專利名稱：利用aflp指紋技術鑒定中國對蝦種群的方法
技術領域：
本發明屬于水產生物種群鑒定分子檢測技術領域，具體涉及ー種利用AFLP指紋技術鑒定中國對蝦種群方法。
背景技術：
AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism,擴增長度多態性)是在 RFLP和RAPD技術的基礎上發明的一種新的DNA分子標記技木。其基本原理是先利用限制性內切酶將基因組DNA酶切，產生不同大小的DNA片段后，將其用雙鏈人工接頭相連接，再以人工接頭的互補鏈為引物進行預擴增，選擇性擴增所用引物是在接頭互補鏈的基礎上添加1-3個選擇性核苷酸，對預擴增模板DNA進行選擇性擴增之后，根據擴增片段長度的不同，檢測選擇性擴增產物的多態性。AFLP分子標記技術自開始應用以來，發展十分迅速，近幾年已經 在海洋生物遺傳學研究以及在對海洋生物養殖群體和野生群體的種質資源評估等方面得到了廣泛的應用。同時，用AFLP方法得到的指紋圖譜具有穩定、可靠且多態性豐富等優點，非常適合于種群的鑒定。中國對奸(Fenneropenaeus chinensis)是我國黃、渤海的主要經濟奸類。由于中國對蝦野生資源的急劇減少，從1986年開始，我國毎年在渤海、黃海北部和山東半島南部進行人工培育苗種的放流，年放流規模達10億尾以上。但由于中國對蝦的長距離洄游習性，不同地點放流的個體會在越冬場形成混合種群。因此，明確混合種群中中國對蝦來源對于漁業資源的管理與保護十分重要。但目前還沒有一種有效的鑒定中國對蝦種群歸屬的分子鑒定方法。
發明內容
本發明的目的是提供ー種利用AFLP指紋技術鑒定中國對蝦種群方法，從而彌補現有技術的不足。本發明的ー個方面是提供一個用于鑒定中國對蝦種群的引物組，包括有四對引物，每對引物的正向引物、反向引物的序列分別為SEQ ID NO :1和SEQID NO :2、SEQ ID NO:
I和 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4 和 SEQ ID NO :5、SEQ ID NO 6 和 SEQ ID NO :7。本發明的引物組用于對中國對蝦種群進行遺傳鑒定，包括有如下的步驟I)樣品基因組DNA的提取；2)酶切反應；用EcoR I和Mse I對I)中的DNA進行酶切3)連接反應將2)中獲得的酶切產物連接上EcoR I接頭和Mse I接頭；4)預擴增反應用EcoR I preprimer和Mse I preprimer對3)中獲得的連接產物進行預擴增；5)選擇性擴增將預擴增產物稀釋后，分別用SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2、SEQID NO :1 和 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4 和 SEQ ID NO :5、SEQ IDNO :6 和 SEQ ID NO :7 的引物對進行擴增；且序列為SEQ ID NO :1、SEQ IDNO :4、SEQ ID NO 6的引物的5'用FAM熒光標記；
6)結果分析將步驟5)的擴增產物用ABI3730條帶分型，讀取結果后進行種群分析。上述的EcoR I preprimer 和 Mse I preprimer 的核苷酸序列分別為 SEQ ID NO:8、SEQ ID NO 9o通過本發明篩選出的引物組合，可以確定自然海域中國對蝦種群的來源和歸屬地，有利于界定不同產卵場對中國對蝦種群的貢獻值。中國對蝦在中日韓共享海域中分布廣泛，根據本發明篩選的引物組合能夠確定來源于不同產卵水域對共管水域資源的貢獻， 界定資源歸屬比例和應獲捕撈配額，對于維護我國海洋權益和保護我國漁業資源具有重要意義。
具體實施例方式本發明實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常可按常規條件，如J.薩姆布魯克(Sambrook)等編寫的《分子克隆實驗指南》中所述的條件來進行操作。申請人:在長期的研究中，通過對不同種群的AFLP分析，篩選到了可以有效的對中國對蝦種群進行鑒定的引物對組合，利用本發明的引物組對中國對蝦種群進行鑒定，步驟如下I、基因組DNA提取提取中國對蝦的全基因組DNA，保存于_20°C備用。2、酶切反應酶切反應體系共20μ L :基因組 DNA 約 100ng、0. 1μ L Trul I (lOu/μΙ)、O. I μ LEcoR I (lOu/μ I)以及 4· Ομ L 10XY+/Tango buffer，加超純水至 20 μ L，于恒溫設備中65°C酶切，時間不少于6h。酶切反應結束后，將反應產物置于75°C中加熱15min，使酶失活，4°C保存備用。3、連接反應連接反應體系共IOyL:酶切反應產物5 μ L、ly L的Solution I,O. IyL EcoRIadapter(序列見表 I)、0· I μ L Mse I adapter(序列見表 I)以及 O. I μ L SolutionII (IOu/μ U，加超純水至10 μ L,室溫下反應時間不少于8h,于4°C保存備用。4、預擴增反應預擴增反應體系共20yL:連接產物 lyL、2yL10XPCR buffer、2yL dNTP、O. 05 μ L 的 EcoR I preprimer (序列見表 I)、0· 05 μ L 的 Mse I preprimer (序列見表 I)以及O. 15 μ LTaq DNA聚合酶。預擴增PCR 反應條件94°C 2min，20 個循環(94°C 30s—56°C 60s—72°C 60s)，4°C下保溫。擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。預擴增產物用超純水稀釋10倍，置4°C下保存備用。5、選擇性擴增反應在避光條件下，選擇性擴增體系20 μ L :5 μ L預擴增稀釋混合液、2 μ LIOXPCRbuffer plus Mg2\2y L dNTP,O. 05 μ L EcoR I 引物(5，端添加 FAM 熒光標記)(序列見表1)、0. 05yLMse I引物(序列見表I)，O. 15 μ LTaq DNA聚合酶，加超純水至總體積為
20 μし
PCR 反應條件先 94 V 2min,再 94 V 30s,65 V 30s, (Touch down 至 56 °C ),72°C 60s, 10個循環后變為94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 60s, 26個循環。反應結束后用2%瓊脂糖電泳檢測選擇性擴增效果，并將產物濃度稀釋到Marker亮度的1/10。擴增反應產物4 °C保存備用。6、ABI373O 條帶分型將濃度調整后的選擴增產物轉移到96孔板中，按照每個反應中9 μ L稀釋產物、O. I μ L 內標(LIZ_500Size Standard, Applied Biosystems)及 O. 9 μ L Hidi 甲酸胺進行混合。后將上述混合物至于_20°C冰中冷卻5分鐘后，迅速轉移至95°C加熱，使混合物徹底變性。最后，將載有混合物的96孔板置于ABI3730測序儀中進行分型。7、運用Genemapper 4. O進行條帶讀取與分析。表I本發明引物序列信息
權利要求
1.用于鑒定中國對蝦種群的引物組，其特征在于，包括有四對引物，每對引物的正向引物、反向引物的序列分別為SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4 和 SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6 和 SEQ ID NO :7。
2.權利要求I所述的引物組的應用，是用于對中國對蝦種群進行遺傳鑒定。
3.如權利要求2所述的遺傳鑒定，包括有如下的步驟 1)樣品基因組DNA的提取； 2)酶切反應；用EcoRI和Mse I對I)中的DNA進行酶切 3)連接反應將2)中獲得的酶切產物連接上EcoRI接頭和Mse I接頭； 4)預擴增反應用EcoRI preprimer和Mse I preprimer對3)中獲得的連接產物進行預擴增； 5)選擇性擴增將預擴增產物稀釋后，分別用SEQID NO :1和SEQ ID NO :2、SEQ IDNO :1 和 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4 和 SEQ ID NO :5、SEQ IDNO 6 和 SEQ ID NO 7 的引物對進行擴增；且序列為SEQ ID NO :1、SEQ IDNO :4、SEQ ID NO 6的引物的5'用FAM熒光標記； 6)結果分析將步驟5)的擴增產物用ABI3730條帶分型，讀取結果后進行種群分析。
4.如權利要求3所述的遺傳鑒定,其特征在于,所述的EcoRI preprimer和Mse Ipreprimer 的核苷酸序列分別為 SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9。
全文摘要
本發明涉及一個用于鑒定中國對蝦種群的引物組，包括有四對引物，每對引物的正向引物、反向引物的序列分別為SEQ ID NO1和SEQ IDNO2、SEQ ID NO1和SEQ ID NO3、SEQ ID NO4和SEQ ID NO5、SEQ ID NO6和SEQ ID NO7。通過本發明篩選出的引物組合，可以確定自然海域中國對蝦種群的來源和歸屬地，有利于界定不同產卵場對中國對蝦種群的貢獻值。中國對蝦在中日韓共享海域中分布廣泛，根據本發明篩選的引物組合能夠確定來源于不同產卵水域對共管水域資源的貢獻，界定資源歸屬比例和應獲捕撈配額，對于維護我國海洋權益和保護我國漁業資源具有重要意義。
文檔編號C12Q1/68GK102676687SQ20121018662
公開日2012年9月19日 申請日期2012年6月8日 優先權日2012年6月8日
發明者張朝暉, 張輝, 李鵬飛, 高天翔 申請人:中國海洋大學