專利名稱：痢疾志賀氏菌的n-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶及編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶及其編碼基因與應(yīng)用，特別涉及來源于痢疾志賀氏菌的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶及其基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
唾液酸(Sialic acid)是一類神經(jīng)氨酸的衍生物，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的天然的唾液酸衍生物達40多種。其中最主要的是N-乙酰神經(jīng)氨酸(N-acetyl-D-neuraminicacid, Neu5Ac)。Neu5Ac通常位于細胞表面糖蛋白和糖脂的糖鏈非還原末端,在許多與糖和蛋白相互作用有關(guān)的生理過程中起著很重要的作用如細胞的粘附、信號傳遞、糖蛋白的穩(wěn)定性、細菌致病性、病毒侵染、炎癥和腫瘤的轉(zhuǎn)移等。N-乙酰神經(jīng)氨酸的生物學(xué)功能多樣化，在治療流感、神經(jīng)性疾病、炎癥和腫瘤等方面具有重要的醫(yī)藥價值，特別是在流感(包括禽流感H5N1和2009年的H1N1)的預(yù)防和治療方面有良好的效果。同時，N-乙酰神經(jīng)氨酸可促進神經(jīng)突觸的發(fā)育，對嬰幼兒腦部發(fā)育非常重要，因此也被用于嬰幼兒奶粉添加劑。無論是藥用前景還是作為食品添加劑，N-乙酰神經(jīng)氨酸都具有較高的市場價值。N-乙酰神經(jīng)氨酸可從以下幾種途徑獲得天然產(chǎn)物提取、化學(xué)合成、化學(xué)酶法、酶法合成等。N-乙酰神經(jīng)氨酸可從燕窩、牛奶或者禽蛋中提取，但由于量太少，提取純化難，產(chǎn)量低(10-20%)，純度低?；瘜W(xué)合成法合成N-乙酰神經(jīng)氨酸，由于產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，需要繁多的保護和去保護步驟。使用化學(xué)法合成N-乙酰神經(jīng)氨酸反應(yīng)條件苛刻，需要銦等一些貴重金屬作為催化劑，N-乙酰神經(jīng)氨酸得率低。因此，化學(xué)法常常和酶法結(jié)合使用。N-乙酰神經(jīng)氨酸可通過酶法合成，N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)和丙酮酸在N-乙酸神經(jīng)氨酸醒縮酶(Neu5Ac aldolase or Neu5Ac lyase, NanA, EC4.1. 3· 3)作用下生成N-乙酰神經(jīng)氨酸。但ManNAc對于工業(yè)生產(chǎn)而言成本較高?；瘜W(xué)酶法是一種更經(jīng)濟有效的生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的方法，即在堿性條件下，使N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)異構(gòu)化生成ManNAc ;然后米用N-乙酰神經(jīng)氨酸醒縮酶催化N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸生成N-乙酰神經(jīng)氨酸?；蛴秒p酶法合成即用GlcNAc 2-異構(gòu)酶(GlcNAc2_epimerase, AGE, EC5.1. 3. 8)催化GlcNAc異構(gòu)成ManNAc，然后ManNAc和丙酮酸在N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的作用下縮合產(chǎn)生 Neu5Ac。在工業(yè)生產(chǎn)中多以GlcNAc為原料生產(chǎn)Neu5Ac，不論是采用化學(xué)酶法還是雙酶法，都需要N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶。雖然N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶在高等動物及一些微生物中有存在，但是生物體中其含量極微，難以分離得到足夠量的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶。因此如何獲得性質(zhì)優(yōu)良的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶對N-乙酰神經(jīng)氨酸的生產(chǎn)非常重要。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶。
本發(fā)明所提供的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶，名稱為SdNanA，來源于痢疾志賀氏菌(Shigella dysenteriae),是如下 a)或 b)的蛋白質(zhì)a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶活性的由a)衍生的蛋白質(zhì)。其中，序列表中序列2由297個氨基酸殘基組成。為了使上述(a)中的蛋白便于純化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表I所示的標(biāo)簽。表I標(biāo)簽的序列
權(quán)利要求
1.一種蛋白，是如下a)或b)的蛋白質(zhì) a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶活性的由a)衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白的核酸分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核酸分子，其特征在于所述核酸分子為如下I)或2)或3)所不的基因 1)其編碼序列是序列表中序列I的第1-894位核苷酸的DNA分子； 2)在嚴格條件下與I)限定的DNA分子雜交且編碼權(quán)利要求1所述蛋白的DNA分子； 3)與I)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同源性且編碼權(quán)利要求1所述蛋白的DNA分子。
4.下述I)-4)中的任一種生物材料 1)含有權(quán)利要求3所述核酸分子的表達盒； 2)含有權(quán)利要求3所述核酸分子的重組表達載體； 3)含有權(quán)利要求2或3所述核酸分子的重組微生物； 4)含有權(quán)利要求2或3所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因細胞系。
5.制備權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的方法，包括將權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)的編碼基因在生物細胞中進行表達得到權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的步驟；所述生物細胞為微生物細胞、植物細胞或非人動物細胞。
6.制備表達權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的重組微生物的方法，包括將權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)的編碼基因?qū)胨拗魑⑸锛毎?，得到表達權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的重組微生物的步驟。
7.權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)在作為N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)、權(quán)利要求2或3所述的核酸分子或權(quán)利要求4所述的生物材料在制備N-乙酰神經(jīng)氨酸中的應(yīng)用。
9.擴增權(quán)利要求2或3所述核酸分子全長或其任一片段的引物對。
全文摘要
本發(fā)明公開了N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶是如下a)或b)的蛋白質(zhì)a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶活性的由a)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明獲得了一個編碼N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的新基因SdNanA。將SdNanA基因克隆到原核表達載體6HisT-pRSET質(zhì)粒上，在大腸桿菌中進行N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶蛋白(SdNanA)的高效表達。本發(fā)明所獲得的重組N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶蛋白可以催化N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸生成N-乙酰神經(jīng)氨酸，具有較高的酶活性，具有較高的應(yīng)用前景及開發(fā)價值。
文檔編號C12R1/01GK103060302SQ20121018702
公開日2013年4月24日 申請日期2012年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月20日
發(fā)明者林白雪, 張子娟, 陶勇 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所, 中科鴻基生物科技有限公司