn)エ藝和應(yīng)用價值具有重要意義。生物材料樣品保藏黑座克雷伯氏菌(J1 ebsi ella vari I cola ) SHN-1 ;保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡寫CCTCCJii :中國武漢武漢大學，保藏編號CCTCC NO M2012108，保藏日期為2012年4月11日。
具體實施例方式實施例I
自誘導培養(yǎng)基α-乳糖10 g/L，葡萄糖0.5 g/L，甘油5 g/L, KH2PO4 6.8 g/L, MgSO4O. 24 g/L，蛋白胨 10 g/L，Na2HPO4 · 12H20 17. 9 g/L，Na2SO4 0. 71 g/L，NH4Cl 2. 67 g/L，痕量元素溶液200 μ L/Lo將重組大腸桿菌^: coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-pul A的菌種劃線于含有50μ g/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。從平板上挑取單個菌落接種于裝有50 mL LB培養(yǎng)基(50 μ g/mL卡那霉素)的250 mL三角瓶中，置于37°C、200 rpm搖床中震蕩培養(yǎng)，至0D_達到2. (Γ3. O左右。將此種子培養(yǎng)液以5%的接種量接種于裝有50mL上述自誘導培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于37°C培養(yǎng)60小時(此時OD6tltl達到15左右)，結(jié)束發(fā)酵。
通過此重組菌培養(yǎng)和發(fā)酵產(chǎn)酶エ藝，發(fā)酵上清中胞外普魯蘭酶的酶活達到15 U/mL。實施例2
自誘導培養(yǎng)基α-乳糖20 g/L，葡萄糖I g/L，甘油5 g/L, KH2PO4 6.8 g/L, MgSO4O. 24 g/L，蛋白胨 10 g/L，Na2HPO4 · 12H20 17. 9 g/L，Na2SO4 0. 71 g/L，NH4Cl 2. 67 g/L，痕量元素溶液200 μ L/Lo將重組大腸桿菌^: coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-pul A的菌種劃線于含有50μ g/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。從平板上挑取單個菌落接種于裝有50 mL LB培養(yǎng)基(50 μ g/mL卡那霉素)的250 mL三角瓶中，置于37°C、200 rpm搖床中震蕩培養(yǎng)，至OD_達到2. (Γ3. O左右。將此種子培養(yǎng)液以5%的接種量接種于裝有50mL上述自誘導培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于25°C培養(yǎng)60小時(此時OD_達到15左右)，結(jié)束發(fā)酵。通過此重組菌培養(yǎng)和發(fā)酵產(chǎn)酶エ藝，發(fā)酵上清中胞外普魯蘭酶的酶活達到35 U/mL。實施例3
自誘導培養(yǎng)基α-乳糖20 g/L，葡萄糖I g/L，甘油5 g/L, KH2PO4 6.8 g/L, MgSO4O. 24 g/L，蛋白胨 10 g/L，Na2HPO4 · 12H20 17. 9 g/L，Na2SO4 0. 71 g/L，NH4Cl 2. 67 g/L，痕量元素溶液200 μ L/Lo將重組大腸桿菌^: coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-pul A的菌種劃線于含有50μ g/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。從平板上挑取單個菌落接種于裝有50mL LB培養(yǎng)基(50 μ g/mL卡那霉素)的250 mL三角瓶中，置于37°C、200 rpm搖床中震蕩培養(yǎng)，至0D_達到2. (Γ3. O左右。將此種子培養(yǎng)液以5%的接種量接種于裝有50 mL上述自誘導培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，先于37°C、200 rpm搖床中培養(yǎng)4小時后，再將搖床的溫度調(diào)低到25°C繼續(xù)培養(yǎng)56小時(此時OD6tltl達到15左右)，結(jié)束發(fā)酵。通過此重組菌培養(yǎng)和發(fā)酵產(chǎn)酶エ藝，發(fā)酵上清中胞外普魯蘭酶的酶活達到50 U/mL。實施例4
自誘導培養(yǎng)基α-乳糖20 g/L，葡萄糖I g/L，甘油5 g/L, KH2PO4 6.8 g/L, MgSO4
O.24 g/L，蛋白胨 10 g/L, Na2HPO4 · 12H20 17. 9 g/L, Na2SO4 0. 71 g/L, NH4Cl 2. 67 g/L,Tween-80 9 g/L,痕量元素溶液 200 μ L/L。將重組大腸桿菌^: coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-pul A的菌種劃線于含有50μ g/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。從平板上挑取單個菌落接種于裝有50 mL LB培養(yǎng)基(50 μ g/ml卡那霉素)的250 mL三角瓶中，置于37°C、200 rpm搖床中震蕩培養(yǎng)，至0D_達到2. (Γ3. O左右。將此種子培養(yǎng)液以5%的接種量接種于裝有25 mL上述自誘導培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，先于37°C、200 rpm搖床中培養(yǎng)4小時后，再將搖床的溫度調(diào)低到25°C繼續(xù)培養(yǎng)56小時(此時OD6tltl達到15左右)，結(jié)束發(fā)酵。通過此重組菌培養(yǎng)和發(fā)酵產(chǎn)酶エ藝，發(fā)酵上清中胞外普魯蘭酶的酶活達到70 U/mL。
權(quán)利要求
1.一種應(yīng)用自誘導培養(yǎng)基和雙溫度調(diào)控策略生產(chǎn)胞外普魯蘭酶的方法，其特征在于將重組大腸桿菌萬.COli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-pul A接種于自誘導培養(yǎng)基中，并采用雙溫度調(diào)控方式，即將接種之后的自誘導培養(yǎng)基于37°C、200 rpm培養(yǎng)2 4小時后，將培養(yǎng)的溫度降低到25°C繼續(xù)培養(yǎng)48 72小吋，培養(yǎng)結(jié)束后，收集發(fā)酵上清液獲得胞外普魯蘭酶；步驟為 (I)將來源于黑座克雷伯氏菌OWe/wieBa variicola) CCTCC NO M 2012108的普魯蘭酶基因在大腸桿菌中進行重組表達 a、普魯蘭酶基因的獲得 CCTCC NO M 2012108培養(yǎng)基可溶性淀粉10 g/L，蛋白胨15 g/L，酵母膏5 g/L，KH2PO4 5 g/L, MgSO4 · 7H20 O. I g/L, NH4Cl 0. 5 g/L, FeSO4 · 7H20 0. I g/L，用超純水配制，pH 6. 5 ； CCTCC NO M 2012108菌種接種于培養(yǎng)基裝液量為10%的250 mL搖瓶中，于37°C、·200 rpm振蕩培養(yǎng)72 h ;培養(yǎng)結(jié)束后，將菌體離心并用生理鹽水洗滌兩次，收集細胞利用VI0GENE 公司的基因組DNA提取試劑盒Genomic DNA Extraction Miniprep System提取基因組DNA ； 黑座克雷伯氏菌OWeAsieWa variicolaXClCC NO M 2012108普魯蘭酶，其基因的核苷酸序列為SEQ ID NO :1，其氨基酸組成為SEQ ID NO 2 ； 合成引物 I :5’_ CGG CTA GCA TGC TCA GAT ATA CCT GTC ATG G -3’，引物 I 含有 MeI限制性酶切位點； 合成引物 2:5’- CCG GAA TTC CGT TTA CTG CTC ACC GGC G -3’，引物 2 含有^bo/PI限制性酶切位點； PCR 反應(yīng)體系ddH20 37 μ L，10 X Reaction Buffer 5 μ L,25 mmol/L 的 dNTP 0.5μ L,50 ρ θ1/μΙ^|_1:1 μ L, 50 pmol/yL 引物 2:1 μ L，基因組DNA 5 μ L, 5 U/ μ L ^Taq DNA polymerase 0. 5 μ L ； PCR 反應(yīng)過程94°C 預(yù)變性 5 min ；98°C 10 s，55°C I min,72°C 4 min，進行 30 個循環(huán)；72°C延伸 10 min ； 利用上海申能博彩生物科技有限公司的3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit純化DNA片斷 DNA溶液中加入1/10體積的3 mol/L、pH 5. 2的こ酸鈉溶液和2倍體積無水こ醇，-20°C沉淀I小時；于4°C、12000 rpm離心30 min ;加入75%こ醇500 “し洗滌，于4で、·12000 rpm離心30 min，無菌操作臺吹干后溶于適量TE緩沖液中，立即使用或-20°C保存； b、含有普魯蘭酶基因的重組大腸桿菌的構(gòu)建 將CCTCC NO M 2012108普魯蘭酶編碼基因與質(zhì)粒pET28a(+)連接，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌萬.coB BL21(DE3)感受態(tài)細胞，通過含有50 μ g/mL卡那霉素的LB平板篩選獲得含有目的普魯蘭酶基因的重組大腸桿菌萬.coli BL21 (DE3) / pET28a (+)-pul A ;步驟為: 目的基因及質(zhì)粒pET28a(+)的酶切 利用質(zhì)粒提取試劑盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit,北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司提供，提取質(zhì)粒pET28a(+)； 按照水、緩沖液、PCR產(chǎn)物或質(zhì)粒DNA、酶的順序加到Eppendorf管中，蓋好管蓋，振蕩使液體充分混勻，置于離心機內(nèi)離心2 s使液體集中于管底，37°C水浴3 h，在管中加入1/10的Loading Buffer或?qū)⒐苤糜?5°C保溫10 min，終止酶切反應(yīng)；酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析并切膠回收目的片段，濃縮；反應(yīng)體系組成10 X H Buffer 4 μ L,DNA 10 μ L,Nhel 2 μ L, EcoRl 2 μ L，ddH20 將體系補足40 μ L ; 目的基因與質(zhì)粒pET28a(+)的連接 將CCTCC NO M 2012108普魯蘭酶編碼基因與質(zhì)粒pET28a(+)連接，反應(yīng)體系組成如下質(zhì)粒 pET28a(+) O. 8 μ L,外源基因 4. 2 μ L, Ligation Solution 5 μ L ;混合連接液，將其置于16°C培養(yǎng)箱中連接12 h ； 利用限制性內(nèi)切酶NheI和EcoRI對擴增得到的CCTCC NO M 2012108普魯蘭酶編碼基因與載體pET28a(+)進行雙酶切處理，處理后DNA片斷通過粘性末端連接獲得帶有目的基因片斷的重組質(zhì)粒pET28a(+)-pul A ； 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌 在100 μ L大腸桿菌^: cWi BL21(DE3)感受態(tài)細胞懸液中加入10 μ L連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰浴中靜置30 min ;轉(zhuǎn)入42°C水浴中，熱擊90 s ;快速轉(zhuǎn)移至冰浴中，冷卻2min;加入700 μ L LB液體培養(yǎng)基，37°C 100 rpm搖床溫育培養(yǎng)I h;培養(yǎng)后菌液3000 rpm離心2 min，棄上清600 μ L，剩余菌液混勻后涂布到含有50 μ g/mL卡那霉素的LB平板上，37°C倒置培養(yǎng)；獲得含有目的普魯蘭酶基因的重組大腸桿菌萬.coli BL21 (DE3)/pET28a(+)-pul A ； (2)重組大腸桿菌的自誘導培養(yǎng)和雙溫度調(diào)控發(fā)酵產(chǎn)酶 自誘導培養(yǎng)基α-乳糖10-20 g /L，葡萄糖0.5-1 g /L，甘油5 g /L，KH2PO4 6.8g /L, MgSO4 O. 24 g/L，蛋白胨 10 g /L，Na2HPO4 · 12H20 17. 9 g/L，Na2SO4 O. 71 g/L，NH4Cl2.67 g/L，痕量元素溶液200 yL/L，用超純水配制；痕量元素溶液含 50 μ M FeCl3, 20 μ M CaCl2 · 2H20，10 μ M MnCl2 · 4Η20，10 μ MZnSO4 · 7Η20,2 μ M CoCl2 · 6Η20，2 μ M CuCl2, 2 μ M NiCl2, 2 μ M Na2Mo7O24, 2 μ M Na2SeO3和2 μΜ H3B4O7，用超純水配制； 產(chǎn)酶的培養(yǎng)條件為將重組大腸桿菌^: coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-pul A于含有50 μ g/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上過夜活化培養(yǎng)，從固體平板上挑取單個菌落接種于3 mL含有50 μ g/mL卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中于37°C、200 rpm振蕩培養(yǎng)，隨時監(jiān)測培養(yǎng)基中OD6tltl的變化情況，待OD6tltl達到2 3吋，按5% 10%接種量接種于50 mL含50 μ g/mL卡那霉素的自誘導培養(yǎng)基中，將接種之后的自誘導培養(yǎng)基于37で、200 rpm培養(yǎng)2 4小時后，將培養(yǎng)的溫度降低到25°C繼續(xù)培養(yǎng)48 72小時，培養(yǎng)結(jié)束后，10000 rpm離心去除菌體，收集發(fā)酵上清液為普魯蘭酶的粗酶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述應(yīng)用自誘導培養(yǎng)基和雙溫度調(diào)控策略生產(chǎn)胞外普魯蘭酶的方法，其特征在于發(fā)酵生產(chǎn)胞外普魯蘭酶的優(yōu)化自誘導培養(yǎng)基組成為 α-乳糖 20 g/L，葡萄糖 I g/L，甘油 5 g/L, KH2PO4 6.8 g/L, MgSO4 O. 24 g/L，蛋白胨 10 g/L, Na2HPO4 · 12H20 17. 9g/L, Na2SO4 0. 71 g/L, NH4Cl 2. 67 g/L, Tween-80 9 g/L,痕量元素溶液200 yL/L，用超純水配制； 工程菌^: coli BL21/pET28a(+)-pulA產(chǎn)酶的優(yōu)化培養(yǎng)條件為起始ρΗ5· 0 8· 0，裝液量10% 20%，培養(yǎng)溫度為37°C、200 rpm先培養(yǎng)4小時后，再轉(zhuǎn)入25°C培養(yǎng)56小時； 采用優(yōu)化自誘導培養(yǎng)基和雙溫度發(fā)酵條件后，胞外普魯蘭酶酶活達到6(T70 U/mL。
全文摘要
一種應(yīng)用自誘導培養(yǎng)基和雙溫度調(diào)控策略生產(chǎn)胞外普魯蘭酶的方法，屬于微生物發(fā)酵生產(chǎn)普魯蘭酶的技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明將黑座克雷伯氏菌(Klebsiellavariicola)CCTCC NOM2012108普魯蘭酶編碼基因插入表達載體pET28a(+)中構(gòu)建重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得含有目的普魯蘭酶基因的重組菌株E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)-pulA。利用自誘導培養(yǎng)基，并采用先37℃培養(yǎng)2~4小時后25℃繼續(xù)培養(yǎng)48~72小時的雙溫度調(diào)控方式，將重組大腸桿菌E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)-pulA進行培養(yǎng)和發(fā)酵產(chǎn)酶。采用優(yōu)化后的自誘導培養(yǎng)基和雙溫度發(fā)酵條件后，胞外普魯蘭酶酶活可以達到60~70U/mL。本發(fā)明為重組大腸桿菌生產(chǎn)胞外普魯蘭酶提供了有效策略，對于今后開發(fā)新型重組普魯蘭酶的生產(chǎn)工藝和應(yīng)用價值具有重要意義。
文檔編號C12N15/56GK102676480SQ20121018706
公開日2012年9月19日 申請日期2012年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月8日
發(fā)明者徐巖, 聶堯, 陳文波 申請人:江南大學